서
론
아토피성 피부염은 가장 흔하게 발생하는 소아기 만 성 피부질환으로 생후 몇 년 내에 발병한다. 최근 여러 역학연구 결과에 따르면, 지난 30년간에 걸쳐서 산업화 된 국가에서 아토피성 피부염 발병율이 증가함을 보이고 있다. 다른 알레르기 질환과 아토피성 피부염의 관련성 도 광범위하게 보고되었는데 아토피성 피부염의 조기발 생은 천식의 발생위험 증가와 관련이 되었으며 많은 연 구자들이 아토피성 피부염을 소위 ‘아토피행진’의 첫 번 째 임상발현으로 제시하였다 (Shultz and Hanifin 2002).한편 아토피성 피부염의 진행이나 발생에 영향을 미치는 요인에 대해서는 완전히 밝혀져 있지 않다. 아토피성 피 부염의 원인은 아마도 다인자성으로 유전적 요인과 환경 적 요인의 상호작용이 관여하는 것으로 여겨지고 있다. 장기간에 걸친 아토피성 피부염의 경과는 많은 연구에서 보고되었으나 진단적 평가의 차이로 위험인자의 상대적 중요성을 평가하는 것은 쉽지 않다. 아토피성 피부염에 대한 현재까지 알려진 치료방법은 스테로이드제 항히스타민제 도포나 복용 및 최근 개발 되고 있는 면역억제제가 사용되고 있으나 장기간 사용의 부작용이 문제점으로 대두되고 있다 (Furukawa et al. 2004). 일부 동양권에서는 두충, 상엽, 어성초 등 천연 약 용식물에서 추출한 몇몇 성분들을 이용하여 아토피성 피 부염을 치료하는데 사용되어 왔다. ─ ─ 299 ──
천연약용식물 추출혼합물의 세포독성평가
김용수∙권희정∙최보람∙임윤묵∙노영창* 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소Evaluation of Cell Cytotoxic Effect on Herbal Extracts Mixtures
Yong-Soo Kim, Hui-Jeong Gwon, Bo-Ram Choi, Youn-Mook Limand Young-Chang Nho*
Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea
Abstract -- Herbal extracts (HE) such as Houttuynia cordata Thunb., Eucommia ulimoides, Plantago asiatica var., Morus alba L., and Ulmus davidiana var., are known to suppress an atopic dermatitis like skin lesions. In this study, to evaluate the cell cytotoxicity effect on L929, HaCaT and HMC-1 cell by the HE, the herbs were extracted with distilled water (at 75��C) and then the HE mixtures were freeze-dried for 5 days and sterilized with γγ-rays. The cytotoxicity was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The result showed that the HE mixtures did not significantly affect cell viability and had no toxicity on the cells. These findings indicate that the HE mixtures can be used as a potential therapeutic agent.
Key words : Houttuynia cordata Thunb., Eucommia ulimoides, Plantago asiatica var., Morus alba L., Ulmus davidiana var. japonica
* Corresponding authors: Young-Chang Nho, Tel. +82-63-570-3060, Fax. +82-63-570-3079, E-mail. [email protected]
두충 (Eucommia ulimoides)은 두충나무과에 속하는 1 과 1속 1종의 낙엽교목으로서 높이 15 m, 지름 40 cm까 지 자란다. 원산지는 중국의 호북, 사천성 등지로 알려져 있으며 우리나라 중부이남 지역 어디에서나 잘 서식하 며 특히 계곡이나 산녹지대 또는 토질이 좋고 수분이 적 절한 곳에서 잘 자라며 약용가치가 높아 전국적으로 많 이 재배되고 있다. 두충 및 두충차의 약리활성에 관한 연구로는 활성산소종의 소거작용 (Hsieh et al. 2000) 및 항산화효과 (Yen et al. 2000)가 보고되고 있으며 콜라겐 합성을 촉진시키는 효과 (Li et al. 1998), 알파글루코시다 아제를 억제하는 기전에 의거한 항당뇨효과 (Watanabe et al. 1997), 암발생저해효과 (Nakamura et al. 1997), 항보 체효과 (Oshima et al. 1998) 등이 보고되고 있다.
상엽 (Morus alba L.)은 뽕나무과에 속한 뽕나무 (Morus alba L.) 및 동속 근연식물의 잎을 건조한 것으로 첫 서 리가 내린 후에 따서 불순물을 제거하고 보관한다. 잎을 펴 보면 난형 또는 넓은 난형으로 길이 8~15 cm, 너비 7~13 cm이다. 상엽은 본초강목 등의 동양의학서에 상백 피, 누에고치 등과 함께 소갈증에 효과가 있음이 기록되 어 있다. 상엽은 당뇨병에 효과가 있고 동물실험 결과 콜레스테롤을 낮추고 동맥경화증, 고지혈증 예방치료에 효과가 있다고 보고되어 있다 (Myo 1989). Lee 등은 상 엽수층의 메탄올가용분획이 정상 마우스에서 소장내 글 리코시다아제 활성을 억제하여 전분, 맥아당, 서당 부하 시 혈당 상승에 저해활성이 탁월함을 밝힌 바 있으며 (Lee et al. 1995), 서는 상엽에 대한 문헌적 연구를 통하 여 명칭, 기원, 성미, 귀경 및 효능에 대하여 수종의 본초 서를 비교, 고찰하였고 상엽이 고혈압 백서에 미치는 영 향을 실험적으로 규명하였다 (서 1994). 이밖에도 상엽은 마우스 유래의 전이성 대장암 세포주에서의 항암효과와 (Ahn et al. 2001) 면역조절 기능에도 효과가 있는 것으로 보고되었다.
어성초 (Houttuynia cordata Thunb.)는 삼백초과의 다년 생 초본으로 약모밀 (Houttuynia cordata Thunberg)로 불 리우며, 그늘지고 물기가 많은 곳에서 잘 자라며 주로 한 국과 중국, 일본, 히말라야, 북미 그리고 자바에 분포되어 있다. 어성초는 잎에서 특유의 비린내가 나기 때문에 붙 여진 이름으로 다양한 생리활성물질들은 함유하고 있어 해독 및 이뇨에 효과가 있으며, 백일해, 기관지염, 간염, 폐렴 등의 증상 완화에 효과가 있다고 알려져 있다. 특 히 어성초는 아토피, 항 알레르기 등 피부질환의 개선 목 적으로 많이 사용되어 왔으며, 최근에는 건강 보조식품 으로써 그 사용이 증가하고 있다 (Shin et al. 2006). 예로 부터 민간에서는 발효 엑기스를 암치료 등에 이용하여 왔으며, Seo 등이 어성초 핵산 추출물이 암세포주에 미 치는 항암효과에 대해 보고하였다 (Seo et al. 2003). 그외 에도 항돌연변이효과 (Choi et al. 1994), 항균효과 (Song et
al. 2003) 및 어성초 즙과 분말이 고지방, 고 콜레스테롤
혈증 쥐의 혈청지질 및 지질성분에 미치는 영향 (Sung et al. 1998) 등에 대한 보고가 다수 발표되었다.
느릅나무 (Ulmus davidiana var. japonica)는 이른 봄이 나 가을에 뿌리 껍질을 벗겨서 약으로 사용되어 왔다. 분 포지역으로는 우리나라를 비롯하여 일본, 사할린, 쿠릴열 도, 중국 북부 및 동시베리아 등이다. 한방에서는 껍질을 유피라는 약재로 사용되며, 치습, 이뇨 소종독의 처방에 사용되어 있다. 유피의 기원식물에는 크게 개느릅나무인 비술나무를 포함한 느릅나무와 시무나무가 있으며 약용 부위로 근피와 수피가 함께 사용되고 있다. 유피의 기원 식물 중 느릅나무의 효능에 관한 연구로는 항암 및 면역 활성 (Yang and Kim 2001), 항균효과 (Kim et al. 2003), 항 산화효과 (Lee and Han 2000), 소염진통작용 (Cho et al. 1996), 약효 (Hong et al. 1990), 위염 및 위궤양 관련 연 구 (Lim and Cui 2002)와 성분 연구 (Bae and Kim 2000) 가 보고되었으며 시무나무에 있어서는 성분과 항산화활 성 (Chang et al. 2004)이 보고 되었다.
차전초 (Plantago asiatica var.)는 질경이과에 속하는 다년생 초본으로 도로와 건물주변에 자생하고 있는 식 물이다. 우리나라를 비롯하여 중국과 일본에서 매우 흔 하게 볼 수 있다. 예로부터 독성이 낮아 부드러운 잎과 줄기는 민가에서 식용하거나 즙을 내어 고기와 기름을 혼합하여 고추장에 절여 식용하였다. 질경이의 잎인 차 전초는, 소염 및 이뇨 등의 작용으로 오랫동안 약제로 사 용되고 있다. 또한 위액분비와 위장관 운동조절작용, 항 염작용, 항종양작용 등이 입증되었고, 혈당저하작용과 간 손상 회복에 유의한 효능이 있음이 보고되었다(Park and Lee 2000). 이처럼 천연 약용식물의 효능이 입증되고 있으나 각 약용식물의 혼합물에 대한 세포독성평가 및 아토피 피부 염 완화 및 치료에 관한 자세한 보고는 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 몇 가지 천연약용식물들을 선별 하고 각각을 열수 추출한 뒤, Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay를 통해 추출액의 세포독성을 비교 측정하여, 향 후 아토피성 피부염 완화 및 치료에 활용해보고자 하였 다. 추출물들의 세포독성을 측정하기 위해 비만세포 (HMC-1), 각질형성세포주 (HaCaT), 흰쥐의 섬유아세포 (L929)를 사용하였고, 천연약용식물로는 두충 (Eucom-mia ulimoides), 상엽 (Morus alba L.), 어성초 (Houttuynia cordata Thunb.), 느릅나무 (Ulmus davidiana var. japonica), 차전초 (Plantago asiatica var.)를 혼합하여 사용하였다.
재료 및 방법
1. 시약 및 재료
Cell counting kit-8 (CCK-8)은 Dojindo사 (Kumamoto, Japan) 제품을 이용하였다. Cell culture 100dish, 96well plate, 24well plate는 NUNC사 (Naperville, IL, USA) 제품 을 이용하였고, Dulbecco’s Modified Eagle Medium-High Glucose (DMEM), Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM), Dulbecco’s phosphate Bufferd saline (DPBS), Penicillin Streptomycin, Fetal Bovine Serum (FBS), Pen Strep-Penicillin Streptomycin은 GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을 이용하였다. 두충 (E), 상엽 (M), 어성초 (H), 느릅나무 (U), 차전초 (P)는 신흥과학상사 (Daejon, korea) 제품을 이용하였다. 2. 추출물 제조방법 추출용매로는 3차 증류수를 이용하였다. 추출물은 두 충 (E), 상엽 (M), 어성초 (H), 느릅나무 (U), 차전초 (P)를 사용하여 각각 3 : 3 : 3 : 0.5 : 0.5, 2 : 3 : 2 : 1.5 : 1.5, 3 : 3 : 2 : 1 : 1, 2 : 4 : 2 : 1 : 1의 조성비율로 3차 증류수 1 l를 가하여 75�C에서 24시간 동안 열수추출하였다. 여기서 얻은 추 출물을 냉동건조 (-55�C, 5일)시켜 분말로 만든 후 25 kGy (시간당 10 kGy)로 방사선 멸균하였다. 3. 세포배양 흰쥐의 섬유아세포 (L929), 각질형성세포주 (HaCaT), 비만세포 (HMC-1)는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)으로 부터 구입하였고, 세포 배양액은 L929와 HaCaT의 경우 DMEM에 10% FBS, 100 unit ml-1의 penicillin과 100 unit ml-1의 streptomycin을 첨가한 것을 사용하였으며, HMC-1의 경우 IMDM에 10% FBS, 100 unit ml-1의 penicillin 과 100 unit ml-1의 streptomycin을 첨가한 것을 사용하였
다. 배양은 배양기를 이용하여 37�C, 5% CO2상태를 유
지하였다.
4. 세포독성 실험
추출물의 세포 독성여부 확인은 CCK-8 assay를 이용 하여 측정하였다. L929, HaCaT, HMC-1 cell을 96 well plate에 1×105cells well-1이 되도록 분주하고 24시간 배 양하였다. HaCaT과 L929세포는 추출물을 0 mg ml-1, 0.3 mg ml-1, 0.6 mg ml-1, 1.2 mg ml-1, 1.8 mg ml-1, 2.4 mg ml-1, 2.7 mg ml-1, 또는 3 mg ml-1의 농도로 처리하였고 HMC-1 세포의 경우 1.4 mg ml-1, 2.8 mg ml-1, 5.6 mg ml-1의 농 도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포독성을 측정 하였다.
결과 및 논의
1. 추출혼합물의L929 cell에 대한 세포독성평가 L-929는 일반적으로 어떤 물질의 독성을 판단할 때 기준이 되는 세포로서 한국식품의약품안전청에서 독성 평가시에 사용되는 세포주이다. 각 추출혼합물이 섬유아 세포에 미치는 세포독성을 알아보기 위하여 어성초, 두 충, 차전초, 상엽, 느릅을 조성비율 3 : 3 : 3 : 0.5 : 0.5, 2 : 3 : 2 : 1.5 : 1.5, 3 : 3 : 2 : 1 : 1, 2 : 4 : 2 : 1 : 1의 네개의 그룹으 로 나누어 실시하였다 (Table 1). 그룹 I, II, III의 추출혼합물은 1.8 mg ml-1의 농도 이하 에서는 대조군에 비해 세포 생존율은 각각 97.1% 이상 이었고, 그룹 IV의 추출혼합물은 2.4 mg ml-1의 농도 이 하에서 대조군에 비해 세포 생존율은 115.7%으로 세포 독성은 나타나지 않았다. 다만 그룹 I, II, III의 추출혼합 물은 2.4 mg ml-1이상의 농도로 처리하였을 때, 세포 생 존율 80% 이하의 세포독성을 나타내었고, 그룹 IV의 추 출혼합물은 2.7 mg ml-1이상의 농도로 처리하였을 때, 세포 생존율 80% 이하의 세포독성을 나타내었다 (Fig. 1). 따라서 그룹 I, II, III은 1.8 mg ml-1의 농도에서, 그룹 IV는 2.4 mg ml-1의 농도에서 항염증반응 실험을 진행해 야 할 것으로 판단된다. 2. 추출혼합물의HaCaT cell에 대한 세포독성평가 HaCaT은 피부에서의 독성을 판단할 때 사용되는 세 포로서 이번 실험에 사용되었다. 각 추출혼합물이 각질 형성세포주에 미치는 세포독성을 알아보기 위하여 실시 한 실험결과 모든 그룹에서 84% 이상으로 독성이 없음 을 나타내었다 (Fig. 2). L929에 비해 사람의 상피세포주 인 HaCaT에서 독성을 띄지 않음을 알 수 있었다.Table 1. Composition of herbal extracts mixtures. H: Houttuynia
cordata Thunb., E: Eucommia ulimoides, P: Plantago asiatica, M: Morus alba L., U: Ulmus davidiana var. japo-nica Group H E P M U I 3 3 3 0.5 0.5 II 2 3 2 1.5 1.5 III 3 3 2 1 1 IV 2 4 2 1 1
3. 추출혼합물의 HMC-1 cell에 대한 세포독성평가 HMC-1은 결체조직과 점막에 존재하는 세포질 내 과 립을 풍부하게 가진 면역세포로서 알레르기 염증반응에 관여한다. HMC-1은 IgE가 매개하는 면역반응과 관계되 어 있으며, TH2 type에 의존적인 면역과민성반응과 알레 르기성 질환 및 특정 선천성 면역반응을 유도하는 것으 로 알려져 있다 (Kim and Lee 1999). 특히 외부자극으로 부터 활성화된 비만세포는 다양한 프로테아제나 히스타 민과 같은 혈관확장 물질들을 분비하며, 염증유발물질인 지질매개물과 다양한 사이토카인의 분비를 자극한다. 비 만세포로부터 분비되는 사이토카인들은 알레르기 염증의 초기반응과 후기반응을 유발하고 만성적으로 염증반응을 지속시키는 데 중요한 역할을 한다(Galli et al. 2008). 특 히 활성화된 비만세포로부터 후천적으로 생성되는 leu-koreiene, platelet activating factor prostaglandin (PG) 등은 점액분비를 증가시키고, 기도 내 염증세포의 침윤을 유 도하며, 혈관 투과성을 증가시키고, 부종 등을 유발함으 로써 실제 알레르기 천식과 직접 연관되는 것으로 알려 져 있다 (Brown et al. 2008). 비만세포의 경우 독성테스트 후, 추후 추출물의 항염증반응을 알아보고자 사용하였 다. 각 추출혼합물이 HMC-1에 미치는 세포독성을 알아 보기 위하여 실시한 실험결과 모든 그룹에서 2.8 mg ml-1 의 농도에서 83% 이상으로 독성이 없음을 나타내었다 (Fig. 3). 5.6 mg ml-1이상의 농도에서는 79% 이하의 독 성을 나타냈다. 따라서 HMC-1는 2.8 mg ml-1의 농도에 서 항염증 반응에 대한 실험을 진행해야 할 것으로 판단 된다.
결
론
본 연구에서는 열수추출한 천연약용식물 성분을 방사 선 멸균한 후 세포독성을 측정하였다. 각각의 천연약용 식물의 추출물은 효능이 입증되었으나 각 약용식물의 혼 합물에 대해서는 독성평가 및 아토피성 피부염에 미치 는 영향에 관한 보고가 없기에 본 연구를 실시하였다. 그 결과, L929에서는 1.8 mg ml-1이하의 농도에서 독성이 없음이 나타났고, HaCaT에서는 3 mg ml-1까지 독성이 없는 것으로 나타났다. 또한 HMC-1에서는 2.8 mg ml-1 이상의 농도에서 독성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 이번 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 독성이 없는 농 도범위하에 항염증반응 실험을 진행하게 된다면 천연약 용식물의 혼합물을 이용하여 아토피 피부염을 억제할 수Fig. 1. Cytotoxicity test of herbal extracts mixtures on L929 cell line.
160 120 80 40 0 0 0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 2.7 3 Concentration (mg ml-1) Survival rate (%) 3 : 3 : 3 : 0.5 : 0.5 2 : 3 : 2 : 1.5 : 1.5 3 : 3 : 2 : 1 : 1 2 : 4 : 2 : 1 : 1
Fig. 2. Cytotoxicity test of herbal extracts mixtures on HaCaT cell
line. 200 150 100 50 0 0 0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 2.7 3 Concentration (mg ml-1) Survival rate (%) 3 : 3 : 3 : 0.5 : 0.5 2 : 3 : 2 : 1.5 : 1.5 3 : 3 : 2 : 1 : 1 2 : 4 : 2 : 1 : 1
Fig. 3. Cytotoxicity test of herbal extracts mixtures on HMC-1 cell
line. 140 120 100 80 60 40 20 0 0 1.4 2.8 5.6 Concentration (mg ml-1) Survival rate (%) 3 : 3 : 3 : 0.5 : 0.5 2 : 3 : 2 : 1.5 : 1.5 3 : 3 : 2 : 1 : 1 2 : 4 : 2 : 1 : 1
있는 연구에 관한 새로운 발판을 마련할 수 있을 것으 로 판단된다.
사
사
본 연구는 교육과학기술부 지원 원자력연구개발사업 에 의하여 수행되었으며 이에 감사드립니다.참 고 문 헌
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Manuscript Received: December 10, 2009 Revision Accepted: December 17, 2009
