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의학
학
학 석
석
석사
사
사학
학
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위 논
논
논문
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문
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능력
력
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국문 요약
-항
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A
A 절
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절단
단
단능
능
능력
력
력
목 목목적적적 :항-DNA 자가항체는 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 유발에서 중요한 역할 을 수행한다.하지만 이러한 항체의 자가 면역질환에서의 잠재적인 표적물질과 병리학적인 역할은 아직 명확히 규명되어 있지 않다.본 연구의 목적은 첫 번째 로 항-DNA 자가항체의 DNA-절단 활성과 암세포와 정상세포에서의 세포독성을 분석하고 두 번째로 항체에 의한 세포사멸이 apoptosis를 통해 일어나는지 또한 어떠한 메카니즘이 관여하는지를 밝히고자 하는 것이다. 재 재재료료료 및및및 방방방법법법 :::본 연구실에서는 이미 SLE의 동물모델인 MRL-lpr/lpr생쥐로부터 하이브리도마 기술(hybridomatechnology)에 의해 항-DNA 단클론 자가항체
를 생산하는 세포주들을 만든 바 있다.하이브리도마 세포를 대량 배양한 후
G1-5 항체를 protein G를 사용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.먼저
ALONA(affinity-linked oligonucleotide nuclease assay)와 plasmid 절단으로 DNA-절단 활성을 측정하였고 암세포와 정상세포에서의 세포독성을 분석하였다.
또한 항체에 의한 apoptosis를 확인하기 위해서 DNA fragmentation을 전기영동
으로 확인하였고,Caspase3의 활성여부를 Westernblotting으로 확인하였다.항
-DNA 자가항체의 세포막 결합과 세포 내재화를 FACS와 형광현미경으로 확인 하였다.
결
체는 supercoiled 형태의 DNA를 open circular,linear형태의 DNA로 전환시켰
으며,좀 더 sensitive한 방법인 ALONA를 이용하여 DNA-절단 활성을 확인 하
였을 때,농도에 따라 절단 활성이 증가하였으며,ssDNA와 dsDNA 둘 다 절단 하였다.G1-5항체는 test한 4종류의 암세포에서 모두 세포독성을 가지고 있었 으며 특히 HL60세포에서 가장 높은 독성을 보였다.반면에 정상세포에서는 세 포치사능이 비교적 낮았으며 특히 MLg에서는 아주 낮은 세포독성을 보였다.그 리고 nomalmouseIgG는 세포 안으로 들어가기는 하지만 암세포에 대한 세포독 성이 아주 낮았다.G1-5 항체를 암세포에 처리하였을 때 apoptosis의 전형적인
특징인 DNA fragmentation이 나타났으며 caspase3가 활성화되고 PARP가 절
단되었다.또한 G1-5항체와 nomalmouseIgG는 농도에 따라 세포막에 결합하 고 세포질과 핵내로 내재화되었다. 결 결결론론론 :자가 면역 질환이 있는 마우스에서 분리해낸 항-DNA 단클론 자가항체는 HL60,L929,Jurkat,Hela등 암세포와 L-M 정상세포에서 세포독성을 나타냈다. 또한 항체는 DNA-절단 활성이 동시에 존재한다는 것을 확인하였다.DNA-절단 항체는 세포의 안으로 들어가서 일부는 표적세포의 핵으로 들어갔다.이 결과로 부터,핵 안으로 들어간 항체가 DNA를 절단하고,apoptotic세포 사멸을 일으켰 으리라고 제시할 수 있다.하지만,세포막에 결합하여 세포사멸에 관련된 신호전 달 과정을 활성화했을 가능성도 배제 할 수 없다.이러한 항-DNA 자가항체의 DNA 절단,세포독성 활성에 대한 더 깊은 연구는 전신성 홍반성 낭창(SLE)와 같은 자가 면역 질환의 병리학적 원인을 이해할 수 있는데 도움이 될 것이다. 핵심어 :항-DNA 자가항체,DNA 절단 활성,세포독성,전신성 홍반성 낭창
차
차
차 례
례
례
국문요약 ···ⅰ 차 례 ···ⅲ 그림차례 ···ⅴ 표 차례 ···ⅶ Ⅰ.서 론 ···1 Ⅱ.재료 및 방법 ··· 3 A.단클론 항-DNA 자가항체의 분리,생산,정제 및 확인 ···3 1.세포배양 ···3 2.단클론 항-DNA 자가항체의 생산 ···3 3.항-DNA 자가항체의 정제 ···3 4.정제된 항-DNA 자가항체 로부터의 Fab생산 ···4 5.정제된 G1-5항체,Fabfragments의 SDS-PAGE···46.항-DNA 자가항체의 DNA 결합 활성 측정을 위한 ELISA (Enzyme-linkedimmunosorbentassay)···5
B.암세포와 정상세포에 대한 항-DNA 자가항체의 세포독성 분석 ···5
C.항-DNA 자가항체의 DNA 절단 활성 ···6
1.Plasmidcleavage(전기영동)···6
2.ALONA (affinity-linkedoligonucleotidenucleaseassay) ···6
D.항-DNA 자가항체로 유도되는 세포사멸의 메카니즘 분석 ···7
1.DNA fragmentation ···7
3.현미경 관찰 (phase-contrastmicroscope)···8
E.항-DNA 자가항체의 세포 표면 결합과 세포질 혹은 핵의 localization분석 ···9
1.항체의 세포표면 결합 (FACS 분석)···9
2.항체의 세포표면 결합 (형광현미경)···9
3.항체의 세포질 혹은 핵의 localization(FACS 분석)···9
4.항체의 세포질 혹은 핵의 localization(형광현미경)···10
Ⅲ.결 과 ···11 A.단클론 항-DNA 자가항체의 분리 정제 및 확인 ···11 B.암세포와 정상세포에 대한 항-DNA 자가항체의 세포독성 분석 ···16 C.항-DNA 자가항체의 DNA 절단 활성 ···20 D.항-DNA 자가항체로 유도되는 세포사멸의 메카니즘 분석 ···25 E.항-DNA 자가항체의 세포 표면 결합과 세포질 혹은 핵의 localization분석 ···29
Ⅳ.고 찰 ···36
Ⅴ.결 론 ···38
참고 문헌 ···39
그
그
그림
림
림 차
차
차례
례
례
Fig.1.FractionsofG1-5elutedfrom affinitychromatogrophy.···13
Fig.2.SDS-PAGE ofthepurifiedG1-5IgandFabfragments.···14
Fig.3.DirectbindingELISA ofdifferentbatchesofG1-5.···15
Fig.4.Cytotoxicityofanti-DNA autoantibody.···18
Fig.5.RelativecytotoxiceffectofG1-5andnomalmouseIgG onHL60cellline.···19
Fig.6.CleavageofsupercoliedpUC18DNA orM13mp18dsDNA byG1-5IgG andG1-5Fabfragments.···21
Fig.7.CleavageofpUC18plasmidDNA andM13mp18dsDNA byvariousconcentrationsandvarioustimesofG1-5.···22
Fig.8.DNA sequencesofthesingle-strandedsubstratesused.···23
Fig.9.TheALONA microtiterassayofG1-5.···24
Fig.10.DNA fragmentationofG1-5Abtreatedcells.···26
Fig.11.CelldeathofCancercelllinesHL60andL929triggered byG1-5.···27
Fig12.Caspase3activationinHL60cellstreatedwith G1-5andTRAIL.···28
Fig.13.Cellsurfacebindingofvariousconc.ofG1-5ornomalIgG.···31
Fig.14.Immunolocalizationofinternalizedvariousconc.ofG1-5or normalIgG.···32
Fig.16.PenetrationofG1-5intoL929cellsandtheirnucli.···34 Fig.17.Amino-acidsequencesoftheCDR V genesof
표
표
표 차
차
차례
례
례
Table1.Cytotoxicityofanti-DNA antibody,G1-5tocancerandnomal celllines.···16
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ.
.
.서
서
서
론
론
론
항-DNA 자가항체는 1957년 전신성 홍반성 낭창 (SLE)환자의 혈청에서 처
음 발견되었으며,자가 면역질환 특히 전신성 홍반성 낭창과 관련된 kidney
damage병리학적 기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Kozyretal,
2002).또한 Anti-nuclearantibodies는 SLE,Sjogren'ssyndrome그리고 전신성 경화증과 같은 전신성 자가 면역 질환에서 높게 발현되는 것이 특징이며 임상적 인 진단에서 anti-nuclearantibodies의 수준을 측정하는 ANAstest가 널리 사용
되고 있으며, ANA는 probes로 사용됨으로써 mRNA splicing, rRNA
biosynthesis,processing,DNA replication,celldivison,최근에는 apoptosis에 이
르기까지 분자,세포생물학에 대한 우리의 이해에 기여해 왔다 (Casiano etal,
1996).또한 지금까지 항-DNA 자가항체에 대하여 광범위하게 연구되어 지고 있 지만,자가 면역질환에 있어서의 항-DNA 자가항체의 역할은 아직 명확히 규명 되지 않고 있다.최근에는 항-DNA 자가항체가 살아있는 세포를 통과하는 능력 과 DNA-가수분해 활성, 세포독성 등의 새로운 특징이 보고되고 있다 (Ternynck.1998).항-dsDNA 자가항체,항-snRNP 자가항체의 경우 세포막에 결합하여 kidneycell을 통과하고 ribosomalP protein의 경우 간세포에 들어간다 고 보고되어 있으며,세포 안으로 들어간 항체는 단백질 합성과 같은 세포 기능
을 방해하여 세포사멸을 일으키게 된다 (Koscec etal,1997;Gubibov etal,
1997).DNA-가수분해 항체는 1992년 처음 전신성 자가 면역질환을 갖는 환자에 서 발견되어 그 이후 lymphoproliferativedisease,AIDS 후기단계의 환자의 혈액
에서 발견되었다 (Gubibov etal,1997).DNA-가수분해 활성을 갖는 항체는 대
한다 (Suchkov,2001).
최근 연구에서는 DNA등의 nuclearantigens에 특이적인 다양한 자가항체가 세
포독성을 가지며 apoptosis를 일으킨다는 보고가 있다.항-DNA 자가항체의 세포 독성 메카니즘은 완전히 이해되지는 않았지만,항-DNA 자가항체가 세포막 단백 질과 교차 반응하여 세포표면에 있는 targets에 접근하여,Fas,TNF-α 수용체와 같은 세포 사멸 수용체와 교차 반응을 가짐으로 인하여 항-DNA 자가항체가 세 포사멸을 일으키는 신호 전달 경로를 활성화 시킬 수 있을 것이라는 것과,세포 내의 핵으로 들어가서 직접적으로 염색체 혹은 DNA를 분해시켜 apoptosis를 일
으키는 등의 기전이 제시되어 온 바 있다 (Gubibov etal,2000).세포 내의 자가
항원을 분해하는 자가 항체의 활성 연구는 자가 면역질환에 있어서의 항-DNA 자가 항체의 역할,자가 항체가 관련하는 여러 타 질환 (동맥경화,암,천식 등)의 유발 기전 혹은 유발 결과 일어나는 현상을 규명하는데 중요한 단서가 될 것이며,자가 면역 질환의 진단 test개발 분야에 전망이 밝다고 할 수 있으며,또한,이의 응용은 여러 질병의 치료 용 항체로서의 개발 분야에서도 관심을 받고 있다.또한 항체가 세포 안으로 들어가는 능 력을 이용하여 치료용 단백질을 세포내로 운반하는 새로운 기술로 발전 시 킬 수 있을 것이다.
본 연구에서는 촉매성 항체 (catalyticantibody)에 대하여 여러 측면에서 깊이
연구하기 위하여,SLE의 동물모델인 MRL-lpr/lpr으로부터 본 연구실에서 만든
단클론 항-DNA 자가항체에서 DNA-가수분해 활성과 세포독성을 심도 있게 분 석하고,항체에 의한 세포사멸의 생화학적 기전을 밝히고자한다.
Ⅱ
Ⅱ
Ⅱ.
.
.재
재
재 료
료
료 및
및
및 방
방
방 법
법
법
A.단클론 항-DNA 자가항체의 생산,분리,정제 및 확인1.세포 배양
암세포주 (L929,HL60.Jurkat,Hela)와 정상세포주 (L-M,MLg)를 DMEM
supplemented with 10% fetalbovine serum(FBS),RPMI1640 supplemented
with10% FBS로 배양하였다.세포는 37℃,10% CO의 incubator에서 유지시켰
다.
2.단클론 항-DNA 자가항체의 생산
MRL-lpr/lprmice로부터 유래한 단클론 항-DNA 자가항체를 생산하는 하이
브리도마 G1-5 (GenBank accession number:VH,AF289182,VL,AF289183) 세포주를 대량으로 배양한 후,배양액을 항체 순수분리에 사용하였다.
3.항-DNA 자가항체의 정제
항-DNA 자가항체 G1-5세포주를 spinnerflask(Techne)에서 대량으로 배양
하였다.원심분리를 4℃,5000rpm,20min하여 세포를 가라앉힌 다음 sup을 모아
ultrafiltration (amicon)으로 농축하였다.Binding buffer (0.1M Tris-ClpH7.5, 0.15M NaCl)와 1:1로 섞은 다음 친화성 컬럼 (affinity column)를 사용하여
proteinG (Amersham Biosciences,Sweden)와 결합시키고 elutionbuffer(0.2M glycine-HCL pH2.7,0.15M NaCl)를 사용하여 2ml씩 14개의 fraction을 받은 다 음,centriprep(YM-10,Milipore)을 이용하여 약 1ml로 농축한 후 PBS 30ml을
넣고 다시 1ml로 농축시켰다.
4.정제된 항-DNA 자가항체로부터의 Fab생산
2mg의 정제된 항체 G1-51.25mM EDTA,2-mercaptoethanol0.01%를 첨가한
다음 papain20㎍을 넣고 37℃에서 8-12시간 반응시켰다.
그리고 15-50mM iodoacetamide를 넣은 후 상온에서 30분 반응 시키고 Binding buffer(0.1M Tris-ClpH7.5,0.15M NaCl)와 1:1로 섞어 4℃에서 30분 반응시킨
다음 Fab fragments는 column을 그대로 통과시켜 fraction을 받아내고 Fc부분
은 protein G와 결합한 후 elution buffer(0.2M glycine-HCL pH2.7,0.15M NaCl)를 이용하여 elution하였다.
5.정제된 G1-5,Fabfragments의 SDS-PAGE
정제된 항체 단백질이 포함된 용액 40 ㎕와 5× sample buffer (β
-mercaptoethanol을 포함하는 dye)10 ㎕를 섞어 97℃에서 3분간 가열하였다.
Sizemarker(15-120kDa,Genepia,Korea)와 정제된 항체용액을 12% SDS gel 에서 60 V로 30분간, 100V에서 1시간～1시간 30분 동안 전기영동 한 뒤 Coomassieblue로 염색하였다.
6.항-DNA 자가항체의 DNA 결합 활성 측정을 위한 ELISA (Enzyme-linkedimmunosorbentassay)
dsDNA (5 ㎍/ml)를 100 ㎕씩 ELISA plate (Polysorp,Nunc,Denmark)의
well에 각각 넣은 후,4℃에서 하룻밤 coating하였다.Coating 되지 않은 dsDNA
를 제거한 후 PBS로 1회 세척하였다. 그 후,200㎕의 Blocking solution (5% BSA inPBS)을 넣고 2시간 동안 상온에서 blocking하였다.Blocking solution을
제거한 뒤,PBST (0.05% Tween in PBS)로 한번 세척하고 5㎍/ml G1-5
antibody를 각 well에 100㎕씩 넣어준 뒤 37℃에서 2시간 반응시켰다.다음
PBST로 3번 세척하고 여기에 1%BSA/PBS로 1:3000으로 희석한 anti-goat
mouseIgG-AP (alkalinephosphatase)용액을 100㎕를 넣어주고 상온에서 1시간 반응시켰다.PBST로 2번 세척한 후,마지막으로 TBS로 한번 세척한 다음 AP의
substrate인 pNPP (SigmachemicalCo,USA)용액을 넣고 노란색으로 색깔이
변할 때 까지 반응시킨 후 405nm파장에서 흡광도를 분광 광도계로 측정하였다. B.암세포와 정상세포에 대한 항-DNA 자가항체의 세포독성 분석
암세포주 (L929,HL60,Jurkat,Hela)정상세포 (MLg,L-M)을 96-wellplate
에 분주하였다.이때 부착세포인 L929,Hela,MLg,L-M의 경우 6000세포씩,부
유 세포인 Jurkat,HL60는 2X10 세포씩 100㎕ 분주하였다.다음 정제된 항체
G1-5를 0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1mg/ml농도별로 처리하여 24시간 반응시 켰다.세포독성은 CCK-8혹은 MTT assay를 이용하여 측정하였다.살아있는 세 포의 dehydrogenaseactivity를 측정하는 CCK-8(CellCounting Kit-8,웅비메디
텍)을 medium 부피의 1/10로 넣고 2-3시간 반응 시킨 다음 450nm파장에서 흡
광도를 분광 광도계로 측정하고,MTT solution(Sigma)0.5mg/ml을 반응시킨 후
DMSO 100㎕를 넣어 15분 반응 시킨 후 570nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세 포독성을 분석하였다.
C.항-DNA 자가항체의 DNA 절단 활성 1.Plasmidcleavage(전기영동)
PlasmidDNA (pUC18),M13mp18dsDNA 1㎍ 각각을 G1-5IgG,G1-5Fab
와 25mM Tris-Cl(pH7.5),10mM MgCl Buffer와 시간별,농도별로 반응시켰
다.다음 1% agarosegel에 15㎕씩 loading 하여 100V에서 40분간 전기영동을
한 다음 imageanalyzer로 사진을 찍었다.
2.ALONA (affinity-linkedoligonucleotidenucleaseassay)
DNA strends의 5‘-enddigoxigenin,3’-endbiotin이 붙어있는 substrate를 제
노텍 회사에 의뢰하여 합성한 다음 실험에 사용하였다.Double stranded d(A)
:d(T)을 만들기 위하여 digoxigenin과 biotin이 표지되어 있는 ssDNA와 표지
되어 있지 않은 상보적인 ssDNA를 65℃에서 15분간 반응 시킨 후 온도를 서서 히 낮추었다.먼저 96-wellplates (Costar)에 streptavidin (Sigma)1 mg/ml을
TBS에 1㎍/ml으로 희석하여 각 well당 100㎕씩 37℃에서 2시간 coating하였
넣어주고 37℃에서 30분 반응 시켜주었다. 다시 TBS로 3번 세척한 다음 washingsolution인 TBS 300㎕를 넣고 37℃에서 30min반응시켰다.
다시 TBS로 3번 세척한 다음 G1-5 항체를 농도별로,25mM Tris-HClpH7.5,
10mM MgCl buffer와 함께 넣어주고 37℃에서 16시간 반응시킨다.항체에 의해
잘린 substrate를 제거해 주기 위해서 TBS로 3번 세척한 다음 AP-labeled
anti-digoxigenin Fabfragment(1:5000inTBS)를 넣어 37℃에서 1시간 반응시
킨다.TBS로 3번 세척하고 pNPP substratesolution 100㎕를 넣어준 다음 색깔 이 노란색으로 변할 때까지 37℃에서 반응시킨 후 405nm파장에서 흡광도를 분 광 광도계로 측정 하였다. D.항-DNA 자가항체로 유도되는 사포사멸의 메카니즘 분석 1.DNA fragmentation HL602X 10 cells을 T25flask에 분주한 다음 G1-5항체 1mg/ml을 넣고 24 시간 반응하였다.이때 positivecontrol로 TNF-α 100ng/ml을 HL60에 처리하였
다.세포를 harvest하여 15mltube에 옮긴 다음 1000rpm,10min 원심분리한 다
음 PBS로 한번 세척한다.PBS를 제거한 다음 Lysis buffer(20mM Tris-Hcl
pH7.5,1mM EDTA,0.4% tritonX-100)로 세포를 부유시킨다.RNA를 분해시키
기 위해서 0.1mg/ml RNase A와 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 0.2mg/ml
proteinaseK와 50℃에서 3시간 반응시켜 단백질을 분해하였다.반응이 끝난 후
phenol/chloroform/isoamyl alcohol 200㎕를 넣어 충분히 섞어 준 다음 4℃,
ethanol precipitation을 수행한 다음 TE buffer로 침전물을 풀어주어 2% agarosegel에 loading하여 100V에서 40분간 전기영동을 하였다.
2.Caspase3의 활성 유무와 PARP (poly-ADP ribosepolymerase)절단 관찰을 위한 Westernblotting
HL60 1 X 10 cells을 6-wellplate에 분주한 후 G1-5 1mg/ml과 positive
control로 TRAIL 0.5㎍/ml을 처리한 후 48시간 동안 반응 시켰다. 세포를
harvest한 후 13000rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 가라앉히고 PBS로 한 번 세척하였다.2X Laemmli's sample buffer(125mM TrsipH 6.8,4% SDS, 20% glycerol,14.4mM 2-mercaptoethanol,0.0002% bromophenolblue)로 세포를
lysis 시킨 후 97℃에서 5분간 가열하여 12% SDS gel에서 전기영동을 수행한
후 Immuno blot를 수행하였다. PVDF membrane (Polyvinylidine Fluoride
membrane,Milipore,USA)에 300mA로 1시간 30분간 전기 이동한 후 PVDF
membrane을 blocking 용액 (5% non-fatdried milk in TBST)에 1시간 동안 blocking하였다.Blocking이 끝나고 rabbitanti-caspase3antibody(Stressgen) 과 anti-PARP antibody (cellsignaling)과 anti-β-actin antibody (Sigma)를
blocking 용액에 1:1000 희석하여 2시간 동안 반응 시켰다. 다음 rabbit
anti-IgG-HRP (Santacruz)로 다시 1시간 동안 반응시킨 다음 ECL (enhanced
chemiluminescence,Amersham Pharmacia Biotech Inc.)을 사용하여 형광반응 시킨 다음 X-ray필름에 감광하였다.
L929,HL60세포주에 G1-5항체 1mg/ml을 처리한 다음 24시간 반응시켜 위 상차 현미경으로 세포를 형태를 관찰하였다.
E.항-DNA 자가항체의 세포 표면 결합과 세포질 혹은 핵의 localization분석
1.항체의 세포표면 결합 (FACS)
HL601X 10 cells500㎕를 항-DNA 자가항체 G1-5와 4℃에서 3시간 동안
반응 시켰다.다음 icedbuffer(4℃)PBS로 세 번 세척하여 결합하지 않은 G1-5
를 제거시키고 FITC-labeledgoatanti-mouseIg로 염색을 한 후 PBS로 세척하
여 FACS로 분석하였다.
2.항체의 세포표면 결합 (형광현미경)
24wellplate에 coverglass를 얹은 다음 L929 1X 10 cells을 분주하였다.
하룻밤 동안 세포를 coverglass에 붙인 다음 G1-5항체를 2시간 반응시켰다.
PBS로 3번 세척한 다음 4% p-formaldehyde로 10min 동안 고정 시킨 후
FITC-conjugatedanti-mouseIgG 5㎍/ml(1%BSA/PBS)을 넣어 주고 다시 3번 세척한 후 coverglass를 coverslide에 mountingsolution을 이용하여 붙인 다음 형광현미경으로 관찰하였다.
3.항체의 세포질 혹은 핵의 localization(FACS 분석)
labelingkit(Molecularprobes)를 사용하여 labeling하였다.
다음 HL601X 10 cells500㎕를 fluoresence가 labeling된 G1-5와 37℃에서 3
시간 동안 반응 시켰다.다음 iced buffer(4℃)PBS로 세 번 세척하여 unbound
G1-5를 제거시키고 4% p-formaldehyde로 10분간 고정 시킨 후 다시 세척하여
준 다음 FACS로 분석하였다.
4.항체의 세포질 혹은 핵의 localization(형광현미경)
항체를 Rhodamine Red-X labeling kit (Molecular probes)를 사용하여 labeling 하였다.다음 24wellplate에 coverglass를 얹은 다음 L929cells1X
10을 분주하였다.하룻밤 동안 세포를 cover glass에 붙인 다음 Rhodamine
Red-X로 labeling된 G1-5를 처리하였다.항체를 시간별로 반응 시킨 후 3번 세
척한 후 4% p-formaldehyde 로 10분간 고정 시킨 후 다시 세척하여 준 다음
mountingsolution을 사용하여 coverslide에 붙인 다음 형광현미경으로 관찰하였 다.
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ.
.
.결
결
결 과
과
과
A.단클론 항-DNA 자가항체의 분리,정제 및 확인1.단클론 항-DNA 자가항체의 정제
MRL-lpr/lprmice로부터 유래한 단클론 항-DNA 자가항체를 생산하는 하이
브리도마 세포주를 대량으로 배양한 후,배양액을 항체 순수분리에 사용하였다.
먼저 G1-5 세포를 1ℓ배양하여 친화성 크로마토그래피 결과 14개의 fraction을
받아 280nm 파장에서 분광 광도계를 측정하여 흡광도 0.2이상인 fraction을 모
아 centiprep (YM-10, Millipore)을 이용하여 1ml로 농축하고 PBS 30ml로
buffer로 교환한 다음 다시 1ml로 농축을 하여 5-10mg의 항체를 얻었다 (Fig.
1).
2.정제한 G1-5IgG와 G1-5Fab의 SDS-PAGE
정제한 G1-5항체를 12% SDS-PAGE를 이용하여 reducing조건에서 분리한
후,Coomassie blue staining으로 50kDa,25kDa의 중쇄 (H chain)와 경쇄 (L chain)IgG band를 확인 하였다 (Fig.2).또 정제한 G1-5항체에 papain을 처리
한 후 protein G 친화성 크로마토그래피를 통하여 분리한 Fab fragments는
3.항-DNA 자가항체의 dsDNA와의 결합 활성 측정을 위한 ELISA
정제한 G1-5의 dsDNA와의 결합 활성을 확인하기 위해 날짜별로 정제된 G1-5각각의 결합 활성을 ELISA로 측정하였다.그 결과 각각의 배치(batch)에
서 결합활성에 차이는 있었지만 모두 dsDNA와의 결합력을 가지고 있었다 (Fig.
Elution of G1-5 Elution of G1-5 Elution of G1-5 Elution of G1-5 0 00 0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.8 0.8 0.8 0.8 1 11 1 1.2 1.2 1.2 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.6 1.6 1.6 1.6 1 11 1 2222 3333 4444 5555 6666 7777 8888 9999 101010 1110 11 121111 121212 131313 1413 141414 Fraction number Fraction number Fraction number Fraction number O . D 2 8 0 F FFiiiggg...111..F.FFrrraaaccctttiiionoonnsss ooofffGGG111---555 eeellluuuttteeeddd fffrrrooommm aaaffffffiiinnniiitttyyy ccchhhrrrooommmaaatttooogggrrroooppphhhyyy...Bound IgG was eluted by passing elution bufferthrough the column.Two mlof each fraction werecollected.IgG elution wascontinued untiltheabsorbance at280nm waslessthan0.2.
F
FFiiiggg...222..S.SSDDDSSS---PPPAAAGGEGEE ooofffttthhheeepppuuurrriiifffiiieeedddGGG111---555IIIgggGGG aaannndddFFFaaabbbfffrrraaagggmmemeennntttsss...Purified G1-5IgG andFabfragmentsweresubjectedto12% SDS-polyacrylamidegel electrophoresis.The protein bands in the gelwere stained with Coomassie brilliant G-250.Heavy and light chains were shown at 50 and 25 kDa, respectively,underthereducedSDS-PAGE.Fabfragmentswereshownat45 kDa,underthenon-reducingSDS-PAGE. H chain H chain H chain H chain 120kDa 120kDa120kDa 120kDa 45kDa 45kDa 45kDa 45kDa 30kDa 30kDa 30kDa 30kDa L chain L chain L chain L chain G1 G1G1
G1----5 5 5 5 IgGIgGIgGIgG FabFabFabFab
45kDa 45kDa 45kDa 45kDa H chain H chain H chain H chain 120kDa 120kDa120kDa 120kDa 45kDa 45kDa 45kDa 45kDa 30kDa 30kDa 30kDa 30kDa L chain L chain L chain L chain G1 G1G1
G1----5 5 5 5 IgGIgGIgGIgG FabFabFabFab
45kDa 45kDa 45kDa 45kDa
- 0 . 1 - 0 . 1 - 0 . 1 - 0 . 1 0 . 1 0 . 1 0 . 1 0 . 1 0 . 3 0 . 3 0 . 3 0 . 3 0 . 5 0 . 5 0 . 5 0 . 5 0 . 7 0 . 7 0 . 7 0 . 7 0 . 9 0 . 9 0 . 9 0 . 9 1 . 1 1 . 1 1 . 1 1 . 1 1 . 3 1 . 3 1 . 3 1 . 3 1 . 5 1 . 5 1 . 5 1 . 5 1111 2222 3333 4444 5555 6666 7777 8888 9999 10101010 11111111 12121212 cont rol cont rol cont rol cont rol N o a n t i g e n N o a n t i g e n N o a n t i g e n N o a n t i g e n G 1 - 5 A b G 1 - 5 A b G 1 - 5 A b G 1 - 5 A b N o A b N o A b N o A b N o A b F FFiiiggg 333...DDDiiirrreeeccctttbbibiinnndddiiinnngg Eg EELLLIIISSSAAA oooffdfddiiiffffffeeerrreeennntttbbbaaattctcchhheeesss oooffGfGG111---555...Ninety-six wellpolystyrenemicrotiterplatewascoated with dsDNA and purified G1-5 was added into each well.AP-conjugated anti-mouse IgG and pNPP were used as a secondary antibody and a substrate,respectively.Absorbance at 405nm wasmeasuredbyELISA reader.
B.암세포와 정상세포에 대한 항-DNA 자가항체의 세포 독성 분석 L929,HL60,Jurkat,HeLa암세포주와,MLg,L-M 정상세포주에 G1-5항체를 0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.81mg/ml의 농도별로 처리한 다음 24시간 반응시켰 다 (Fig.4).그 결과 항체 농도에 dependent하게 세포독성이 증가하였으며 1mg/ml의 G1-5항체를 처리하였을 때 암세포주인 HL60,L929,Jurkat,HeLa 에서 각각 36%,31%,21%,11.5% 의 세포독성이 나타났다.반면 정상 세포주에 항체를 처리 하였을 때 L-M 에서는 18%로 Jurkat과 비슷한 세포독성을 보였으
며,MLg 에서는 3%의 낮은 세포독성을 보였다 (Table1,Fig.4).또한 nomal
mouseIgG와 G1-5를 HL60에 1mg/ml로 처리하여 세포독성을 비교하여 보았을
T
TTaaabbbllleee...11.1..CCCyyytttoootttoooxxixiiccciiitttyyyooofffaaannntttiii---DDDNNNAAA aaannntttiiibbboooddydyy,,,GGG111---555tttooocccaaannnccceeerrraananndddnnnooommmaaalll c
cceeellllllllliniinneeesss...
Cancercell % ofdeadcellsafterincubationwith lines anti-DNA autoantibody
HL60 36
L929 31
Jurkat 21
HeLa 11
Nomalcell % ofdeadcellsafterincubationwith lines anti-DNA autoantibody
MLg 3
L-M 18
Cellswereincubated with 1mg/mlofantibody,G1-5 for24hr.Quantitation ofviablecellswasdoneusingCCK-8aasay.
Cytotoxicity of cancer cell lines by G1-5 Cytotoxicity of cancer cell lines by G1-5Cytotoxicity of cancer cell lines by G1-5 Cytotoxicity of cancer cell lines by G1-5
0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100 100 100 120 120 120 120 0.02 5 0.02 5 0.02 5 0.02 5 0.05 0.05 0.05 0.05 0. 1 0.1 0.1 0.1 0.0.0.0.2222 0.0.0.0.4444 0.0.0.0.8888 1111 G1 -5 (A b) dos e m g/ m l G1 -5 (A b) dos e m g/ m lG1 -5 (A b) dos e m g/ m l G1 -5 (A b) dos e m g/ m l P e r c e n t c e ll s u rv iv a l P e r c e n t c e ll s u rv iv a l P e r c e n t c e ll s u rv iv a l P e r c e n t c e ll s u rv iv a l HL60 L929 Jurkat Hela C ytotox ic i ty of n omal c e l l l in e s by G1-5 C ytotox ic i ty of n omal c e l l l in e s by G1-5 C ytotox ic i ty of n omal c e l l l in e s by G1-5 C ytotox ic i ty of n omal c e l l l in e s by G1-5 0 0 0 0 20 2020 20 40 4040 40 60 6060 60 80 8080 80 100 100100 100 120 120120 120 0.02 5 0.02 5 0.02 5 0.02 5 0.05 0.05 0.05 0.05 0.0.0.0.1111 0.0.0.0.2222 0.0.0.0.4444 0.0.0.0.8888 1111 Ab (G1-5) dos e mg/ ml Ab (G1-5) dos e mg/ ml Ab (G1-5) dos e mg/ ml Ab (G1-5) dos e mg/ ml P e rc e n t c e ll s u rv iv a l P e rc e n t c e ll s u rv iv a l P e rc e n t c e ll s u rv iv a l P e rc e n t c e ll s u rv iv a l L -M L -M L -M L -M M L g M L g M L g M L g F
FFiiiggg...44.4..CCCyyytttoootttoooxxxiiiccciiitttyyy ooofffaaannntttiii---DDNDNNAAA aaauuutttoooaaannntttiiibbbooodddyyy...Percentage ofsurvived cellswasdeterminedafter24hrofincubationofcancerandnomalcelllines. Datashownisonerepresentativeofthreeexperimentsperformed.
F
FFiiiggg555...RRReelellaaatttiiivvveeecccyyytttoootttoooxxxiiiccceeeffffffeeecccttotoofffGGG111---555aaannndddnnnooommmaaallmlmmooouuussseeeIIIggGgGG ooonnnHHHLLL666000 c
cceeellllllllliniinneee...HL60cellsweretreatedwith6.6X10-6M (1mg/ml)ofG1-5ornomal IgG for24h.ThecellsurvivalwasdeterminedbyanCCK-8assay.
0 0 0 0 2 0 2 02 0 2 0 4 0 4 04 0 4 0 6 0 6 06 0 6 0 8 0 8 08 0 8 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 P e rc e n t o f c e ll s u rv iv a l
Control Nomal mouse IgG G1-5 0 0 0 0 2 0 2 02 0 2 0 4 0 4 04 0 4 0 6 0 6 06 0 6 0 8 0 8 08 0 8 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 P e rc e n t o f c e ll s u rv iv a l
C.항-DNA 자가항체의 DNA 절단 활성 1.Plasmidcleavage(전기영동)
PlasmidDNA pUC18,M13mp18dsDNA 각각 1㎍에 G1-5항체를 처리한 다
음 3시간 동안 반응시켰을 때 시간이 지날수록 supercoiledDNA 양이 감소하고,
opencircular와 linear형태의 DNA의 양이 증가하였다.또한 항체의 반응시간과
농도가 증가할수록 이러한 경향이 증가하였으며,G1-5 Fab fragments만으로도
DNA가 절단되었다 (Fig.6,7).
2.ALONA
먼저 DNA strands의 5‘-end에 digoxigenin이,3’-end에 biotin이 표지되어 있 는 oligonucleotide substrates를 합성하였다 (Fig.8).3‘-end의 biotin을 통하여 platewell에 있는 streptanidin과 결합시킨 ssDNA와 dsDNA에 G1-5항체를 반 응 시켰을 때 2㎍의 G1-5에서 50% 정도의 DNA가 절단되었으며 항체의 농도에 dependent하게 DNA가 절단되었다.하지만 항체의 농도를 8㎍까지 높여 주었을
때는 DNA 절단이 약간 감소하는 경향이 나타났으며,ssDNA의 경우 d(A)보다
F
FFiiiggg 666...CClClleeeaaavvvaaaggegee ooofffsssuuuppepeerrrcccooollliiieededd pppUUUCCC11188 D8DDNNNAAA ooorrr MMM111333mmmppp111888 ddsdssDDDNNNAAA bbbyyy G
GG111---555IIIgggGGG aaannnddd GGG111---555FFaFaabbb fffrrraaagggmmmeeennntttsss...Supercoiled plasmid pUC18,M13mp18 dsDNA (1㎍)wasincubatedfor3hourswithoutantibodies(lane1,4),orwith G1-5IgG (0.1mg/ml)(lane2,5),orwithG1-5Fab(lane3,6).
pUC1 8 Cont rol G1-5 IgG G1-5 Fab M13m p18 Cont rol G1-5 IgG G1-5 Fab SC OC cleaved uncleaved pUC1 8 Cont rol G1-5 IgG G1-5 Fab M13m p18 Cont rol G1-5 IgG G1-5 Fab SC OC cleaved uncleaved
F
FFiiiggg 777... CCCllleeeaaavvvaaagggeee ooofff ppUpUUCCC111888 aaanndndd MMM111333mmmppp111888 dddsssDDDNNNAAA bbbyyy vvvaaarrriiiooouuusss c
ccooonnnccceeennntttrrraaatttiiiooonnnssasaannndddvvvaararriiiooouususstttiiimmmeeesssooofffGGG111---555...pUC18(lanes1-5),orM13mp18 dsDNA(1ug)(lanes 6-10)was incubated for3h with 0.03 (lanes 2 and 7), 0.05(lanes3,8),0.1(lanes4,9),and0.3(lanes5and10)mg/mlG1-5.
pUC18DNA wasincubated 1,3,6or16hourswith G1-5(lane11,12,13, 14).
pUC18 M13mp18 dsDNA pUC18
OC L SC M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 11 12 13 14 11 12 13 14 11 12 13 14
pUC18 M13mp18 dsDNA pUC18
OC L SC OC L SC M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 11 12 13 14 11 12 13 14 11 12 13 14
F
FFiiiggg 888...(((AA)A)),,,(((BBB)))DDDNNNAAA ssseeeqqquuueeennncceceesssooofffttthhheeessisiinnngggllleee--s-sstttrrraaannndddeeedd sdssuuubbbssstttrrraaattteeesssuuussseeeddd... Eachsubstratewaslabeledwithbiotinatthe3'-endandwithdigoxigeninat the5'-end ofsamestrand.(C)DNA sequencesofthecorresponding labeled double-strandedoligonucleotidesusedinthisstudy.
A. d(A)40 5’ DIG - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- B 3' B. d(T)40 5' DIG - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT- B 3' C. d(A):d(T)40 5' DIG - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA - B 3' 3' HO - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT - OH 5' A. d(A)40 5’ DIG - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- B 3' B. d(T)40 5' DIG - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT- B 3' C. d(A):d(T)40 5' DIG - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA - B 3' 3' HO - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT - OH 5'
A LO NA A LO NAA LO NA A LO NA 0 0 0 0 0.5 0.50.5 0.5 1 1 1 1 1.5 1.51.5 1.5 2 2 2 2 d( A) d( A) d( A) d( A) d( T)d( T)d( T)d( T) d( A) ( T)d( A) ( T)d( A) ( T)d( A) ( T) Ol i go Ol i go Ol i go Ol i go O . D 4 0 5 n m O . D 4 0 5 n m O . D 4 0 5 n m O . D 4 0 5 n m Bu f f e r Bu f f e r Bu f f e r Bu f f e r 0.5 u g 0.5 u g 0.5 u g 0.5 u g 1 u g 1 u g 1 u g 1 u g 2 u g 2 u g 2 u g 2 u g 4 u g 4 u g 4 u g 4 u g 8 u g 8 u g 8 u g 8 u g Dn a s e I Dn a s e I Dn a s e I Dn a s e I S 1 n u c l e a s e S 1 n u c l e a s e S 1 n u c l e a s e S 1 n u c l e a s e A LO NA A LO NAA LO NA A LO NA 0 00 0 20 20 20 20 40 40 40 40 60 60 60 60 80 80 80 80 100 100 100 100 0.5u g 0.5u g 0.5u g 0.5u g 1 u g1 u g1 u g1 u g 2 u g2 u g2 u g2 u g 4 u g4 u g4 u g4 u g 8 u g8 u g8 u g8 u g c o n c e n t r a t i o n o f G 1-5 c o n c e n t r a t i o n o f G 1-5c o n c e n t r a t i o n o f G 1-5 c o n c e n t r a t i o n o f G 1-5 % o f c le a v a g e % o f c le a v a g e % o f c le a v a g e % o f c le a v a g e d (A ) d (A )d (A ) d (A ) d (T ) d (T )d (T ) d (T ) d (A )(T ) d (A )(T )d (A )(T ) d (A )(T ) F FFiiiggg 999...TTThhheee AALALLOOONNNAAA mmmiiicccrrrooottitiittteeerr araassssssaaayy oy oofff GGG111---555...The labeled single- or double-stranded oligonucleotide substrate was immobilized on a streptavidin-coated microtiter plate.The nuclease reaction was allowed to proceed in the substrate-coated wells.The remaining uncleaved DNA was quantified by digoxigenin detection."AP" and "pNPP" indicate the alkaline phosphatase and the p-nitrophenyl phosphate substrate, respectively. Oligonucleotide d(A),d(T) ord(A)․(T) was incubated with various
D.항-DNA 자가항체로 유도되는 세포사멸의 메카니즘 분석 1.DNA fragmentation
Apoptosis가 발생하는 세포에서는 Ca 또는 Mg dependent한
endonuclease가 활성화되면서 활성화된 endonuclease에 의해 DNA가 절단되어
180basepair의 ladderpattern이 나타나게 된다.HL60에 G1-5항체 1mg/ml을
24시간 동안 처리하고 세포의 DNA를 추출하여 agarosegel에 전기영동을 한 결
과 DNA ladder의 size를 명확히 구분할 수는 없지만 DNA laddering 양상이 일
어났다 (Fig.10).또한 세포의 apoptosis를 확인하기 위해서 phase-contrast
microscopy로 형태학적인 변화를 보았을 때도 apoptosis의 특징과 유사한 수축된
형태를 확인 할 수 있었다 (Fig.11).
2.Caspase3활성 여부와 PARP 절단 확인을 위한 Immunoblotting
HL60에 1mg/mlG1-5,0.5㎍/ml의 TRAIL을 처리 하고 48시간 동안 반응 시
킨 후 세포의 lysates을 얻어 anti-caspase 3,anti-PARP를 이용하여 western
blotting을 수행 한 결과 G1-5를 처리한 경우 procaspase3의 양이 감소하였으며
116kDa의 PARP가 85kDa으로 잘린 것을 확인하였다 (Fig.12).이때 양성대조군
인 TRAIL을 처리한 세포에서도 이러한 현상이 뚜렷이 나타났다.β-actin의 양을
1 2 3
F
FFiiiggg111000...DDDNNNAAA fffrrraaagggmmmeeennntttaaatttiiiooonnnooofffGGG111---55A5AAbbbtttrrreeeaatatteeedddccceeellllllsss... HL60cellswere incubatedfor24hinthepresenceofmedium alone(lane1),1mg/mlofG1-5 (lane2),or100ng/mlofTNF-α (lane3).
A AA... BBB... C CC... DDD... F FFiiiggg...111111..C.CCeeelllllldddeeeaaattthhh ooofffcccaaannnccceeerrr ccceeellllllllliiinnneeesss HHHLLL666000 aaannnddd LLL999222999 tttrrriiiggggggeeerrreeeddd bbbyyy G
GG111---555...Phase-contrastmicroscopy ofHL60 cells without(A)orwith G1-5 (B).Phase-contrastmicroscopyofL929cellswithout(C)orwithG1-5(D).
F
FFiiiggg...111222 CCCaaassspppaaassseee 333 aaaccctttiiivvvaaatttiiiooonnn iiinnn HHHLLL666000 ccceeellllllsss tttrrreeeaaattteeeddd wwwiiittthhh GG1G11---555 aaannnddd T
TTRRRAAAIIILLL...Cellsweretreated with 1mg/mlG1-5(lane2),TRAIL (lane3)for 24hr.CellswerelysedinLaemmli'ssamplebuffer.Samplenomalizedfortotal protein content were separated by SDS-PAGE, electroblotted onto nitrocelluloseandimmunostainedwitheachantibody.
Procaspase 3 (32kDa) (control) G1-5 (1mg/ml) TRAIL(10-3) b-actin (42kDa) Intact PARP Cleaved PARP Procaspase 3 (32kDa) (control) G1-5 (1mg/ml) TRAIL(10-3) b-actin (42kDa) b-actin (42kDa) Intact PARP Cleaved PARP Intact PARP Cleaved PARP
E.항-DNA 자가항체의 세포 표면 결합과 세포질 혹은 핵의 localization분석 1.항체의 세포막 결합
HL60세포에 G1-5항체와 nomalIgG를 0.5,1,5,50㎍/ml농도별로 처리 한
다음 FITC-labeld anti-mouse IgG를 반응시킨 다음 FACS로 분석하였을 때
G1-5의 농도에 dependent하게 세포막에 결합이 증가하였으며 nomalIgG 또한
5ug/ml의 농도에서 90% 이상 결합하였다 (Fig.13).또한 항체의 세포막 결합을
보기위하여 FluoresenceEx-protein labeled G1-5를 L929cells에 50㎍/ml로 처 리하여 4℃에서 3시간 동안 반응 시킨 후 형광 현미경으로 관찰하였을 때 세포
막에 항체가 결합하는 것을 확인하였다 (Fig.15).
2.항체의 cellentryandnuclearlocalization
HL60세포에 fluorescein-Ex labeledG1-5와 nomalIgG를 0.5,1,5,50㎍/ml 로 37℃에서 2시간 처리한 다음 FACS로 분석하였다.항체의 농도에 dependent
하게 항체가 세포 안으로 들어가는 비율이 증가했으며 nomalIgG 또한 0.5㎍/ml
에서 90% 이상이 세포 안으로 들어갔다 (Fig.14).
항체가 세포 안으로 들어가 핵 안까지 들어가는지를 확인하기 위해 G1-5를 Rhodamin Red-X 로 labeling하여 L929세포에 50㎍/ml로 처리하여 현미경으로 관찰하였다.항체를 반응 시킨 후 10분 정도에는 항체가 세포막 표면 쪽에 위치 하다가 2시간이 지났을 때는 항체의 대부분이 세포의 세포질이나 핵에 존재한
3.G1-5염기서열 분석
본 연구실에서는 GenBank Data Base와 V-Base,DNA plot등을 이용하여
G1-5의 염기서열을 분석 한 바 있다.(Park et al,2001) 그 결과 Nuclear
localizing signals일 것으로 추측되어지는 tyrosine, lysine, arginine 경쇄의
F
FFiiiggg 111333... CCCeeellllllsssuuurrrfffaaaccceeebbbiiinnnddidiinnnggg ooofffvvvaararriiiooouuussscccooonnnccc...ooofffGGG11-1--555ooorrrnnnooommamaalllmmmooouuussseee I
IIgggGGG...Afterincubation ofHL60celllinewith G1-5ornomalmouseIgG for 1h at 4℃, cells were harvested, washed extensively, and fixed. Bound antibody was detected with FITC-conjugated anti-mouse IgG by flow cytometer.HL60cellsincubated with FITC-antimouseIgG alonewereused ascontrol.
cellsurfacebindingofG1-5orNomalIgG (%)
concentration 0㎍/ml 0.5㎍/ml 1㎍/ml 5㎍/ml 50㎍/ml
G1-5 0 82.45 95.48 97.03 97.17
F
FFiiiggg 111444...IImImmmmmuuunnnooollloooccacaallliiizzzaaatttiiiooonnn ooofff iiinnntteteerrrnnnaaallliiizezzeeddd vvvaaarrriiioououusss cccooonnnccc...ooofff GGG111---555 ooorrr n
nnooorrrmmmaaalll mmmooouususseee IIIggGgGG... HL60 cells were cultured in the presence of fluorescein-EX labeled G1-5 or nomalIgG at 37℃ for 2h.Analysis was performed by flow cytometer.Cellsincubated with PBS alonewereused as control.
InternalizationofG1-5orNomalIgG (%)
concentration 0㎍/ml 0.5㎍/ml 1㎍/ml 5㎍/ml 50㎍/ml
G1-5 0 9.08 24.12 59.55 95.7
F
FFiiiggg... 11155.5.. BBBiiinnndddiiinngngg ooofff GGG111---555 ooonnn ttthhheee ccceeellllll sssuuurrrfffaaaccceee ooofff LL9L99222999 ccceeellll llllliiinnneee... Fluorescence microscopy of cells treated with 50㎍/㎖ of fluorescein-Ex labeledG1-5at37℃ for2hisshown.(magnificationof20X10)
1
11000mmmiiinnn 222hhhrrr
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relativelyhighnumberoftyrosineandpositively chargedaminoacid(lysine andarginine).
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Ⅳ
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고 찰
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찰
본 연구에서는 자가 면역 질환 특히,전신성 홍반성 낭창 (SLE)과 관련된
kidney damage등의 병리학적 기전에 중요한 역할을 하는 항-DNA 자가항체의
여러 특성들을 규명하고자,본 연구자 소속 연구실에서 이미 하이브리도마 기술 (hybridoma technology)를 이용하여 MRL-lpr/lpr생쥐로부터 항-DNA 자가항 체를 생산하는 세포주를 만들었다.항체를 대량으로 생산 및 정제하여 고농도의
항체를 얻은 다음 SDS-PAGE로 size를 확인하고 dsDNA와의 결합 활성을 측정
하여 정제가 잘 되었음을 확인한 후 실험을 진행하였다.항-DNA 자가항체인 G1-5를 plasmid와 반응을 시켰을 때 supercoiledplasmidDNA의 양이 감소하였
고 circular,linear형태의 DNA의 양이 증가하는 것으로 보아 항-DNA 자가항체
가 DNA 절단 활성을 가진 것을 확인하였으며,IgG 형태의 G1-5에 비해서는 낮 지만 G1-5의 Fab만으로도 DNA가 절단됨을 확인하였다.또한 ALONA 방법을 이용하여 DNA 절단 활성을 관찰하였다. G1-5 항체가 농도에 의존적으로 dsDNA,ssDNA를 모두 50% 정도까지 절단시켰다.이렇게 DNA 절단활성을 보 였던 G1-5항체를 이용하여 세포독성을 분석하였다.그 결과 항체농도에 의존적 으로 세포독성이 증가 하였으며,1mg/ml의 농도를 HL60세포에 처리 하였을 때 가장 높은 세포독성이 나타났다.반면 Hela세포는 같은 농도의 G1-5처리에서 가장 낮은 세포독성이 나타났다.정상 세포주에 대한 G1-5의 세포독성은 MLg 에서는 암세포주에 비해 상당히 낮은 세포독성을 가지고 있었지만,L-M 에서는 HL60와 L929에 비하여는 매우 낮지만,Jurkat과 HeLa에서와 거의 같은 수준의 세포독성을 보였다.따라서 G1-5가 세포독성을 갖는 것은 확실하지만 정상세포 보다 암세포를 더 높은 비율로 죽이는지는 명확하지 않다.DNA-절단 활성을 갖
는 항체는 대부분 세포독성과 깊은 연관성을 가지고 있다고 알려져 있는데, G1-5 항체에서도 두 가지 성격을 모두 가지고 있음을 확인하였다.다음은 DNA-절단 활성을 띄는 G1-5가 어떤 기작에 의해 세포사멸을 유도하는지를 분
석하고자 하였다.G1-5를 HL60세포에 처리하였을 때 apoptosis의 전형적인 특
징인 internucleosomalDNA fragmentation양상이 나타났으며 위상차 현미경으로 관찰하였을 때 세포의 밀도가 현저히 감소하였고 세포가 수축되었음을 확인하였
으며,Immuno blotting으로 caspase 3가 활성화되어 PARP가 절단됨을 확인할
수 있었다.이로써 항-DNA 자가항체 G1-5에 의해 apoptosis가 유도된다는 것을
제시할 수 있다.이러한 G1-5는 세포 표면 막과 결합하고 세포내로 들어가서 대
부분의 항체는 세포질에 위치하였으나 일부의 항체가 핵 내에 존재함을 Flow
cytometry와 형광현미경을 통해 관찰하였다.최근에 보고된 바에 의하면 Nuclear
localizing항-DNA 자가항체들은 CDR3부분에 tyrosine과 양전하를 띄는 lysine,
arginine이 상대적으로 많이 포함되어 있다고 알려져 있다.(Ternynck etal,
1998)G1-5또한 CDR 1,2,3에 tyrosine,lysine,arginine이 포함되어 있었으며 특
히 CDR에 높은 빈도로 나타났다 (Fig.17).이러한 amino acid들이 nuclear
localizing signals의 역할을 할 수 있을 것으로 생각되어 진다.이 가능성은
site-directed mutagenesis등의 연구로 밝혀질 수 있을 것이다.핵 내로 들어간
항체는 세포의 성장과 증식을 강화하거나 반대로 세포사멸과 apoptosis를 유도한
다고 보고된 바 있는데,G1-5항체는 세포내로 들어가서 DNA를 절단하고 세포
사멸을 일으켰다.앞으로의 실험에서는 항체로 유도되는 apoptosis의 기작을 좀
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ.
.
.결
결
결
론
론
론
SLE 환자의 혈청에서 발견되는 일부의 항-DNA 자가항체들은 DNA 절단 활 성과 세포독성을 가지고 있으며,이러한 특징을 갖는 항체들은 세포내의 핵으로 들어가서 DNA를 분해시켜 apoptosis를 일으킬 수 있으며 자가 면역질환과 자가 항체가 관련하는 여러 타 질환의 유발에 있어서 연관성을 가질 수 있을 것이라 고 생각되어진다. 본 연구는 catalyticandcytotoxicantibody의 작용 기전을 더 심도있게 밝히는데 이바 지 할 것이며,자가 면역질환과 동맥경화,암,천식 등,자가 항체가 관련하는 질환의 유 발에 있어서의 항-DNA 자가 항체의 역할과 질병 유발 기전을 더욱 명확히 규명할 수 있을 것이며,catalyticantibody를 이용한 치료용 혹은 진단용 항체의 연구개발 분야에 기초적인 바탕을 제공할 수 있을 것이다.
참
참
참고
고
고문
문
문헌
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ABSTRACT
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LeeEun-JungDepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity
(SupervisedbyAssociateProfessorYoung-JuJang) P
PPuuurrrpppooossseee : Anti-DNA autoantibodies play an important role in the pathogenesisofsystemiclupuserythematosus(SLE).However,theirpotential targets and pathologicalrole in the disease remain to be clearly elucidated. We firsttried to explore the details ofthe DNA-hydrolyzing activity,and cytotoxicity ofthe antibodies in normaland cancercelllines.Secondly,We tried to explore whether cell killing by the antibodies occurs through apoptosis,andwhatmechanism couldbeinvolvedincytotoxicity.
M
reactive with DNA from MRL-lpr/lpr mice by hybridoma technology.The anti-DNA autoantibodies were purified by protein G affiity chromatography. Endonucleaseactivity wasmeasuredby supercoiledplasmidcleavageandthe ALONA(affinity-linked oligonucleotide nuclease assay).Cytotoxicity analysis was performed using CCK-8.DNA fragmentation was analyzed by agarose gelelectrophoresis.Activation levelofcaspase-3and PARP weredetermined by Western blotting.Analysis ofanti-DNA autoantibody internalization and cell surface binding was performed using flow cytometry and immunofluorescencemicroscopy.
R
RReeesssuuulllttstss
:
Thecatalyticactivity and cytotoxicity ofanti-DNA autoantibody were measured.Anti-DNA autoantibody,G1-5 transformed the supercoiled form into open circularand linearforms ofthe plasmid DNA.G1-5 Ab catalyed the hydrolysis of both ss- and dsDNA.G1-5 exerted cytotoxic effectonallfourcancercelllinestested,andHL60cellsappearedtobemost sensitive to antibody treatment.However,G1-5 showed a relatively lower cytotoxicity on normalcelllines,especially MLg cellline.NomalmouseIgG did not have the cytotoxic effect on cancer cell lines although it was localized insidecells.Internucleosomalfragmentation ofDNA wasshown in the cells treated with G1-5. G1-5 bound and penetrated cells with dose-dependent manner. Nomal mouse IgG also showed binding and internalizationofcells.C
CCooonnncccllluuusssiiiooonnn :Anti-DNA autoantibody isolated from mice with autoimmune diseasedisplayedcytotoxicitytowordthetumorcelllinesHL-60,L929,Jurkat andHela,andL-M nomalcells.TheDNA-hydrolyzing activityandcytotoxic activity oftheanti-DNA antibody coexisted.TheDNA-hydrolyzing antibody could penetrate into the celland nucleus ofthe targetcell,butsubstantial quantities ofantibodies are found in the cytoplasm.We suggestthatupon entering the cells,G1-5 may localize to the nucleus,resulting in DNA cleavageandapoptoticcelldeath.However,itmay bealsopossiblethatthe antibody trigger signaltransduction pathway upon binding cellmembrane, leading to apoptosis. Further elucitidation of the DNA-hydrolyzing and cytotoxicactivity ofanti-DNA antibodieswillleadtoabetterunderstanding ofthepathogenesisofautoimmunediseasesuchasSLE.
Key words : Anti-DNA autoantibody, DNA hydrolyzing activity, Cytotoxicity,SLE
