Expression of Prxiredoxin I, III and Thioredoxin in human lung cancer and the normal lung tissues

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감사

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의

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글

글

배움의 기회를 주시고 논문이 나오기까지 지도 편달 해 주신 황성철 선생님께 고개 숙여 진심으로 감사드리며,해외 연수 중 이신 박광주 선생님,오윤정 선생 님을 비롯한 호흡기 내과 여러 선생님들께도 감사의 말씀을 전하며,논문 심사 에 애써 주신 최영화 선생님,오영택 선생님께도 감사의 말씀을 전하고 싶습니 다. 곁에서 늘 밝은 얼굴로 실험을 도와준 혜림이를 비롯한 의학 유전학 연구실 선 생님들,실험에 조언을 해 주었던 임상 연구실 선생님들께도 감사드립니다. 변치 않는 우정을 지닌 친구들과 지금까지 학업을 비롯한 직장생활을 할 수 있 도록 도와주신 부모님께 한없는 고마움을 전하며,둘째 연주 보시느라 힘드신 시어머니와 식구들,늘 의지가 되어 준 동생들,끝으로 언제나 저에게 힘이 되어 준 사랑하는 남편과 예쁜 딸 지은,연주에게도 고마움과 사랑을 전합니다.

국문요약

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의 폐

폐

폐암

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현 양

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폐암을 비롯한 여러 종류의 고형 암 종에서는,발암물질과 여러 종류의 성장인 자에 의한 만성적이며,지속적인 자극과 함께,계속적인 산화 스트레스를 통한 세포의 성장과 증식 및 주변 조직으로의 침습에 대한 압력이 동시에 공존한다고 할 수 있겠다. 비교적 최근에 알려진, 새로운 계통의 항 산화 효소인 Peroxiredoxin(Prx)단백은 세포의 증식과 분화,세포사멸이나 발암과정에 관여 하는 것으로 알려져 있다.더구나,이들 Prx단백은 Thioredoxin(Trx)과 더불어 heat shock이나 oxidative stress에 의존적인 분자 생물학적 스위치로서, peroxidase와 chaperone기능과의 사이를 조절하는 것으로 알려져 있다.하지 만,현재까지 폐암을 비롯한 각종 질병에서의 이들 Prx 단백의 역할은 잘 규명 되어 있지 않다.이에 본 연구에서는 폐암 조직과 정상 폐 조직에서 Prx단백의 발현 양상과 분포를 연구해서 이들의 병태 생리학적인 의미를 찾아보고자 하였 다. 아주대학교 의과대학 부속병원에서 폐암으로 진단되어 수술 받은 환자의 폐암 조직과 동일 환자의 정상 부위 폐 조직에서,기존의 1 차원 전기영동 (reducing 조건과 non-reducing 조건에서의 SDS-PAGE)을 시행하거나 2차원 전기영동을 시행한 후 western blot으로 Prxs,Trx 및 Thioredoxin reductase (TR)의 발현 양상을 비교 분석 하였으며,백서의 정상 폐 조직과 환자의 폐암 조직에서 anti-prx rabbitpolyclonal항체를 일차 항체로 하여 면역 조직 화학 염색법을 통해 Prx 단백의 분포를 관찰하였다. 면역 조직 화학 염색법 결과 백

서의 정상 폐 조직에서는 PrxI,II,III및 V 유형이 주로 기관지 상피세포,폐포 상피세포 및 폐포 대식세포에서 발현되고 있음을 알 수 있었다.또한 인체 폐암 조직에서는 동일 환자의 정상 폐 조직 부위에 비해서 Prx I과 Prx III유형 및 Trx단백의 발현이 선택적으로 증가되어 있음이 확인되었으며,특히 2차원 전기 영동을 통한 프로티옴 분석에서는 산화된 형태의 Prx I과 Prx II가 증가 한 것 을 비롯하여,분자량과 등전점(pI)이 약간 변화된 형태의 Prx III가 폐암조직에 존재함을 알 수 있었다.한편 폐암 조직의 non-reducing 전기영동 후 western blot에서는,monomer와 dimer사이의 중간 크기에 해당하는 약 40kDa과 200 kDa이상 크기의 항 Prx항체와 반응하는 단백 띠 (reactivebands)가 관찰되었 는데,이에 대한 것은 향후 추가적인 연구와 규명을 필요로 할 것으로 사료된다. 폐암 조직에서 관찰되는 Prx I과 Prx III유형 및 Trx의 과 발현 양상은 종양 세포들이 주변의 미세 환경으로부터 겪는 여러 가지 스트레스에 적응하며,그들 의 생명력을 유지하고,지속적인 성장과 암성증식(oncogenicproliferation)을 계 속하려는 노력의 일환으로 해석되며 이에 대한 추가적인 연구가 필요 할 것으로 사료된다.

차

차

차 례

례

례

국문요약 ⅰ 차례 ⅲ 그림 차례 v I. 서론 1 II. 재료 및 방법 7 A. 실험 대상 7 B. 면역 조직 화학 염색법(Immunohistochemistry) 7 C. 1차원 전기영동 분석(1 dimensional non-reducing and reducing western blotting) 8

D. 2차원 전기영동 분석(2 dimensional electrophoresis and western blotting) 9

III. 결과 10 A. 백서의 정상 폐 조직에서 각각의 Prx isoforms의 발현 양상 10 B. 인체 폐암 조직 및 정상 부위 폐 조직에서 Prx isoforms의 발현 양상 비교 10 C. 인체 폐암 조직과 정상 부위 폐 조직에서 Trx 및 TR의 발현 양상 비교 16 D. 폐암 조직과 정상 부위 폐 조직에서의 Prx 단백의 chaperone 기능과 oxidation status 16 E. 인체 폐암 조직에서의 Prx I 면역 조직 화학 염색 및 기타 폐 질환에서의 Prxs 단백의 발현 양상 18

IV. 고찰 24

V. 결론 27

참고문헌 28

그

그

그림

림

림 차

차

차례

례

례

Fig. 1. _{SequentialreductionofO}2 5

Fig.2.Enzymaticreactionmechanism ofperoxiredoxins 6

Fig.3.LocalizationofPrxisoformsbyimmunohistochemistry 11 Fig.4.IncreasedexpressionofPrxIandPrxIIIinbothadenocarcinoma

andsquamouscarcinomaofthelung 12

Fig.5.IncreasedexpressionofPrxI,IIIinsquamouscarcinomaof thelung. 13

Fig.6.ExpressionofPrxVIinhumanlungcancertissue 14 Fig.7.Presenceofintermediatemolecularweightbandofprotein

reactingwithanti-PrxIIIantibodyinlungtissue 15 Fig.8.ExpressionofTrxandTR insquamouslungcancer

tissue(C)andthenormallungtissue(N) 17

Fig.9.HighmolecularweightPrxIbandsobservedinbothlung cancertissueandthenormallungtissue 19

Fig.10.ExpressionofPrxI,IIandIIIisoformsinlungcancer tissueandthenormallungtissueby2D SDS-PAGE 20 Fig.11.Over-expressionofPrxIinhumanlungcancertissue 21 Fig.12.DetectionofPrxIIproteinsinpatientswithmalignant

I

I

I.

.

.서

서

서 론

론

론

여러 종류의 cytokine성장인자 및 산화성 물질(oxidants)등은 세포 내에서 활성 산소기(ReactiveOxygen Species;ROS)의 발생을 유발하며,이렇게 생성 된 활성 산소기는 세포의 증식과 분화 또는 세포 사멸에 관여하기도 하고,더 나아가서는 다른 신호 전달 물질의 생성을 촉진 시키거나,종양의 생성과 침습 적인 경과를 보이게 하는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (LavrovskyY 등,2000).산소분자는 다른 물질을 산화하는 과정에서 전자를 하 나씩 잃어 가면서 환원되는 과정을 거치게 되는데,이때 활성 산소기를 발생하 게 된다(Fig.1.).이러한 활성 산소기는 NADPH oxidase를 세포막과 세포질에 포함하고 있으면서,면역과 식작용에 직접 관여하는 호중구(Abrahan E,2003; Abrahan E 등,2000;Abrahan E 등,2000)또는 대식세포(JonesRD 등,2000) 에서처럼 살균 또는 조직 손상(Oxidativedamage또는 Oxidativestress)에 직접 관여할 수 도 있겠지만,면역 세포가 아닌 보통의 인체 조직에 있는 섬유 모세 포(DhauniGS 등,2004),혈관 내피세포(MarshallC 등,1996),평활근 세포 (MarshallC 등,1996),상피 세포(Griendling KK,2004)등도 Mox 또는 Nox family의 NADPH Oxidase를 소유하고 있다는 것이 밝혀짐에 따라,이들 세포가 각기 세포 내에 존재하는 oxygen sensor를 통해서 활성 산소기를 인지하는 과 정이나 세포 내 활성 산소기의 종류와 농도에 따른 세포증식과 분화 및 세포 사 멸 과정이 중요한 연구 대상으로 부각되고 있다(StoneJR,2004).이러한 사고의 전환을 가져오게 된 가장 큰 이유는 이미 세포 내에서 제 2신호 전달 물질로 인정받고 있는 NO의 경우와 마찬가지로,활성 산소기도 높은 농도에서는 외부 세균에 대한 방어 작용과 조직에 대해 손상과 염증반응을 유발하는 측면으로 작

용하지만,낮은 농도의 잘 조절된 분출의 경우는 세포 내 신호전달 물질로서 중 요한 역할을 할 수 있다는 인식에 기초하고 있다(FinkelT와 Holbrook NJ, 2000).알려진 활성 산소기 중에서 특히 H2O2의 경우는 이미 많은 연구에서 세

포 내 제 2신호 전달 물질로서 인정받고 있는데(RheeSG 등,2003),그 이유는 우선 효소작용에 의해 비교적 높은 농도가 빠른 시간 내에 생성되며,peroxidase 와 catalase 등의 효소에 의해 필요할 때 신속하게 소멸되고,비교적 안정성이 있어 조직과의 비 특이적 반응이 적은데다가,확산이 자유롭고,세포막의 외부와 내부 사이에 뚜렷한 농도 차이(concentrationgradient)가 존재하며,세포의 소기 관들 (organelles) 내에서 차별화된 국지적인 분포 (local concentration difference)를 보인다는 점에서 제 2 신호 전달 물질로서의 가능성을 인정받고 있다(StoneJR,2004).대부분의 세포에서 세포 내의 H2O2의 농도가 낮으면 세포

는 휴지기(quiescentstage)로 존재하다가 성장인자,cytokine,또는 각종 호르몬 의 영향을 받으면,세포 내에는 이들의 영향으로 인해 H2O2의 농도가 증가하게

되고,이로 인한 세포의 증식과 분화가 일어나게 된다.하지만 일정농도 (세포 내 농도 1μM이상)보다 높은 H2O2가 발생하게 되면 세포는 세포사멸(apoptosis)

의 길로 가게 되고,더 높은 농도에서는 세포괴사(necrosis)가 유발된다(Stone JR,2004). 다른 한편으로 상대적으로 낮은 농도의 지속적인 H2O2증가가 유지

될 경우 세포 내에 존재하는 탈 인산화 효소,특히 proteintyrosinephosphatase 들이 불활성화 되고,이로 인한 성장인자 수용체와 cellularproto-oncogene들의 인산화가 촉진되면서 세포는 발암과정의 경로를 취하기도 한다(Forman HJ와 Torres M, 2001). 따라서 세포 내에서 H2O2의 발생을 조절하고 세포의

redox-potential의 균형을 맞추는 일은 세포의 항상성(homeostasis)유지 및 생 명체의 존립에 중요한 역할을 하고 있는데,이러한 역할을 담당하는 단백질로는

catalases,glutathioneperoxidases및 본 연구의 주요 대상인 Prx 단백이나,미 생물에서 존재하는 alkylhydroperoxidereductaseC(AhpC)를 들 수 있다(Stone JR,2004).이 중에서 Prx단백은 비교적 최근에 규명되고 있는 peroxidase계열 로 거의 모든 생명체에 공통적으로(ubiquitous)보존되어 있으며,현재까지 알려 진 작용으로는 H2O2또는 alkylhydroperoxide를 환원시켜 물과 알코올로 만드는

효소로 알려져 있다. 이 과정에서 Trx,TR 및 NADPH가 소요되는 것으로 보 고 되어 있다(ChaeHZ 등,1993;ChaeHZ와 RheeSG,1994)(Fig. 2.).Prx단백 은 포유류 세포에서는 모두 6종류의 동위효소(isoforms)들이 밝혀져 있으며,주 로 세포질 내에서 발견되는 Prx I과 Prx II,mitochondria 내부에만 존재하는 Prx III유형이 있고,endoplasmicreticulum 내에서 생성되어 세포 밖으로 분비 되는 Prx IV 유형이 있다.Lysosome또는 peroxisome내에서는 Prx V 유형이 발견되고,세포의 핵 내에서는 Prx I과 Prx II가 미량 존재하며 폐 실질에는 1 개의 보존된 cysteine잔기만을 갖고 있는 비 전형적인 유형의 PrxVI가 분포한 다(ChaeHZ등,1993;ChaeHZ와 RheeSG,1994;ChaeHZ등,1994;Hofmann B 등,2002).하지만 현재까지 Prx단백의 병태생리학적인 기능은 확실하지 않으 며,결핵균과 yeast같은 미생물의 oxidative stress내에서 생존을 도와주거나 (Chae HZ 등,1993),갑상선암(Yanagawa T 등,1999),유방암(Noh DY 등, 2001)및 피부질환(LeeSC 등,2003)등에서 발현이 증가 된 것이 보고 된 정도 일 뿐이다(JangHH 등,2004).폐 조직은 항상 산화 스트레스 및 염증반응에 노 출되기 때문에 조직 내의 glutathione함량이 높고 항산화 효소의 종류도 많고 풍부한 것으로 알려져 있는데,특히 PrxVI유형이 폐 조직의 산화에 대한 방어 기능을 담당하는 것으로 보고 된 바 있다(Dierick JF 등,2003).최근에 밝혀진 바로는 Prx 단백이 다른 peroxidase나 catalase에 비해 낮은 효소작용 (low

catalysisrate)을 갖고(WooHA 등,2003),비교적 낮은 농도의 H2O2에서도 쉽게

불활성화 되었다가 yeast의 sulphiredoxin(Biteau B 등, 2003)이나 인체의 sestrin(BudanovAV 등,2004)등에 의해 곧바로 다시 환원되면서 세포 내에서의 분자 생물학적 스위치로 작용할 가능성에 대해 언급되고 있는데,이것은 Prx 단 백 또는 AhpC 등이 세균의 OxyR과 비슷한 구조를 갖고 있다는 것을 볼 때, Prx 단백이 세포 내의 H2O2농도를 감지하고,세포의 성장과 분화에 중요한 단 백질들에 대해 chaperoneprotein으로 보호하는 작용이 있다는 것이 알려지면서 주목을 받고 있다.또한 이러한 기능은 heatshockprotein들(e.g.,HSP 90,HSP 70,HSP 60,HSP 40,HSP33및 smallHSP)등과 동일한 기능으로,Alzheimer’s disease등과 같은 뇌,신경의 퇴행성 질환과 Prx단백이 연관되어 있다는 내용을 설명하는데 도움을 줄 것으로 기대된다(StoneJR,2004).하지만 폐암이나 각종 폐질환에서 Prx 단백이 발병과정에 대한 연관성이나,구체적인 병인에 대해서는 보고가 미흡한 편으로 본 연구에서는 정상 폐 조직에서 6가지 Prx isoforms들 의 유형별 분포 양상을 확인해 보고,동일 환자에서 적출한 폐암 조직과 정상 부위 폐 조직에서의 각종 Prx단백의 발현 양상을 비교함과 동시에 각각의 조직 에서 Prx단백의 chaperone기능을 비교해 보고자 본 연구를 진행하게 되었다.

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F FFiiiggg...222..E.EEnnnzzzyyymmmaaatttiiiccc rrreeeaaaccctttiiiooonnn mmmeececchhhaaannniiisssmmm ooofff pppeeerrroooxxxiiirrreeedddoooxxxiiinnnsss...Prx reduce peroxide such as hydrogen peroxide(H2O2) and alkylhydroperoxide in the

presence of thiredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. PPPrrrxxxsss; peroxiredoxin, TTTrrrxxx; thioredoxin, TTTRRR; thioredoxin reductase, NNNAAADDDPPPHHH; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, AAhAhhpppCCC; alkylhydroperoxide reductaseC

II. 재

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료 및

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및 방법

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방법

방법

방법

A AA...실실실험험험 대대대상상상 실험 대상으로는 아주 대학교 의과 대학 부속 병원에 입원하여,폐암으로 진단 후 수술을 시행 받은 환자의 폐암 조직과 동일 환자의 정상 부위 폐 조직 을 병리학적인 방법으로 정상임을 확인한 후 대조군으로 이용하였고,그 이외에 도 기타 미만성 간질성 폐질환으로 폐 생검 수술 당시 적출한 생검 조직과 기흉 등의 다른 폐질환으로 적출한 정상 폐 조직,또한 폐암으로 인한 악성 흉막 삼 출액과 결핵성 흉막 삼출액도 비교하였다.폐 조직에서 조직 내의 Prx 단백의 분포를 보기 위한 면역 조직 화학 염색법 실험 대상으로는 백서의 정상 폐 조직 을 이용하였다. B BB...면면면역역역 조조조직직직 화화화학학학 염염색염색색법법법(((IImImmmmmuuunnnooohhhiiissstttoooccchhheeemmmiiissstttrrryyy))) 면역 조직 화학 염색은 파라핀으로 고정된 정상 폐 조직과 폐암 조직의 조 직절편을 이용하여 시행하였다. 백서의 정상 폐 조직에서는 각각의 Prx isoforms에 대한 특이한 rabbitpolyclonal항체(Lab Frontier,Seoul,Korea)를 일차항체로 사용하였으나,폐암 조직의 경우는 Westernblot분석에서 발현의 증 가를 보였던 anti-Prx Ipolyclonal(Lab Frontier,Seoul,Korea)항체를 일차항체 로 사용하였다.조직 절편에서 우선 파라핀을 제거한 후 10% 정상 goat혈청 (Amersham Biosciences,LittleChalfont,Buckinghamshire,England)으로 차단 하여 비 특이적인 흡착이 없도록 만들었다.4시간 동안 anti-Prx polyclonal antibody로 반응시킨 후 phosphate buffered saline(PBS)으로 3회 세척하였고, SLAB kit(Dako,Denmark)의 avidin-biotinreagent로 반응시켰다.발색은 DAB

로 하였고,hematoxylin-eosin으로 counterstain하였다. C CC... 1 차차차원원원 전전전기기기영영영동동동 분분분석석석(((111 dddiiimmmeeennnssisiiooonnnaaalll nnnooonnn---rrreeeddduuuccciiinnnggg aaannnddd rrreeeddduuuccciiinnnggg w wweeesssttteeerrrnnnbbblllooottttttiiinnnggg))) 대상에서 언급한 정상 폐 조직 또는 폐암 조직을 곧 바로 섭씨 4℃에서, homogenizationbuffer(20mM HepespH7.0,1mM EDTA,1mM EGTA,100mM NaCl,5μg/mlleupeptin,10μg/mlaprotinin)에 non-reducing SDS-PAGE 및 western blot분석을 위해서는 80mM N-Ethylmaleimide(Sigma co.,St.Louis, MO,USA)을 포함하였고,reducing SDS-PAGE 및 western blot분석을 위해서 는 1M dithiotheriol(DTT)을 포함하여 각각 혼합한 후 Polytron homogenizer (Brinkmann Inst.Co.NY,USA)로 분쇄하고,20초간 3회 sonication하였다. 4℃,1,2000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 취한 후 Bio-rad protein assay(Bio-rad laboratories,Hercules,CA,USA)방법으로 정량한 단백을 동일 한 양의 samplebuffer(2X,non-reducing condition 또는 reducing condition)와 섞은 후,95℃에서 5분간 가열하였다.이를 각각의 lane당 10μg 씩 loading 한 후, 10-15% SDS PAGE로 전기영동하여 분리하고, nitrocellulose membrane(Scheicher& SchuellBioScienceGmbH,Dassel,Germany)에 흡착 이동시켜,각각의 Prx isoform들에 대한 특이 항체로 Western blot을 실행하여 분석하였다.하지만 Prx유형 V 와 VI는 비전형적인 유형으로,S-S 결합을 하 고 있지 않기 때문에 dimer결합을 보는 non-reducing gel은 시행하지 않고,통 상의 reducing SDS-PAGE 만 시행하였다.또한 폐암으로 인한 악성 흉막 삼출 액과 결핵성 흉막 삼출의 경우는 각각의 흉막액을 Trichloroaceticacid (TCA; Sigma co.,St.Louis,MO,USA)로 침전시켜서 homogenization buffer에 다시

용해시킨 후 50μg의 단백을 취하여,13cm vertical Hoeffer electrophoresis unit(Hoeffer Scientific Inst., USA)을 이용해 전기영동 후 Prx II에 대한 Westernblot을 시행하였다.

DDD... 222차차차원원원 전전전기기기영영영동동동 분분분석석석(((222 dddiiimmmeeennnsssiiiooonnnaaalll eeellleeeccctttrrroooppphhhooorrreeessisiisss aaannnddd wweweesssttteeerrrnnn b

bbllloootttttitiinnnggg)))

폐암 조직과 정상 폐 조직 및 기타 폐질환에서 얻은 폐 조직을 잘게 자른 후 lysis buffer (8M urea, 4%CHAPS, 40mM Tris, 20mM DTT, 0.5% immobilized pH gradient(IPG) buffer pH3-10 non-linear,protease inhibitor cocktail)와 혼합하여 Polytronhomogenizer로 분쇄하고 20초간 3회 sonication하 였다.여기서 얻어진 시료를 Bio-radprotein assay방법으로 단백 정량 후 50μg 의 단백을 취하여 re-hydration buffer(8M urea,2% CHAP,20mM DTT, 0.5% IPG bufferpH3-10 non-linear,0.005% bromophenolblue)와 혼합한 후 immobiline dry strip, pH3-10 non-linear (Amersham Biosciences, Little Chalfont,Buckinghamshire,England)에 적용시켜 상온에서 16시간 동안 반응 시킨 후 isoelectric focusing(IEF)을 시행하였다. IEF는 IPGPhor isoelectric focusing unit(Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)을 이용 하였으며,두 번째 dimension의 SDS-PAGE 전기영동 과정은 Hoeffer의 13cm verticalgelelectrophoresisunit를 이용하여 실험하였다.전기 영동 후 nitrocellulosemembrane에 이동시켜 각각의 Prx 유형들에 특이한 항체 를 이용, Western blot을 시행 후 enhanced chemilluminescence(ECL; Amersham Biosciences,LittleChalfont,Buckinghamshire,England)로 발색하여 관찰하였다.

I

I

II

I

II

I

I.

.

.결

결

결 과

과

과

A AA...백백백서서서의의의 정정정상상상 폐폐폐 조조조직직직에에에서서서 각각각각각각의의의 PPPrrrxxxiiisssooofffooorrrmmmsss의의의 발발발현현현 양양양상상상... 백서의 정상 폐 조직을 대상으로 면역 조직 화학 염색법을 통해 Prx 각각 의 유형에 대한 발현 양상을 살펴본 결과,Prx 단백은 주로 기관지와 폐포의 상 피세포에서 관찰되고,간질조직 등에서는 상대적으로 발현이 적었다.기관지,폐 상피세포에서 주로 발현되는 Prx의 유형은 Prx I,II,III및 Prx V였으며 Prx IV나 PrxVI는 폐의 면역 조직 화학 염색 슬라이드에서는 잘 관찰되지 않았다 (Fig.3.). B BB.인인인체체체 폐폐폐암암암 조조조직직직 및및및 정정상정상상 부부부위위위 폐폐 조폐 조조직직직에에에서서서 PPPrrrxxx iiisssooofffooorrmrmmsss의의의 발발발현현현 양양양상상상 비비비 교 교교... 수술로 적출한 폐암 환자의 폐암 조직과 동일 환자의 정상 부위 폐 조직을 대조군으로 Prx 단백의 발현 양상을 비교하여 보면,우선 첫째로 폐암 조직에서 선암(adenocarcinoma)이나 편평 상피 세포암(squamouscarcinoma)여부에 관계 없이 Prx I과 Prx IIIisoforms의 발현이 증가되어 있음을 관찰할 수 있었다 (Fig.4,5.). 하지만 Prx II의 발현 양상은 폐암 조직과 정상 부위 폐 조직이 비슷하였고,Prx IV는 폐 조직에서는 미량 관찰 되었으며,Prx V 및 Prx VI의 양도 암 조직과 정상 폐 조직에서 차이가 없었다(Fig.6.).

두 번째로 특이할 만한 결과는,폐암 조직과 정상 폐 조직의 Non-reducing SDS-PAGE 결과에서 기존의 25kDa monomeric band (M → in Fig.7.)와 45KDadimericband(D → inFig.7.)외에 이들 사이의 분자량(약 40kDa)을 갖 는 anti-Prx항체에 의해 인식되는 bands들이 폐암 조직에서 존재한다는 것인

α αα α_{---PPPrrrxxxIII} αααα_{---PPPrrrxxIxIIIII} αααα_{---PPPrrrxxxIIIIIIIII} α αα α_{---PPPrrrxxxIIIVVV} αααα_{---PPPrrrxxxVVV} αααα_{--P-PPrrrxxxVVVIII} F FFiiiggg...333...LLLooocccaaallliiizzazaatttiiiooonnn ooofffPPPrrrxxx iiisssoooffofoorrrmmmsss bbbyyy iiimmmmmmuuunnnooohhhiiissstttoooccchhheeemmmiiissstttrrryyy...Fresh frozen section of normal mouse lungs were incubated with appropriate isoforms specific anti-Prx polyclonal antibodies as indicated in immunohistochemicalstain.DAB wasusedasachromogen andthesections werecounterstainedwithH & E stain(X400).

F

FFiiiggg... 444... IIInnncccrrreeeaaassseeeddd eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn ooofff PPPrrrxxx III aaannnddd PPrPrrxxx IIIIIIIII iiinnn bbbooottthhh a

aadddeeennnoooccacaarrrccciiinnnooommmaaaaaannnddd sssqqquuuaaammmooouuussscccaaarrrccciiinnnooommmaaoaoofffttthhheeellluuunnnggg...Non-reducing 12% SDS-PAGE with western blotperformed with anti-Prx Iantibody(panelA, B)and anti-Prx IIIantibody(panelC,D)in adenocarcinoma(panelA,C)and squamouscarcinoma(panelB,D)respectively.MMM;monomeric Prx Iand Prx III,DDD;dimericPrxIandPrxIII,NNN;normaltissue,CCC;cancertissue

squamouscarcinoma A. A.A. A. a-Prx I C. N C N C N C N C a-Prx III B. B.B. B. 25kDa 45kDa N C N C N C N C D. 25kDa 45kDa D DD D D DD D M MM M M MM M adenocarcinoma

F

FFiiiggg 555...IIInnncccrrreeeaaassseeedddeeexxxppprrreeessssssiiiooonnnooofffPPPrrrxxx III,,,IIIIIIIIIiiinnnsssqqquuuaaammmooouuusscsccaaarrrccciiinnnoomommaaaooofffttthhheee l

lluuunnngggsss...Western blotting with anti-Prx Iantibody underreducing condition wasdoneafter12% SDS-PAGE.10μgproteinextractsfrom pairedsampleof 4 patients were used.panelAAA;Peroxiredoxin I,panelBBB;Peroxiredoxin II, panel,CCC;PeroxiredoxinIII,DDD;Tubulininternalstandard,NNN;normaltissue,CCC; cancertissue 25kDa 25kDa 25kDa

A.

A.

A.

A.

C.

B.

B.

B.

B.

αααα

-Prx I

αααα

-Prx II

αααα

-Prx III

N C N C N C N C

55kDa

D.

_Tubulin

F

FFiiiggg...666...EEExxxppprrreeesssssisiiooonnnooofffPPPrrrxxxVVVIIIiiinhnnhhuuummmaaannnllluuunnngggcccaaannnccceeerrrtttiiissssssuuueee...Expressionof Prx VIin both lung cancertissue(CCC)and the normallung tissue(NNN)was examined using western blotting with anti-Prx VI antibody after 12% SDS-PAGE underreducingcondition.

30kDa

N C N C N C N C

F

FFiiiggg...777...PPPrrreeessseeennnccceee ooofff iiinnnttteeerrrmmmeeedddiiiaaattteee mmmooollleeecccuuulllaaarrr wwweeeiiiggghhthtt bbbaaannnddd ooofff ppprrrooottteeeiiinnn r

rreeeaaaccctttiiinnnggg wwwiiittthhh aaannntttiii---PPPrrrxxx IIIIIIIIaIaannntttiiibbbooodddyyy iiinnn llluuunnnggg tttiiissssssuuueee...Non-reducing 12% SDS-PAGE with subsequent western blot reveals a about 40kDa intermediated molecularweightband(marked X)between the dimerand the monomerofPrxI.MMM;monomericPrxIII,XXX;intermediatemolecularweightα -PrxIIIreactivebands,NNN;normaltissue,CCC;cancertissue

: 25 kDa a-Prx III blot

X

D : 45kDa

M

N C N C N C N C

데 (X → inFig.7.),이러한 결과는,기존의 Raw256.7,A549및 WI26세포주를 대상으로 연구한 것에서 이번의 결과와 유사한 내용을 관찰했던 것과도 일치한 다(insubmission).

C CC...인인인체체체 폐폐폐암암암 조조조직직직과과과 정정정상상상 부부부위위위 폐폐폐 조조조직직직에에에서서서 TTTrrrxxx및및및 TTTRRR의의의 발발발현현현 양양양상상상 비비비교교교... Prx 단백이 효소작용을 위해서는 Trx 및 TR이 꼭 필요하고,특히 최근에 보고된 바에 의하면 Prx I단백의 chaperone기능을 위해서는 Trx가 필수적 이 라고 알려져 있으므로(Jang HH 등,2004),폐암 조직과 대조군인 정상 폐 조직 에서 이들 단백들의 발현 양상도 차이가 있을 것으로 기대되어 Western blot분 석을 통해 비교하였다.그 결과 폐암 조직에서는 동일 환자의 정상 부위 폐 조 직에서 보다 Trx의 발현이 증가되어 있었으나,TR의 양에는 변화가 없었 다.(Fig.8.). D DD...폐폐폐암암암 조조조직직직과과과 정정정상상상 부부부위위위 폐폐폐 조조조직직직에에에서서서의의의 PPPrrrxxx 단단단백백백의의의 ccchhhaaappepeerrrooonnneee 기기기능능능과과과 o ooxxxiiidddaaatttiiioononnssstttaatattuuusss... 최근 보고에 따르면 효모에서 PrxI과 PrxII단백이 H2O2등의 산화 스트

레스나 heatshock등에 의해서 decameric,spherical형태의 고분자의 복합체를 형성한 후 이들 Prx 고분자 복합체가 세포내의 다른 주요한 단백질과 결합하여 단백질의 손상을 막고,개체를 보존하는 등 분자 생물학적 스위치와 chaperone 의 역할을 겸비해서 담당하는 것으로 밝혀져 있는데(Jang HH 등,2004),폐암 조직의 경우 빠른 성장 속도와 지속적인 성장인자 자극으로 인해,이러한 산화 스트레스가 정상 폐 조직보다 더 클 것으로 기대되어,이를 non-reducing SDS-PAGE 와 2차원 전기영동법을 통해 확인 하고자 하였다.

F

FFiiiggg...888...EEExxxppprrreeessssssiiiooonnn ooofffTTTrrrxxx aaannnddd TTTRRR iiinnn sssqqquuuaaammmooouuusssllluuunnnggg cccaaannnccceeerrrtttiiissssssuuueee(((CCC))) a

aannnddd ttthhheee nnnooorrrmmmaaalll llluuunnnggg tttiiisssssusuueee(((NNN)))... Reducing 10-15% SDS-PAGE and subsequent western blotting with anti-Trx and anti-TR antibody was performed with 10μg protein extractsfrom thesquamouslung cancertissue and the normallung tissue.panelAAA;Thioredoxin,panelBBB;Thioredoxin Reductase,panelCCC;Tubulininternalstandard

N C N C N C N C 15kDa 62kDa A. A.A. A. B. B.B. B. 55kDa C. _Tubulin ΤΤΤΤrx TR

폐암과 정상 폐 조직 모두 non-reducing SDS-PAGE 상에서 고 분자량의 Prx Ibands가 관찰 되었는데(HMW inFig.9.),다른 Prx isoforms에서는 이러 한 고 분자량의 bands가 관찰되지 않아 인체 폐 조직에서의 molecular chaperone기능은 주로 Prx I유형에 의해 이루어 질 것이라고 예측할 수 있겠 으나 예상과는 달리 폐암 조직과 정상 폐 조직에서 고 분자량 bands양의 차이는 관찰할 수 없었다.

2차원 전기영동을 통한 폐암과 정상 폐의 Prx단백의 비교에서는 폐암조직에서 Prx I의 양이 상당량 과 발현 되어 있음을 확인할 수 있었으며,이 중에서 산화 된 형태의 oxidizedfraction가 증가 되어 있음을 알 수 있었고(Fig.10.),이 결과 는 통상의 1차원 전기영동 결과와도 일치하였다(Fig.4,5.).

하지만 activesitecysteine이 산화된 형태에 특이하게 반응하는 Cys-SO3H 항

체로 폐암 조직과 정상 폐 조직을 구분하여 western blot분석을 시행하였을 때 는 한 경우를 제외하고는 일치하는 결과를 얻을 수 있었다.(Datanotshown). E EE.인인인체체체 폐폐폐암암암 조조조직직직에에에서서서의의의 PPPrrrxxxIII면면면역역역 조조조직직직 화화화학학학 염염염색색색 및및및 기기타기타타 폐폐폐 질질질환환환에에에서서서의의의 P PPrrrxxxsss단단단백백의백의의 발발발현현현 양양양상상상 폐암 조직에서 면역 조직 화학 염색을 통해 PrxI의 발현 양상을 관찰한 결 과 주변 정상 조직에 비해 월등하게 높은 농도로 Prx I이 과 발현되어 있음을 알 수 있었으며,따라서 Western blot분석에서 증가되어 보이는 Prx I의 양은 폐암 세포로부터 기인한 것임을 알 수 있었다(Fig.11.).

기타 폐 질환에서의 폐암으로 인한 악성 흉막 삼출액(malignanteffusion)과 결 핵성 흉막 삼출액(tuberculouseffusion)환자에서 Prx II항체를 이용한 Western blot분석을 시행한 결과 malignanteffusion환자에서만 PrxII를 검출할 수 있었

F

FFiiiggg...999...HHHiiiggghhh mmmooollleeecccuuulllaaarr wrwweeeiiiggghhhttt PPPrrrxxx III bbbaaannndddsss ooobbbssseeerrrvvveeeddd iiinnn bbboototthhh llluuunnnggg c

ccaaannnccceeerrrtttiiissssssuuueeeaaannnddd ttthhheeennnooorrrmmmaaalllllluuunnnggg tttiiissssssuuueee...10μg ofprotein extracts from lung cancer tissue(C) and the normal lung tissue(N) was subjected to non-reducing 10% SDS-PAGE and subsequent western blotting with anti-PrxIantibody.HHHMMMWWW;highmolecularweightα-PrxIreactivebands,DDD; 45kDadimericPrxIband,MMM;25kDamonomericPrxIband

αααα-Prx I 25kDa : 45kDa : >200kDa : N C N C N C N C HMW HMW HMW HMW D DD D M MM M

F

FFiiiggg...111000...EEExxxppprrreeessssssiiiooonnn ooofffPPPrrrxxx III,,,IIIIIIaaannnddd IIIIIIIIIiiisssooofffooorrrmmmsssiiinnn lllunuunnggg cccaaannnccceeerrrtttiiissssssuuueee a

aannnddd ttthhehee nnnooorrrmmmaaalll llluununnggg tttiiissssssuuueee bbybyy 222DDD SSSDDDSSS---PPPAAAGGGEEE... 2 dimensional electrophoresisandwesternblotting with50μg proteinfrom bothlung cancer and thenormallung tissue.Isoelectricfocusing wasdonewith gelstrip(pH 3-10,non-linear) and second dimension was seperation by the molecular weighton 12% SDS-PAGE.OOOxxx;oxidized form,RRReee;reduced form,III;Prx I, I IIIII;PrxII,IIIIIIIII;PrxIII N L C A A . A . A . A . B . B . B . B . I I I I I I R e O x R e O x R e I I I I I I O x O x R e R e R e

F

FFiiiggg...111111...OOOvvveeerrr---eeexxxppprrreeessssssiiiooonnnooofffPPPrrrxxIxIIiiinnnhhhuuummmaaannnllluuunnngggcccaaannnccceeerrrtttiiissssssuuueee...Paraffin fixed 5μM slide oflung cancertissue was de-paraffinized,incubated with anti-Prx Iantibody and visulized with DAB as chromogen.the slide was conterstainedwithhematoxylin& eosin(X400)

다(Fig.12.).

특발성 폐 섬유화증(IPF;idiopathicpulmonary fibrosis),비 특이성 간질 성 폐 렴(NSIP;Non-specificinterstitialpneumonitis)및 정상과 폐암 환자에서 2차 원 전기영동을 통해 Prx I의 발현 양과 oxidation status를 비교한 결과 IPF 나 NSIP 환자는 정상보다 Prx 단백의 발현이 감소해 있으며,폐암 환자에서는 정 상보다 발현이 증가되어 있음을 알 수 있었다(datanotshown).

F

FFiiiggg...111222...DDDeeettteeeccctttiiiooonnn ooofffPPPrrrxxx IIIIIIpprprrooottteeeiiinnnsssiiinnnpppaaatttiiieeennntttssswwwiiittthhhmmmaaallliiigggnnnaaannntttpppllleeeuuurrraaalll e

eeffffffuuusssiiiooonnn...50μg of protein from both malignant effusions(panel left) and tuberculous effusions(panel right)were loaded onto 12% SDS-PAGE and western blotwasperform using anti-Prx IIantibody.Numbersindicateeach individualpatientandarrow indicates25kDaPrxIIbands.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8

Malignant Effusion Tbc Effusion Anti-Prx II Blot 25 kDa α αα α-Actin 10 11

A

B

I

I

IV

V

V.

.

.고

고

고 찰

찰

찰

그 동안 산소는 세포나 생명체가 생명을 유지하고 에너지원을 공급 받는데 있어서 없어서는 안 될 중요한 원소로 알려져 있다.하지만 과량의 산소는 활성 산소기의 유출을 통해 산화 스트레스를 생명체에 가하게 되고,이러한 손상으로 인해 단백질,지질 막,염색체나 핵산 등이 변화되고 노화되거나 염증 반응을 유 발한다고 알려져 왔다(FinkelT와 HolbrookNJ,2000).따라서 그 동안 학자들이 활성 산소기를 바라보는 시각은 세포 손상에 대한 세포내의 방어기전 측면이 중 심을 이루어 왔다.하지만 H2O2를 포함한 활성 산소기는 엄연한 제 2신호 전달 물질로서 세포의 정상적인 mitochondria호흡과정,세포 막 수용체를 통한 성장 인자나 cytokine자극 등에 의해 생성되는 것이 기정 사실화 되어 있고,호중구 나 대식 세포 등의 면역 세포뿐만 아니라 섬유 모세포,대장 상피세포,혈관 내 피세포,평활 근세포 등의 거의 모든 종류의 세포가 Mox또는 Nox계통의 효소 를 이용해 활성 산소기를 이용한 신호 전달을 하고 있음이 밝혀지고 있다(Stone JR,2004;RheeSG 등,2003;Forman HJ와 TorresM,2001). 폐암을 비롯한 각종 암 종의 경우 지속적인 성장과 증식이 이루어지고 발암물질에 대해 끊임없 이 노출되어 있으므로,각종 성장인자의 자극에 따른 성장인자 수용체 tyrosine 인산화 과정,탈 인사화 효소 억제로 인한 세포주기의 활성화 과정 및 MAP kinase 활성화 과정에서 많은 양의 산화 스트레스로 인한 활성 산소기,특히 H2O2의 발생이 많을 것으로 예측되며,이를 처리하는 Prx단백의 발현이 증가된 것은 어쩌면 당연한 현상일 수도 있다. 본 연구에서는 폐암 조직에서 정상 조직에서 보다 많은 양의 Prx I과 PrxIII및 Trx의 발현이 관찰 되었는데,이러한 결과는 폐암세포주인 A549세

포에서 프로디옴 분석을 통해 Prx I의 증가를 보고한 Chang 등의 보고(Chang TS 등,2004)와 폐암 세포주에서 고농도의 H2O2자극 후에 PrxI과 Trx의 증

가를 보고한 Kim 등의 보고(KinHJ등,2003)와 일치하는 결과이다.하지만,유 방암 조직에서 Prx II의 과 발현을 보고한 Noh등의 보고(NohDY 등,2001)나 두경부 암에서 방사선 조사 후 나 방사선 치료 내성을 보일 경우 PrxII의 발현 이 증가 한다는 보고(Park SH 등,2000)와는 다소 차이점을 보이고 있는데,이 러한 차이는 본 연구에서는 폐암 조직을 대상으로 모든 isoforms의 Prx 단백에 대해 여러 가지 방법 (non reducing SDS-PAGE,reducing SDS-PAGE,2차원 전기영동법 및 면역 조직 화학 염색법 등)으로 Prx 발현을 조사하였고,또한 폐 암 조직을 가지고 연구 한 것 이므로 유방암 조직이나 두경부 암과는 원발 부위 에 따른 차이를 나타냈을 것으로 사료된다.더불어 본 연구에서 Prx III가 증가 한 것은 폐암세포의 활발한 증식에 따른 mitochondria호흡의 증가와 에너지 요 구 증가에 따른 활성 산소기의 발생 증가를 보완하기 위한 것으로 사료된다.동 시에 본 연구에서는 폐암 조직에서 Trx의 증가도 관찰할 수 있었는데,이것은 늘어난 산화 스트레스와 폐암 조직의 성장요구로 인하여 Prx I이 감당해야 될 peroxidase로서의 효소 활성 요구량 (catalytic activity requirement)과 chaperone 단백으로서의 기능을 수행하기 위해서는 Trx의 도움이 절대적으로 필요하기 때문이었을 것으로 사료된다.반면에 TR의 양은 많이 증가되지 않았 는데,이것은 TR-Trx의 상호 효소 작용은 rate-limiting step이 아니고 NADPH 의 농도와 Trx의 양에 따라 Prx단백의 활성이 결정되기 때문으로 추측된다.

면역 조직 화학 염색법에서는 거의 모든 Prxisoforms들이 주로 기관지 상 피 세포,폐포 상피세포와 폐포 대식세포들의 실질조직에서 발견되는데,이러한 현상은 이들 세포의 다양한 기능과 성장,증식 및 분화요구와 더불어 활발한

secretion이나 식작용 같은 활성 산소기와 관련된 세포의 고유한 특성 때문일 것 으로 생각된다.하지만 Prx IV의 경우 endoplasmicreticulum에서 형성되어 분 비되는 형태이기 때문에 면역 조직 화학 염색에서 잘 관찰 할 수 없었고, Dierick등(DierickJF 등,2003)이 폐의 주요 antioxidant로 지명한 Prx VI를 잘 관찰 할 수 없었음은 상이한 결과라고 할 수 있으나,본 연구에서도 Western blot에서는 PrxVI를 검출할 수 있었던 점을 보면,이러한 결과는 면역 조직 화 학 염색 과정에서 anti-Prx VI항체가 갖는 기술적인 특성 때문일 것으로 사료 된다.폐암의 조직 슬라이드에서는 정상 폐 조직에 비해 폐암 조직에서 PrxI이 월등히 강하게 염색되는 소견을 보이는데,이 결과는 Western blot에서 증가되 어 나타난 Prx 단백의 기원이 폐암 세포들임을 뒷받침하는 증거라고 하겠다.덧 붙여서 폐암과 정상 폐 조직의 non reducing SDS-PAGE 소견을 보면 Prx I의 고 분자량 형태의 bands가 관찰되는데,이러한 현상이 최근에 언급된 yeast에서 Prx I과 II가 chaperone기능을 하는 고 분자 형태로 발견된 현상인지는 Gel filtration,전자 현미경이나 UV absorption등의 추가적인 연구와 규명이 필요하 겠다.

폐암으로 인한 악성 흉막 삼출액 내에서는 결핵성 흉막액에는 관찰되지 않 는 PrxII가 다량으로 검출되었는데,이러한 결과는 악성 흉막 삼출이 대부분 혈 액성(bloody,sero-sanguinous)이고,적혈구의 주요 antioxidant가 Prx II(Moon EY 등,2004)인 때문으로 해석할 수 있다.만성 염증과 섬유화가 동반되는 질환 인 특발성 폐 섬유화증과 비 특이성 간질성 폐렴에서는 Prx I의 양이 정상보다 감소한 것처럼 보이나,증례수가 적어 보다 면밀하고 체계적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

V

V

V.결

결

결 론

론

론

Prx 단백은 H2O2를 처리하는 기본적인 생리적인 기능 이외에도, 퇴행성 신경질환,갑상선암,유방암 등의 종양질환 등에서 관련이 있다고 보고 되어 있 으며 폐암의 발암과정과 증식,전이 과정 중에 지속되는 성장인자의 자극과 늘 어난 산화스트레스에 대항해서 세포내의 중요한 단백질을 보호하고 기능을 유지 하여,세포의 생명력을 유지하며 Trx와 함께 중심적인 기능을 하고 있는 것으로 보이며 이에 대해 더 면밀하고 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

참

참

참 고

고

고 문

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DepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity

(((SupervisedbyAssociateProfessorSungChulHwang)

Continuous growth stimulation by various growth factors and carcinogens as wellas chronic oxidative stress ofproliferation and growth mayco-existinmanysolidtumors,suchaslung cancer.Therelativelynew family of novel antioxidant proteins, peroxiredoxins (Prxs), have been implicated in regulating many cellularprocesses including cellproliferations, differentiation,and apoptosis.They are also reported to function as an oxidative stress-dependentmolecularchaperone formany importantcellular proteins. However, real pathophysiologic significance of Prx proteins in diseased states,especially in lung disease has notbeen sufficiently defined. Therefore,we have conducted a study to investigate the distribution and expression ofvarious Prx isoforms in normallung tissue,lung cancer,and

otherlungconditions.

Surgically resected lung cancer tissue and it's paired controlnormal lung were used for the conventionalSDS-PAGE under both non-reducing and reducing conditions. Proteomic analysis was performed using 2 dimensional electrophoresis. Additionally, immunohistochemistry of normal mouse lung and the cancertissue was performed with respective anti-Prx isoforms antibodies. From our study, immunohistochemical staining has shown thattheisoformsofPrx I,II,III,andV arepredominantly expressed in bronchial and alveolar lining epithelium, as well as in alveolar macrophages ofthe normalmouse lung. Itis also found thatisoforms of Prx I,III,and thioredoxin are over expressed in the lung cancer tissues whencomparedtotheirpairednormalcontrollungsfrom thesameindividual. There was also an increased amount of oxidized form of Prx I and a possibletruncatedform ofPrx IIIin lung cancersampleswhen analyzedby 2-dimensionalelectrophoresis.In addition,a 40 kDa intermediate molecular weightprotein bandandhighmolecularweightbandsofover200kDawhich wererecognized by anti-Prx Iantibody werepresentin thetissueextracts of lung cancer patients and this finding needs further investigations.In conclusion,overexpressionofPrxI,III,andthioredoxininlungcancertissue with theirpossiblechaperoning function may representan attemptoftumor cellstoadapttotheirmicroenvironmentin amannerwhich isadvantageous for their survival and proliferation with maintenance of their malignant potentials.