이학 석사학위 논문
한국인 전신성 홍반성 루푸스에서
Fc
g 수용체 유전자들의 다형성
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
김 건 영
한국인 전신성 홍반성 루푸스에서
Fc
g 수용체 유전자들의 다형성
지도교수 서 창 희
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2010년 8월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
김 건 영
김건영의 이학 석사학위 논문을 인준함.
심사위원장 서 창 희 인
심 사 위 원 박 선 인
심 사 위 원 김 승 현 인
아 주 대 학 교 대 학 원
2010년 6월 25일
국문 요약
-한국인 전신성 홍반성 루푸스에서 Fc
g
수용체 유전자들의
다형성
목적 :전신성 홍반성 루푸스(이하 루푸스)는 면역학적 관용의 소실에 의해 다양 한 자가 항체가 생성이 되어 면역복합체를 형성하며 여러 조직 특히 심장혈관계, 근골격계,신장,피부,혈액 등에 만성적인 염증에 유발하여 피부발진,관절염,백 혈구 감소증,신장염 등의 임상증상을 유발하는 전신적인 자가 면역 질환이다. Fcg 수용체들은 면역세포의 항원-항체 상호작용을 용이하게 하는 조혈세포표면 의 당단백이고 면역글로불린 G(IgG)의 수용체로 그 구조와 기능이 다양하며 Fcg 수용체의 대립형질 변이가 단핵탐식구의 기능을 변경시켜 면역 복합체 매개성 질환의 유발에 중요한 역할을 한다.특히 기존의 연구들은 거의 서양인을 대상으 로 한 연구인데,인종에 따라 유전자의 발병에서의 역할에 차이가 있을 수 있고, 한국인 루푸스의 발병에 관여하는 유전자는 서양인과 다를 수 있으므로 한국인 을 대상으로 한 유전자 연구가 매우 필요하다고 할 수 있겠다.이에 본 연구자는 한국인 루푸스에서 Fcg 수용체 유전자들의 다형성을 확인하여,Fcg 수용체 유전 자들의 발현이상이 루푸스의 병인기전과 표현형에도 관여하는 지 밝히고자 한다. 재료 및 방법 :아주대학교병원 류마티스내과에서 진단받은 한국인 루푸스 환자 297명과 정상 대조군 300명을 선별하여 혈액을 채취하였다.수집한 혈액에서 DNA를 추출하였고 Fcg 수용체 ⅡA 유전자와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자는 루푸스 환자 40명과 정상대조군 40명으로 직접염기서열분석을 실시하여 유전자 다형성 을 확인하여 Fcg 수용체 ⅡB 유전자에서 2.3 kb 정도의 크기인 exon5 부위와 intron5부위에서 유의한 결과를 보인 유전자 다형성을 확인하였다.이후 루푸스 환자 257명과 정상 대조군 260명의 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성을 추가적으 로 확인하였다.결과 :루푸스 환자 297명의 평균 나이는 34.5±12.4세,정상 대조군 300명의 평균 나이는 26.4±5.3세로 루푸스 환자에서 더 높게 나타났고,여성의 비율은 루푸스 환자에게서 86.5%,정상 대조군에서 66.7%로 루푸스 환자에서 여성의 비율이 더 높았다.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사 조절부위의 -433T>C과 exon4부위의 4526A>G에서 다형성의 유전자를 확인하였지만 루푸스 환자군과 정상 대조군을 비교하였을때 유의한 차이를 나타내지 않았다.Fcg 수용체 ⅡB 유전자에서는 exon5 부위의 10849 T>C (rs1050501) 과 intron5 부위의 10950 T>G (rs6666965)와 11045G>T (rs12117530)에서 다형성의 유전자형을 확인하였다.루 푸스 환자군과 정상 대조군을 비교하였을 때 10849T>C는 TT 유전자형이 루푸 스 환자에서 높게 나타났지만 (codominantand recessiveanlaysis,p=0.008and
p=0.014,respectively)10950T>G와 11045G>T는 유의한 결과를 나타내지 않았 다.루푸스 환자에 있어서 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 단일염기다형성의 유전자형 과 여러 임상적 특징과의 상관관계를 분석하여 Intron5부위의 11045G>T 다형 성에서 백혈구감소증(leukopenia)의 빈도는 GG 혹은 GT 유전자형을 가지고 있 을 때의 양성률 55.1%보다 TT유전자형을 가지고 있을 때의 양성률 70.2%가 더 높게 나타났고,이때 두 그룹간의 pvalue는 0.039로 유의한 차이를 보였다. 결론 :한국인에서 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성 (10849T>C,10950T>G, 11045 G>T)은 루푸스의 감수성(10849 T>C)과 임상증상의 발현(11045G>T)에 연관을 보였다.하지만,Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 다형성 (-433 T>C,4526 A>G)은 루푸스의 발병 및 임상양상과는 관련이 없었다. 핵심어 :전신성 홍반성 루푸스,Fcg 수용체 ⅡA 유전자,Fcg 수용체 ⅡB 유전자,단일염기다형성
차례
국문요약 ···ⅰ 차 례 ···ⅳ 그림차례 ···ⅵ 표 차례 ···ⅶ Ⅰ.서 론 ···1 Ⅱ.재료 및 방법 ··· 5A.대상 환자군의 선별과 genomicDNA 준비 ···5
1.루푸스 환자군과 대조군 ···5
2.환자군과 대조군으로부터 채혈 ··· 5
3.Genomic DNA 추출 ··· 5
B.단일염기다형성 탐색 ···5 1.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4부위에서 다형성의 유전자형 탐색 ···5 2.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5와 intorn5부위에서 다형성의 유전자형 탐색 ···6 C.단일염기다형성의 유전자형 결정 ···7 1.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4,그리고 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5와 intorn5부위에서 다형성의 유전자형 결정 ····7 E.통계분석 ···8 Ⅲ.결 과 ··· 9 A.Fcg 수용체 ⅡA 유전자와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성 확인 ···
9
1.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4부위에서 다형성의 유전자형 확인 ···9 2.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위와 intron5부위에서 다형성의 유전자형 확인 ···103.Fcg 수용체 ⅡA 유전자와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성 통계분석 ···10 B.다형성의 유전자형 결정 ··· 11 1.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위와 intron5부위에서 다형성의 유전자형 결정 ···11 C.루푸스 환자군과 정상 대조군의 임상적 특징 ···15 D.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 단일염기다형성의 유전자형과 임상적 특징과의 상관관계 ···17 Ⅳ.고 찰 ···19 Ⅴ.결 론 ··· 22 참고 문헌 ···23 영문요약 ···30
그림 차례
Fig.1.SchematicrepresentationoftheFcg receptorⅡA gene.···9
표 차례
Table1.Thegenotypeandallelefrequenciesofpolymorphism inthepromoter andexon4regionofFcg receptorⅡA gene···12
Table 2.The genotype and allele frequencies ofpolymorphism in the exon5 and intron5 region ofFcg receptorⅡB gene (40 SLE patients and 40NC)···13
Table 3.The genotype and allele frequencies ofpolymorphism in the exon5 and intron5region ofFcg receptorⅡB gene(297SLE patientsand 300NC)···14
Table4.Comparisonoftheclinicalcharacteristicsoflupuspatients···16
Table5.Comparison oftheclinicalcharacteristicsaccording to thegenotype ofFcg receptorⅡB geneinlupuspatients···18
Ⅰ.서 론
전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus,SLE,이하 루푸 스)는 면역학적 관용의 소실에 의해서 다양한 자가 항체가 형성되며,여러 조직 에서 만성적인 염증을 유발하여 피부발진,관절염,혈구 감소증,신장염 등의 다 양한 임상증상을 나타내는 전신적인 자가 면역 질환이다. 루푸스는 주로 15세에서 40세의 가임기 여성에서 발병하고,유병율은 남 성보다 여성이 8∼ 13배 정도 높고 젊은 여성일수록 폐경기의 여성보다 2배정 도로 높은 양상을 보인다.인종적으로는 동양인과 흑인에서의 빈도가 백인에서의 빈도보다 좀 더 높은 것으로 보고되고 있다 (Lipsky,2001;Kotzin,1996). 루푸스가 발병하는 정확한 원인이나 발병 기전은 아직 밝혀지지는 않았으 나,어떤 유전적 소인을 가지고 있는 사람에서 감염,자외선,호르몬,약물 등의 환경적인 요인의 작용에 의해 비정상적으로 림프구들이 활성화되고,사이토카인 (cytokine)등이 분비되어 자가 항체들과 혈중 면역 복합체를 형성하여 다양한 장 기들에 손상을 주어 임상증상이 나타나는 것으로 생각 되고 있다 (Robson과 Walport,2001;Marshall,2002;Mok와 Lau,2003).
{루푸스의 원인 중 유전적인 요인을 보면,루푸스 환자의 10% 이내에서 환자의 가족이 루푸스를 이미 앓고 있거나 앞으로 발병할 가능성이 있는 것으로 알려져 있고,루푸스가 일란성 쌍둥이에서 24%의 빈도로,이란성 쌍둥이에서 2% 의 빈도로 발생한다는 보고가 있다 (Kotzin,1996).또한 어떠한 유전자가 루푸스 의 병인 기전과 관련이 있는지 모두 밝혀지지는 않았으나 지금까지의 여러 연구 결과를 보면 주조직적합복합체(majorhistocompatibility complex,MHC),Fcg 수 용체,C-반응 단백(C-reactive protein,CRP),인터페론 조절인자 5(interferon regulatory factor 5,IRF 5),PCDC-1 (programmed celldeath 1),STAT4 (signaltransducerand activatoroftranscription 4),그리고 ITGAM (integrin alphaM)등의 약 40-50개의 유전자 다형성이 루푸스와 관련이 있다고 보고되었 고,이러한 연구들은 루푸스가 다양한 유전자와 관계가 있으며,질병 발생 및 감
수성에도 유전적 요인이 크게 작용한다는 것을 의미한다(Rhodes와 Vyse,2008; HarleyI등,2009). Fcg 수용체들은 면역세포의 항원-항체 반응을 용이하게 하는 조혈세포표 면의 당단백 집단이고 면역글로불린 G (IgG)의 수용체로 작용하며 그 구조와 기 능이 다양하다.Fcg 수용체 유전자의 대립형질 차이는 면역글로불린 면역 복합체 에 의한 단세포의 포식작용의 효율에 변화를 주어 루푸스에 대한 민감성과 면역 복합체 매개성 조직손상에 영향을 준다 (Brown E.등,2007).이 수용체들은 유 전자 1q21과 23사이에 위치하고 있으며 식세포작용,항체의존성 세포내 세포독 성,사이토카인 (cytokine)과 케모카인 (chemokine)발현의 전사조절,B 세포의 활성화와 면역복합체 제거 등의 역할을 한다 (Lisette등,2006).현재까지 연구되 어진 모든 종의 포유류에서 4개의 서로 다른 Fcg 수용체가 있다는 것이 밝혀졌 고 이 유전자들은 유전자의 위치와 구조에 따라 각각 Fcg 수용체 Ⅰ,Fcg 수용체 Ⅱ,Fcg 수용체 Ⅲ,Fcg 수용체 Ⅳ로 명명되어 졌다.Fcg 수용체 Ⅱ는 구조적 아 형으로 Fcg 수용체 ⅡA와 Fcg 수용체 ⅡB,Fcg 수용체 ⅡC가 있다.또한 Fcg 수 용체 Ⅲ도 Fcg 수용체 ⅢA,Fcg 수용체 ⅢB의 아형이 있다 (Kyogoku등,2002; Nimmerjahn,2008). 루푸스 환자에서 감염이 있는 경우에는 류마티스관절염에서처럼 C-반응 단백이 증가 하지만,감염이 없이 루푸스가 활성화 된 경우에는 C-반응 단백이 증가하지 않는 것이 알려져 있으며 한국인에서 동일한 결과를 보고하였다 (Suh 등,2001).또한 한국인 루푸스 환자에서 C-반응 단백 유전자의 다형성에 대한 연구에서 전사조절부위의 -390 C>A/T 다형성에서 루푸스 환자와 정상 대조군 을 간에 통계적으로 유의한 차이를 보였고,각각의 유전자형에 따른 전사조절부 위 활성을 비교하였을 때 루푸스 위험 유전자를 가지고 있을 때 전사조절부위 활성이 유의하게 증가되어 있음을 보고하였다 (Kim 등,2009).C-반응 단백은 대식세포나 호중구,호산구,자연살해세포 등에 존재하는 Fcg 수용체와 결합하여 식세포작용의 활성화와 항체 의존세포의 세포독성에 영향을 주고 B 세포에 있는 Fcg 수용체 ⅡB와 결합하면 B 세포의 활성을 저해시킨다 (Stein MP 등,2000;
Ravetch,2005).루푸스 유사질환 생쥐에서 C-반응 단백의 농도가 증가하면 대식 세포 표면의 Fcg 수용체Ⅰ과 C-반응 단백의 결합율과 대식세포의 활성이 증가한 다는 결과가 보고되었다 (Bodam-SmithKB,2002;Ryu등,2007). Fcg 수용체의 다형성과 관련하여 많은 질환과 관련한 연구가 진행되었으 며,그 중 Fcg 수용체 ⅡA 4526 A>G (rs1801274)다형성과 Fcg 수용체 ⅡB 10849T>C (rs1050501)다형성에 관련된 보고가 가장 많았다. Fcg 수용체 ⅡA 4526A>G (rs1801274)다형성은 아프리카계 미국인에서 minorallele을 가지고 있을 때 루푸스 환자가 정상 대조군보다 더 높은 빈도수 를 보였으며 신장염에서도 minorallele을 가지고 있을 때 통계적으로 유의한 결 과를 나타내었다.프랑스인 백인에서도 minorallele을 가지고 있을 때 루푸스 환 자가 더 높은 빈도수를 보이며,브라질인 루푸스 환자들에게서는 정상대조군과 비교하였을 때 대립형질이 통계적으로 유의한 결과를 보이진 않았지만 신장염 질환에서는 minor allele을 가졌을 때 더 높은 빈도수를 보였다 (Salmon 등, 1996;Manger등,1998;Michel등,2000;Bazilio등,2004).
Fcg 수용체 ⅡB 10849T>C (rs1050501)다형성은 일본인 루푸스 환자들 에서 정상 대조군에 비해 minor allele이 더 높게 나타났으며 신장염에서도 minorallele을 가지고 있을 때 통계적으로 유의한 결과를 나타내었고,중국인 루 푸스 환자들에서도 minorallele이 더 높게 나타났고 신장염에서도 minorallele을 가지고 있을 때 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다.그러나 스웨덴 루푸스 환 자와 이탈리아 루푸스 환자에서는 정상 대조군 간에 통계적으로 유의한 결과를 보이지 않았다.이런 연구결과들은 Fcg 수용체 ⅡB의 10849T>C (rs1050501)다 형성은 인종간에 차이가 있음을 나타낸다.(Kyogoku 등,2002;Chu 등,2004; Napolioni등,2008;Magnusson 등,2004).뿐만 아니라 Fcg 수용체 ⅡA 유전자 와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성이 루푸스의 발병기전에 관여함을 시사한다.
본 연구의 목적은 한국인 루푸스 환자에서 증가되어있는 양상을 보이는 C-반응 단백의 수용체로 작용하는 Fcg 수용체 다형성에 대하여 이들 각각의 유 전자형을 분석하여 루푸스의 발병기전에서 Fcg 수용체 유전자의 발현이상이 관
Ⅱ.재료 및 방법
A.대상 환자군의 선별과 GenomicDNA 준비 1.루푸스 환자군과 대조군 대상 환자군 으로는 미국 류마티스 학회에서 1982년에 개정한 전신성 홍 반성 루푸스의 진단기준에 최소한 4가지 이상 만족하는 한국인 루푸스 환자 297명을 선별하여 환자의 임상적 특징을 표준화된 양식에 따라 파악하여 데이터 베이스화하여 보관하고 있으며,대조군으로 류마티스 질환의 기왕력이 없는 정상 인 300명을 선별하였다. 2.환자군과 대조군으로부터 채혈 대상 환자 및 정상 대조군들의 채혈은 연구 목적에 대한 설명 및 동의를 구한 후에 시행하였으며,혈액을 채취하여 유전체 연구를 위한 전혈 (whole blood)을 분리하여 -70℃에 보관하였다.
3.GenomicDNA 추출
보관된 환자의 전혈로부터 QuickGeneDNA wholeblood kitS (Fujifilm Lifescience,Tokyo,Japan)를 사용하여 genomicDNA를 분리하였다.전혈 200 ㎕에 30㎕의 protease를 첨가하여 단백질을 제거하였고,200㎕의 lysisbuffer사 용하여 백혈구를 lysis 시켰다. 이어서 QuickGene-Mini 80 (Fujifilm Life science,Tokyo,Japan)을 사용하여 70% ethanol로 세척후 멸균한 3차 증류수로 녹여 -20℃에 보관하였다.
B.단일 염기다형성 탐색
1.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4부위에서 다형성의 유전 자형 탐색
NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 보고 되어있는 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 염기 서열을 통해서 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4 부위에 각각 forwardprimer1개와 reverseprimer1개씩을 디자인하였다.
Promotor
Forwardprimer1:5'CTTGCAGTTTCAGTGGGAGA 3' Reverseprimer1:5'CCAGCTTGTGTCCTTGTGAA 3'
Exon4
Forwardprimer2:5'CCACAAAAACTGACGGCTTC 3' Reverseprimer2:5'GCCCTGTTTGTGTGCTGTTA 3'
이 primer를 사용하여 루푸스 환자와 정상 대조군 각각 40개의 genomic DNA 시료를 대상으로 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction,PCR)을 시행하였다.이 때 Ex-Tag(Takara.,Shiga,Japan)을 사용하여 전사조절부위 약 0.9kb와 exon4 부위 약 1.7kb를 증폭하였고, 중합효소연쇄반응 산물은 1% agarose를 사용하여 전기영동을 시행하였다.이후 증폭된 Fcg 수용체 ⅡA 유전 자의 전사조절부위와 exon4는 EZ-10 Spin Column DNA GelExtraction Kit (BIO BASIC Inc.,Ontario,Canada)를 사용하여 회수하였다.
(B)염기서열 분석
회수된 DNA를 대상으로 직접염기서열분석을 시행하였다 (Bionics Co., Seoul,Korea).분석에는 중합효소연쇄반응에 사용되었던 primer들을 사용하였다.
분석 결과는 Chromas(Technelysium,Tewantin,Australia)프로그램으로 확인하였고 루푸스 환자와 정상 대조군의 염기서열 비교를 위해 MultAlin InterfacePage(INRA,Toulouse,France)프로그램을 사용하였으며 대조서열로 는 NCBI에 보고 되어 있는 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 염기서열이 사용되었다.
2.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5와 intron5부위에서 다형성의 유전자형 탐 색
NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 보고 되어있는 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 염기 서열을 통해서 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5와 intron5부위를 확인하기 위해 intron4부위와 intorn6부위에 각각 forward primer1개와 reverseprimer 1개를 디자인하였다.
Forwardprimer:5'TGGAGAAACCTCGGTAAGCA 3' Reverseprimer:5'TTGGGTGGCCCCTGGTTCTCA 3'
이 primer를 사용하여루푸스 환자와 정상 대조군 각각 40개의 genomic DNA 시료를 대상으로 중합효소연쇄반응을 시행하였다.이 때 Ex-Tag을 사용하 여 intron4와 intron6부위 약 2.3kb를 증폭하였고,중합효소연쇄반응 산물은 1% agarose를 사용하여 전기영동을 시행하였다.이후 증폭된 Fcg 수용체 ⅡB 유전 자의 exon5와 intron5는 EZ-10Spin Column DNA GelExtraction Kit를 사용 하여 회수하였다.
(B)염기서열 분석
회수된 DNA를 대상으로 직접염기서열분석을 시행하였다.분석에는 중합 효소연쇄반응에 사용되었던 primer를 사용하였다.
분석 결과는 Chromas(Technelysium,Tewantin,Australia)프로그램으로 확인하였고 루푸스 환자와 정상 대조군의 염기서열 비교를 위해 MultAlin InterfacePage(INRA,Toulouse,France)프로그램을 사용하였으며 대조서열로 는 NCBI에 보고되어 있는 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 염기서열이 사용되었다. C.단일염기다형성의 유전자형 결정 1.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4,그리고 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5와 intorn5부위에서 다형성의 유전자형 결정 (A)단일염기다형성 확인 염기서열비교 결과 소수 대립유전자의 빈도가 최소 5%이상인 DNA서열을 단일염기다형성으로 규명하고,과거에 루푸스에서 보고된 적이 있었던 다형성인
지는 dbSNP을 이용하여 확인하였다. (B)단일염기다형성 결정 SPSS v11.5(SPSS Inc.,Chicago,USA)통계 프로그램을 사용하여 루푸 스 환자와 정상 대조군간의 유의한 차이를 보인 다형성을 선별하여 추가로 루푸 스 환자 257명과 정상 대조군 각각 260명의 유전자형을 결정하였다. D.통계 분석 단일염기다형성의 분석에서는 분석하고자 하는 모델이 유전되는 형태와 일치하는지가 중요하므로,majorallele의 수에 regression하여 majorallele의 추 가적인 효과를 보는 가정 (codominant)과 majorallele이 minorallele에 우성하 여 유전된다는 가정 (dominant),그리고 majorallele이 minorallele의 열성으로 유전된다는 가정 (recessive)등의 3가지 다른 분석 모델이 사용되었다.우선 각각 의 다형성을 이 3가지 모델로 전환하여,환자군과 대조군 간의 유의성을 확인하 기 위해 독립표본 t-test를 시행하였으며,환자군과 대조군 간의 나이와 성별 차 이를 배제하기 위해 regression을 시행하였다. 또한 다형성의 유전자형에 따른 여러 가지 임상적 특징과 다형성의 dominant와 recessive 모델을 사용하여 t-test를 시행하였다.유전자형 분석 후 HardyWeinberg평형을 조사하였다 (Haploview ver.4.1)
연구 결과의 통계학적 분석은 SPSS v11.5forwindow 를 이용하였고,p 값이 0.05미만인 경우,통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
Ⅲ.결 과
A.Fcg 수용체 ⅡA 유전자와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성 확인 1.Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4부위에서 다형성의 유전자형 확인 루푸스 환자와 정상 대조군 각각 40명의 DNA 시료를 대상으로 Fcg 수용 체 ⅡA 유전자의 직접염기서열분석을 시행하여 NCBI에 보고 되어있는 염기서열 과 다형성을 대조로 비교 분석한 결과-4
3
3 T>C (
r
s
7
5
2
2
7
9
4
)
,4
5
2
6 A>G
(
r
s
1
8
0
1
2
7
4
)
는 minorallele이 5% 이상으로 다형성임을 확인할 수 있었다 (Fig. 1).Fig.1. Schematic representation of the Fcg receptor ⅡA gene.Fcg receptorⅡA consistofseven exonsseparated by a six intronsFilled boxes denotetranslated regions;open boxesuntranslated regions.Arrowsmark the locations of SNPs within Fcg receptor ⅡA locus. Location numbers are relativetotheATG startsite.
2.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위와 intron5부위에서 다형성의 유전자형 확인 루푸스 환자와 정상 대조군 각각 40명의 DNA 시료를 대상으로 Fcg 수용 체 ⅡB 유전자의 직접염기서열분석을 시행하여 NCBI에 보고 되어있는 염기서열 과 다형성을 대조로 비교 분석한 결과 10849
T>C (
r
s
1
0
5
0
5
0
1
)
,1
0
9
5
0 T>G
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6
6
6
6
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)
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1
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4
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r
s
1
2
1
1
7
5
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0
)등 3
개는 minorallele이 5% 이상으로 다형성임을 확인할 수 있었다 (Fig.2).Fig. 2. Schematic representation of the Fcg receptor ⅡB gene.Fcg receptorⅡB consistofeightexonsseparatedby asevenintronsFilledboxes denotetranslated regions;open boxesuntranslated regions.Arrowsmark the locations of SNPs within Fcg receptor ⅡB locus. Location numbers are relativetotheATG startsite.
3. Fcg 수용체 ⅡA 유전자와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성 통계분석 Fcg 수용체 ⅡA 유전자와 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 루푸스 환자와 정상 대
조군 각각 40명의 DNA 시료를 직접염기서열분석하여 루푸스 환자와 정상 대조 군간의 유의성를 보기위해서 먼저 SPSS로 루푸스 환자군과 대조군간의 독립표 본 t-test를 시행한 후,성별과 나이의 차이를 배제하기 위한 regression을 실시 한 결과 Fcg 수용체 ⅡA 유전자는 유의한 차이를 보이지 않았지만 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위의 10849T>C (rs1050501)는 p=0.043(recessivemodel)으로 환자군과 대조군간 유의한 차이를 보였다 (Table1,2). B.다형성의 유전자형 결정 1.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위와 intron5부위에서 다형성의 유전자 형 결정 Fcg 수용체 ⅡB 유전자에서 확인된 다형성의 유전자형을 결정하기 위해 추가적인 루푸스 환자257명과 정상 대조군 260명을 대상으로 염기서열분석을 시 행하였다.루푸스 환자와 정상 대조군간의 유의성를 보기위해서 먼저 SPSS로 실 험군과 대조군간의 독립표본 t-test를 시행한 후,성별과 나이의 차이를 배제하기 위한 regression을 실시한 결과 10849 T>C (rs1050501)는 p=0.008 (co-dominantmodel)과 p=0.043(recessivemodel)로 실험군과 대조군간 유의한 차이를 보였다 (Table3).
SLE NC SLE vs.NC (N=40) (N=40) pvalue OR (95% CI) -433T>C TT 20(50.0%) 21(52.5%) co:0.697 0.814(0.389∼1.702) (rs7522794) TC 16(40.0%) 17(42.5%) do:0.396 0.641(0.263∼1.563) (Promotor) CC 4(10.0%) 2(5.0%) re:0.823 0.965(0.596∼1.560) q. 0.300 0.275 4526A>G AA 22(55.0%) 24(60.0%) co:0.494 0.707(0.346∼1.444) (rs1801274) AG 13(32.5%) 14(35.0%) do:0.235 0.449(0.183∼1.103) (Exon4) GG 5(12.5%) 2(5.0%) re:0.651 0.951(0.589∼1.535) q. 0.288 0.225
Table 1.The genotype and allele frequencies ofpolymorphism in the promoterandexon4region ofFcg receptorⅡA gene.
Each p value was calculated with co-dominant(co),dominant(do),and recessive(re) models.Logistic regression analysis was applied to controlfor age and sex as covariable.q.:minorallelefrequency,SLE;systemiclupuserythematosus,NC;normal control
SLE NC SLE vs.NC (N=40) (N=40) pvalue OR (95% CI) 10849T>C TT 27(67.5%) 18(45.0%) co:0.070 1.846(0.835∼4.079) (rs1050501) TC 12(30.0%) 17(42.5%) do:0.090 2.065(0.668∼6.382) (Exon5) CC 1(2.5%) 5(12.5%) re:0.043 1.352(0.832∼2.195) q. 0.175 0.338 10950 T>G TT 19(47.5%) 21(52.5%) co:0.250 0.662(0.322∼1.361) (rs6666965) TG 14(35.0%) 17(42.5%) do:0.077 0.486(0.205∼1.153) (Intron5) GG 7(17.5%) 2(5.0%) re:0.655 0.899(0.558∼1.450) q. 0.350 0.263 11045 G>T GG 32(80.0%) 37(92.5%) co:0.254 0.483(0.138∼1.688) (rs12117530) GT 7(17.5%) 2(5.0%) do:0.656 1.400(0.319∼6.147) (Intron5) TT 1(2.5%) 1(2.5%) re:0.107 0.540(0.255∼1.142) q. 0.113 0.050
Table 2.The genotype and allele frequencies ofpolymorphism in the exon5 and intron5 region ofFcg receptor ⅡB gene (40 SLE patients and40NC).
Each p value was calculated with co-dominant(co),dominant(do),and recessive(re) models.Logistic regression analysis was applied to controlfor age and sex as covariable.q.:minorallelefrequency,SLE;systemiclupuserythematosus,NC;normal control
SLE NC SLE vs. NC (N=297) (N=300) p value OR (95% CI) 10849 T>C TT 191(64.3%) 156(52.0%) co:0.008 1.512(1.116∼2.047) (rs1050501) TC 95(32.0%) 120(40.0%) do:0.087 1.417(0.950∼2.133) (Exon5) CC 11(3.7%) 24(8.0%) re:0.014 1.260(1.048∼1.515) q. 0.197 0.280 10950 T>G TT 121(40.7%) 132(44.0%) co:0.842 1.048(0.792∼1.388) (rs6666965) TG 144(48.5%) 139(46.3%) do:0.947 1.044(0.770∼1.415) (Intron5) GG 32(10.8%) 29(9.7%) re:0.826 1.025(0.854∼1.231) q. 0.350 0.328 11045 G>T GG 240(80.8%) 256(85.3%) co:0.137 0.716(0.466∼1.101) (rs12117530) GT 52(17.5%) 40(13.3%) do:0.498 0.773(0.371∼1.613) (Intron5) TT 5(1.7%) 4(1.3%) re:0.143 0.829(0.649∼1.058) q. 0.106 0.080
Table 3.The genotype and allele frequencies ofpolymorphism in the exon5 and intron5 region ofFcg receptorⅡB gene (297 SLE patients and300NC).
Each p value was calculated with co-dominant(co),dominant(do),and recessive(re) models.Logistic regression analysis was applied to controlfor age and sex as covariable.q.:minorallelefrequency,SLE;systemiclupuserythematosus,NC;normal control
C.루푸스 환자군과 정상 대조군의 임상적 특징 루푸스의 환자군 297명의 평균 나이는 34.52세,정상 대조군 300명의 평균 나이는 26.38세로 루푸스 환자가 더 높게 나타났다.남여 성비는 루푸스가 주로 여성에게서 주로 발병하는 질환이므로 남성 40명 (13.5%),여성 257명 (86.5%)으 로 여성이 더 많으며,정상 대조군도 남성 100명 (33.3%),여성 200명 (66.7%)로 여성의 비율이 더 많았으나,루푸스 환자군에서 대조군에 비해 여성의 비율이 유 의하게 높았다.루푸스 환자군의 호소하는 증상 및 검사 소견에서 구강궤양 (oral ulcer)은 157례 (52.9%),관절염 (arthritis)은 210례 (70.7%),장막염 (serositis)은 40례 (13.5%),발진 (rash)은 107례 (36.0%),신장염 (nephritis)은 73례 (24.6%), 백혈구감소증 (leukopenia)은 173례 (58.2%),림프구감소증 (lymphopenia)은 266 례 (89.6%),혈소판감소증 (thrombocytopenia)은 45례 (15.2%)있었으며,anti-ds DNA는 199례 (67.0%),anticardiolipin 항체는 142례 (47.8%)에서 양성을 보였다 (Table4).
Characteristics SLE N=297 (%) NC N=300 (%) SLE vs. NC p value Age(year)* 34.52±12.33 26.38±5.31 < 0.001 SEX Male 40 (13.5%) 100 (33.3%) < 0.001 Female 257 (86.5%) 200 (66.7%) Oral ulcer§ 157 (52.9%) NA NA Arthritis§ 210 (70.7%) NA NA Serositis§ 40 (13.5%) NA NA Rash§ 107 (36.0%) NA NA Nephritis§ 73 (24.6%) NA NA Leukopenia§ 173 (58.2%) NA NA Lymphopenia§ 266 (89.6%) NA NA Thrombocytopenia§ 45 (15.2%) NA NA Anti-ds DNA§ 199 (67.0%) NA NA Anticardiolipin Antibody§ 142 (47.8%) NA NA
Table4.Comparison oftheclinicalcharacteristicofthestudy subject
*
Thisvaluewaspresented asmeans±SD.§Thisvaluewaspresentedasnumberof patientspositiveforfeatureorantibody.NA standsforNotApplicable.
D.Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 단일염기다형성의 유전자형과 임상적 특징과의 상관관계 루푸스 환자에 있어서 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 단일염기다형성의 유전자 형과 여러 임상적 특징과의 상관관계를 분석하여 다형성의 유전자형이 임상적으 로 어떠한 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다. 먼저 그룹간의 독립표본 t-test를 시행한 후,성별과 나이의 차이를 배제하 기 위한 regression을 실시하였다.그 결과 11045G>T (rs12117530)다형성에서 는 백혈구감소증의 빈도는 GG 유전자형을 가지고 있을 때 (55.1%)보다 TT 혹 은 TG 유전자형을 가지고 있을 때 (70.2%)가 더 높게 나타났고,이때 두 그룹간 의 pvalue는 0.039로 유의하게 나타났다. 하지만 10950T>G (rs6666965)다형성에서는 여러 임상적 특징과 특별한 상관관계를 나타내지는 않았고 10849 T>C (rs1050501)다형성에서는 백혈구감 소증의 빈도는 TT 유전자형을 가지고 있을 때 (53.4%)보다 TC 혹은 CC 유전 자형을 가지고 있을 때 (67.0%)가 더 높게 나타났고,이때 두 그룹간의 P value 는 0.035 로 나타났지만 유전자형의 빈도와 임상적 특징과의 빈도가 서로 다른 양상을 보여 의미를 부여하기는 어려울 것으로 생각된다 (Table5).
Ⅳ.고 찰
사람의 유전체를 구성하는 30억 개의 DNA 염기 서열 중 0.1% 정도인 300만개 정도의 염기가 사람마다 다른데,이로 인해 인해 피부나 머리카락 색, 눈의 색,키 등이 달라지는 등의 인종간의 차이나 개개인의 유전적 다양성이 발 생하게 된다. 단일염기다형성을 연구하는 것은 단일염기다형성이 존재하여 개개인의 차 이와 질병에 대한 감수성이 차이를 보인다는 것을 가정하여 질병의 감수성이나 치료 반응 등의 차이에 대한 원인을 규명하는 것이 주된 연구내용이다. 현재 단일염기다형성이 연구되는 분야 중 가장 기대되는 분야는 각 개인 의 유전적 조성에 따라 개개인에게 보다 효율적인 치료를 적용하는 맞춤의학이 라 할 수 있다.대부분의 치료와 약물은 평균적인 사람에게 맞추어져 있지만,우 리 인간은 개개인마다 약물 반응을 포함한 여러 가지 면에서 많은 차이를 가지 고 있다.즉,같은 치료 방법이나 같은 약물에 의해서도 각기 다른 유전적 소양 에 따라 그 효능과 효과가 다르게 나타나기도 한다.따라서 단일염기다형성에 대 한 연구를 통하여 특정 기능을 가유전자 정보가 밝혀진다면,다형성의 기능을 응 용한 신약개발이나 개개인에게 보다 효과적인 처방과 치료가 가능하도록 할 것 이며,이것이 단일염기다형성적인 처방과 연구,인간 유전체 사업의 궁극적인 목 적이기도 하다. 루푸스는 인구 1만명당 40∼50명 정도의 빈도를 보이는 대표적인 전신적 인 자가 면역 질환이며,현재까지 연구에 의하면 유전자가 중요한 역할을 할 것 으로 추측하여 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나 구체적으로 어떠한 유 전자가 어떠한 기전으로 발병에 관여하는 지에 대해서는 아직 확실하게 밝혀지 지 않았다.특히 기존의 연구들은 거의 서양인을 대상으로 한 연구인데,인종에 따라 유전자의 발병에서의 역할에 차이가 있을 수 있고,유전자의 단일염기서열 등이 인종마다 다를 수 있으므로 한국인을 대상으로 한 유전자 연구가 매우 필 요하다고 할 수 있겠다.루푸스 환자들에게서 C-반응 단백 (C-reactiveprotein,CRP)이 증가되어 있는 것을 이전의 연구를 통하여 확인하였다.뿐만 아니라 많은 연구를 통하여 C-반응 단백 유전자의 위치가 루푸스와 연관되어 있는 유전자 부위임이 밝혀졌 다 (Nath등,2004;Tsao,2004). 한국인에서 C-반응 단백 유전자 다형성을 확인한 연구에서 전사조절부위 의 C-반응 단백 유전자의 다형성에 대한 연구에서 전사조절부위의 -390C>A/T 다형성에서 루푸스 환자와 정상 대조군을 간에 통계적으로 유의한 차이를 보였 고,전사조절부위의 활성을 확인한 결과 -390 A/T 대립형질을 가지고 있을 때 전사조절부위의 활성이 높아져 있다는 것을 확인하였다(Kim 등,2009).이런 연 구결과는 여러 면역세포의 표면에 존재하면서 C-반응 단백 유전자의 수용체로 작용하는 Fcg 수용체 유전자의 다형성 또한 루푸스의 위험요소로 작용 할 것으 로 추측하여,본 연구자는 한국인 루푸스 환자에서 Fcg 수용체 유전자의 다형성 을 연구하였다. 먼저 가장 많은 보고가 있었던 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4부위에서 직접염기서열분석을 통하여 -433T>C 와 4526A>G 다형성을 확인하였으나,루푸스 환자와 정상 대조군을 비교한 결과 통계적으로 유의한 결 과를 나타내지 않아,한국인 루푸스 환자에서는 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 유전 형적 다형성은 루푸스 질병과의 유전적 연관성이 없는 것이라고 판단되었다.여 러 아시아 인종들에서도 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 유전형적 다형성은 루푸스 질 병과 연관이 없다는 보고가 많았다 (Hatta 등,1999;Yap 등,1999;Yun 등, 2001). Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위 intron5부위에서 직접염기서열분석 을 통하여 10849T>C 와 10950T>G,11045G>T 다형성을 확인하였다.루푸스 환자와 정상 대조군을 비교한 결과 10849T>C의 유전형적 다형성에서만이 통계 적으로 유의한 결과를 나타내었고,따라서 이 유전자의 10849T>C 다형성은 한 국인에서 루푸스 질병과 연관이 있을 것으로 판단되어진다. 이러한 연구결과는 다른 여러 연구 결과에서처럼 루푸스에서 Fcg 수용체
ⅡB 유전자의 다형성 및 그 유전자형에 따라 질병의 활성에도 직접적인 영향을 미치며,Fcg 수용체 ⅡB가 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되어 진 다.특히 10849T>C 다형성에서 루푸스 환자보다 정상 대조군이 minorallele인 C 유전자 빈도가 높은 점을 미루어 보아 T 유전자형을 가지고 있을 때 루푸스 로의 발병 가능성이 높을 것으로 생각되어진다. 이 연구결과 한 가지 흥미로운 점은 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 연구 결과 에서 한국인과 유전자의 서열이 비슷하다고 알려진 일본인과 유전형적 다형성이 다른 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.일본인에서는 10849T>C 다형성 의 minorallele은 루푸스 환자군이 정상 대조군보다 더 높은 양상을 나타내는 것으로 보고되었다 (Kyogoku 등, 2002). 하지만 한국인에서는 이와 반대인 majorallele에서 루푸스 환자군이 정상 대조군보다 높은 양상을 보였다.태국인 과 중국인에서도 10849T>C 다형성이 일본인과 비슷한 빈도를 보이고 있어 한 국인과는 다른 양상을 나타내고 있었다 (Siriboonrit등,2002;Chu 등,2004).정 상 대조군의 minorallele비율을 비교해 보면 일본인과 중국인의 minorallele비 율은 5%이고 태국인에서는 6%로 한국인의 8%보다 조금 낮은 비율을 보이고 있 다.또한 minorallele을 가지고 있을 때 OR (oddratio)값은 일본인에서 2.07,중 국인에서 2.30,태국인에서 2.28로 보고되어 있어 한국인에서의 0.79보다 높은 수 치를 보이므로 일본인과 중국인,그리고 태국인에서 minorallele을 가지고 있을 때 루푸스 질환의 위험도가 더 높은 것으로 나타나고 있다 (SmithKennethG.C. 와 ClatworthyMR,2010;WillcocksLC 등,2010).같은 아시아 인종이지만 한국 에서만 다른 양상을 나타내고 있으므로 추가적으로 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 기 능적 연구가 필요할 것으로 생각되어진다. 지금까지의 본 연구 결과를 바탕으로 루푸스에 대한 이해의 폭을 넓힐 수 있으며,루푸스로 발병할 가능성이 있는 환자를 조기에 발견할 수 있는 검사방법 의 개발뿐만 아니라 치료제 개발 및 약물 반응과 관련된 약물 유전체 연구에 귀 중한 기초 자료가 되리라 생각된다.
Ⅴ.결 론
본 연구자는 루푸스 환자와 대조군으로 류마티스 질환의 기왕력이 없는 정상인을 대상으로 Fcg 수용체 ⅡA 유전자의 전사조절 부위와 exon4부위,Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 exon5부위와 intron5부위의 탐색을 통해 5개의 다형성을 확인하였다. 탐색한 다형성의 유전자형을 결정하여 루푸스 환자군과 정상 대조군 간의 빈도 차이를 살펴본 결과 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 10849T>C 다형성의 major allele을 가지고 있을 때 루푸스의 빈도가 높은 것으로 나타나 Fcg 수용체 ⅡB 유전자가 루푸스의 감수성을 증가 시키는 것으로 추측되어진다.또한 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성과 루푸스와 관련한 임상적 특징과의 관계를 살펴본 결과 11045G>T 다형성에서 백혈구감소증의 빈도가 통계적으로 유의하게 나타났다. 따라서 한국인에서 Fcg 수용체 ⅡB 유전자의 다형성은 루푸스에서 질병의 표현형과 감수성에 연관이 있는 것으로 생각되어진다.참고 문헌
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ABSTRACT
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Keon-YoungKim
DepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity
(SupervisedbyAssociateProfessorChang-HeeSuh)
Backgrounds : Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by polyclonalB-cellactivation and elevated production ofpathogenicautoantibodies.Fcg receptorsarea group ofhematopoeiticcell surface glycoproteins that facilitate the efficiency of antibody-antigen interactions with effector cells ofthe immune system.We have identified singlenucleotidepolymorphisms(SNPs)intheFcg receptorsgene,determined theirfrequency in Korean populations,andelucidatedtheirdifferencebetween SLE patientsandcontrols.
Materials and methods :Blood samples were collected from Korean SLE patients (n = 297) and normalhealthy controls (NC,n = 300) from the rheumatology clinic at the Ajou University Hospital.Genomic DNA was extracted and variation screening ofFcg receptorIIA and Fcg receptorIIB genewascarried outin 40SLE patientsand 40 NC.Weidentified possible polymorphisms in the Fcg receptor IIB gene between exon5 and intron5
region,which was 2.3 kb-sized.Additionally,we amplified that and the detectedSNPsweregenotypedusingdirectsequencingforadditional257SLE patientsand260NC.
Results :Themean ageofSLE patientswas34.5± 12.4 yearsand 86.5% were women.The mean age ofNC was 26.4 ± 5.3 years and 66.7% were women.SLE patientsweresingnificantly youngerand morefemalethan NC (p<0.001andp<0.001,respectively).Wehaveidentified-433T>C (rs7522794) polymorphism in the promotorand 4526 A>G (rs1801274)polymorphism in the exon 4 region in the Fcg receptor IIA.And 10849 T>C (rs1050501) polymorphism in the exon5 region,10950 T>G (rs6666965)and 11045 G>T (rs12117530) polymorphism in the intron5 region in the Fcg receptor IIB gene.The 10849T>C polymorphism was significantly associated with SLE (codominantand recessive anlaysis,p=0.008 and p=0.014,respectively)after controlling age and sex with regression analysis.No association with SLE wasfound in the-433 T>C (rs7522794),4526A>G (rs1801274),10950 T>G (rs6666965)and 11045 G>T (rs12117530)polymorphism,however the 11045 G>T (rs12117530)polymorphism wasstatistically significantly associatedwith leukopenia(p=0.039)
Conclusions :These data suggestthatgenetic polymorphisms within Fcg receptorIIB genemaybeassociatedwithdiseasesusceptibilityandphenotype ofSLE inKoreans.
Key words : Systemic lupus erythematosus, Fcg receptorIIA,Fcg receptor IIB, single nucleotide polymorphism
