서
론
인간을 비롯한 모든 호기성 생물체들은 산소를 이용 하여 생명 유지에 필요한 에너지를 생성하는 과정에서 활성 산소족 (1O 2, H2O2,∙OH)의 발생을 야기시키며, 이들 에 대한 자기 방어 기작을 가지고 있다. 그러나 각종 물 리, 화학적 요인들에 의해 자체 방어 기작에 이상이 초래 하게 되면 이러한 활성 산소족의 생성이 증가되면서 산 화적인 손상을 입게되어 직접 및 간접적인 생체 장애가 유발된다 (Jeong et al. 2010). 특히 노화나 암, 심혈관계 및 신경계 질환을 일으키는 것으로 알려진 활성산소는 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응과 같 은 요인들에 의하여 발생할 수 있으며, 세포내 구성성분 들의 비가역적인 파괴를 유발하여 (Cross et al. 1987) DNA를 손상시키거나 암을 유발하는 것으로 보고되어 지고 있다 (Ames and Saul 1987). 이처럼 활성산소와 암은 매우 밀접하게 연관되어 있으며, 전 세계적으로 가장 널 리 퍼져있는 질병으로 해마다 많은 인구들이 암으로 인 ─ ─ 35 ──감마선 조사된 차가버섯 추출물의 암세포 활성 억제
성낙윤∙최종일∙송범석∙김재경∙이주운∙김진규 변명우1∙김미정2∙김재훈* 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소, 1우송대학교 식품생물과학과 2안양대학교 식품영양학과Tumor Cell Cytotoxicity of Gamma Irradiated
Chaga Mushroom Extract
Nak-Yun Sung, Jong-il Choi, Beom-Seok Song, Jaekyung Kim, Ju-Woon Lee, Jin-Kyu Kim Myung-Woo Byun1, Mi-Jung Kim2and Jae-Hun Kim*
Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea
1School of Food Science and Biotechnology, Woosong University, Daejeon 300-718, Korea 2Department of Food Science and Nutrition, Anyang University, Anyang 430-714, Korea
Abstract-- This study was investigated the effect of tumor cell cytotoxicity of gamma irradiated Chaga mushroom extract (CME). CME was prepared by hot water extraction at 70��C for 4 hours and lyophilized. Ten mg ml--1of lyophilized CME powder was dissolved with deionized water and then irradiated at the doses of 10, 50, 100, and 150 kGy by cobalt 60 gamma irradiator. The gamma-irradiated and non-gamma-irradiated CME were treated into the cancer cell, including human stomach cancer and human colon cancer. Cytotoxicity against the cancer cell was increased in gamma-irradiated CME and antioxidant activity was also increased in gamma-gamma-irradiated CME, as irradia-tion dose increased. Therefore, it was considered that gamma irradiairradia-tion was effective method for improvement of the cancer cell cytotoxicity and antioxidant activity of Chaga mushroom extract. Key words : Gamma irradiation, Chaga mushroom, Cytotoxicity, Antioxidant activity
* Corresponding author: Jae-Hun Kim, Tel. +82-63-570-3205, Fax. +82-63-570-3207, E-mail. [email protected]
하여 사망하고 있는 추세이다 (Jeong et al. 2010). 암의 치료는 절개 후 약물처방 및 방사선 치료 등을 통하여 암세포를 점차적으로 사멸시키는 방법이 널리 사용되고 있으나, 약물이나 방사선 치료의 독성으로 인한 후유증 을 배제 할 수 없기 때문에 최근 천연물로부터 항암효 과를 나타내는 생리활성물질을 분리하는 연구가 선진국 을 중심으로 세계 각국에서 활발하게 이루어지고 있는 추세이며, 국내에서도 자생식물로부터 생리활성물질을 추출하여 생체 내 면역반응효과를 살펴보는 연구가 많 이 진행되고 있다 (Lee and Hwang 1998; Byrd et al. 2000). 천연물로부터 분리된 생리활성물질은 종양세포에 직 접적으로 작용하여 암세포의 성장을 억제 또는 사멸시 킬 수 있으며, 간접적으로 생체의 면역반응을 증가시켜 암세포에 대한 생체 방어능력을 향상시키며, 항암제 또 는 방사선 치료로 인한 독성을 경감시켜 줌으로써 항암 효과를 나타낼 수 있다 (Kuo et al. 1996; Fitzgerald et al.
1997). 다양한 종류의 식물체 특히, 버섯은 다양한 약리
작용을 갖는 것으로 알려져 있으며, 버섯의 균사체로부 터 분리한 다당류와 단백질로 구성된 고분자물질이 복 수암 세포에 대한 항암 작용 및 돌연변이 억제활성을 나타낸다고 보고되고 있다 (Chung and Kim 1985).
차가버섯은 주로 러시아, 캐나다, 일본 등의 북위 45� 이상의 한랭지역에서 서식하는 자작나무, 오리나무, 물푸 레나무 등에 기생하여 자라는 균핵으로 표면은 검고 내 부는 황갈색을 띄고 있으며, 맛과 향기는 없는 편으로 담 백하고, 직경이 10~20 cm 가량 성장한다 (An et al. 2010). 학명은 Inonotus obliquus이고 주로 약용으로 이용되고 있다. 차가버섯 추출물의 약리활성 성분으로는 다당류, 플라보노이드, 토리텔페노이드, 이노시톨, 차가산, 알칼로 이드 등이 밝혀져 있으며, 주로 위장의 항궤양작용, 항종 양 활성, 혈당강하 효과 및 항산화 효과 등이 높게 나타 나는 것으로 보고되고 있다 (An et al. 2010). 최근 방사선을 천연물에 이용하는 연구들이 많이 진 행되고 있다. 방사선을 천연물 추출물에 조사할 경우 추 출 수율이 증가하고, 다양한 약리활성들이 증가한다고 보고되어진다 (Jo et al. 2003a, b; Kim et al. 2006). 따라서 본 연구에서는 차가버섯 추출물에 다양한 선량의 방사 선을 조사하여 차가버섯 추출물의 약리활성인 암세포 억제 활성에 관하여 평가 하였다.
재료 및 방법
1. 시료 준비 및 추출물의 제조 본 연구에서 사용한 차가버섯은 러시아산으로 한국담 배인삼공사로부터 구입하여 사용하였다. 100 g의 건조된 차가버섯을 분쇄기 (model FM-681, Hanil, Seoul, Republicof Korea)를 이용하여 2분 동안 분쇄하는 과정을 반복하
여 완전 분쇄한 후, 1 l의 증류수를 가하여 4시간 동안 70�C로 가열하였다. 가열 후, Whatman No. 4 filter paper (Whatman International Ltd.,Springfield Mill, Kent, UK)로 여과하여 얻은 상등액을 동결건조하여 본 실험에 사용 하였다.
2. 감마선 조사
감마선 조사는 한국원자력연구원 방사선과학연구소 (Jeongeup, Republic of Korea) 내 선원 11.1 PBq, 60Co 감 마선 조사시설 (point source AECL, IR-79, MDS Nordion International Co. Ltd, Ottawa, ON, Canada)을 이용하였다. 동결 건조된 차가버섯 추출물을 증류수에 10 mg ml-1의 농도로 용해하여 실온에서 시간당 10 kGy의 선량율로 0, 10, 50, 100 및 150 kGy의 흡수선량을 얻도록 방사선을 조사 하였다. 흡수선량 확인은 alanine dosimeter (5 mm, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 사용하였 다. Dosimetry 시스템은 국제원자력기구 (IAEA)의 규격에 준용하여 표준화 한 후 사용하였으며, 총 흡수선량의 오 차는 2% 이내였다.
3. 세포배양
Human stomach cancer (AGS), Human colon cancer (HT-29) 및 정상 세포주로써 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양은 AGS와 HT-29의 경우 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin, streptomysin (100 IU ml-1, 100μg ml-1) 을 함유한 Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) 배지로 배양하였고, RAW 264.7 세포주는 10% FBS와 penicillin, streptomysin (100 IU ml-1, 100μg ml-1)을 함유 한 Dubecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)용액을 사 용하여 37�C로 유지되는 5% CO2세포 배양기에서 배양 하며 실험에 사용하였다.
4. 세포독성평가
세포주에 대한 세포독성은 각각의 세포주를 1×104 cells well-1씩 96 well plate에 90μl씩 분주하고 0에서 150 kGy로 감마선 조사된 차가버섯 추출물을 200μg ml-1 의 농도로 10μl씩 처리하여 37�C, 5% CO2조건하에서 24시간 동안 배양하여 MTT 분석을 통해 감마선 조사된 차가버섯 추출물의 암세포 억제 활성을 산출하였다. MTT assay는
3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide용액 (5 mg ml-1)를 각각의 well에 30
μl씩 첨가하고 2시간 동안 배양한 후 배양 상등액를 제 거하고 세포 내 생성된 formazan crystal을 dimethyl
sul-foxide (DMSO)에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 5. DPPH 라디칼 소거능 차가버섯 추출물의 전자공여능은 Blois (1958)의 방법 을 이용하여 측정하였다. 다양한 농도(1.953, 3.906, 7.812, 15.625, 31.25, 62.5, 125μg ml-1)의 조사 및 비조사된 차 가버섯 추출물 0.1 ml과 메탄올에 용해시킨 0.2 mM의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma Chemical Co.
St. Louis, MO) 용액 0.1 ml을 혼합하여 37�C에서 30분간
반응시킨 후 분광 광도계(UV-1600 PC, Shimadzu, Tokyo,
Japan)를 이용하여 517 nm의 영역에서 흡광도를 측정하
였다. 대조구로써 합성 항산화제인 butylated hydroxy
tol-uene (BHT)를 사용하였고, 라디칼 소거능의 결과는 다음 식에 의하여 계산 되었다. (Asample-Ablank) Scavenging activity (%)==
[
1-mmmmmmmmmmmmmm]
×100 (Ablind) 여기에서 Asample은 조사 및 비조사된 차가버섯 추출물 과 DPPH 용액 혼합액의 흡광도를 의미하며, Ablank는 조 사 및 비조사된 차가버섯 추출물의 단독의 흡광도를 나 타낸다. 또한 Ablind는 DPPH 용액의 단독의 흡광도를 나 타낸다. 6. 통계처리 모든 실험은 3번 반복하여 평균값과 오차를 결과로 나타내었고, 이상의 실험에서 얻어진 결과는 Statistical Package for Social Sciences (SPSS, 10.0)를 이용하여 OneWay ANOVA test로 분석하였으며, 시료간의 유의성은
Duncan’s multiple range test로 p⁄0.05 수준에서 비교하 였다.
결과 및 논의
1. 감마선 조사된 차가버섯 추출물의 암세포 억제 활성 감마선 조사된 차가버섯 추출물의 암세포 억제 활성에 관하여 알아보기 Human 기원의 암세포주인 AGS와 HT-29 세포주에 처리하여 암세포 억제 활성에 관하여 관찰 하였다 (Fig. 1). 위암 세포주인 AGS 세포주에 대한 암세 포 억제 활성을 관찰한 결과 조사선량별 차가버섯 추출 물의 암세포 독성은 감마선 조사선량이 증가 할수록 암 세포의 독성도 유의적으로 증가하는 양상을 나타내었고, 150 kGy로 조사된 차가버섯 추출물의 암세포 억제 활성 이 가장 크게 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 대장암 세포주인 HT-29 세포주에 대한 암세포 억제 활성을 관 찰한 결과, 상기 AGS 세포에서의 결과와 유사하게 감마 선의 조사선량이 증가 할수록 유의적으로 암세포 억제 활성이 증가하는 것으로 확인 되었으며, 마찬가지로 150 kGy 선량으로 조사된 추출물에서 암세포 억제 활성이 가장 크게 증가되었다. 또한 차가버섯 추출물에 대하여 정상세포 (RAW 264.7)에 대한 세포 생존능을 관찰한 결 과를 Fig. 2에 나타내었다. 방사선 조사 및 비조사된 차 가버섯 추출물의 정상세포 생존능을 확인 한 결과, 샘플 무처리구인 PBS군과 비교하여 보았을 때 유의적인 차 이가 나지 않는 것으로 관찰되어 차가버섯 추출물은 정 상세포에 대하여 세포독성을 갖지 않는 것으로 사료되 며, 차가버섯 추출물에 대한 암세포 억제 활성은 암세포 에 특이적으로 일어나는 것으로 사료된다. Kahlos and Hiltunen (1983)의 연구에 의하면 차가버섯 추출물의 유용성 성분 중 steroides 또는 aromatic polyphenol 화합물 들이 항암 활성을 나타낸다고 보고하였고, 특히 lanosterol,
Fig. 1. Cancer cell (AGS; A, HT-29; B) cytotoxicity of
gamma-irra-diated (10, 50, 100, 150 kGy) and non irragamma-irra-diated (0 kGy) Chaga mushroom extract (CME). a-cValues with different
letters differ significantly (p⁄0.05).
Cell cytotoxicity (%) Cell cytotoxicity (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 c c b b a a ab c a b (A) (B) 0 10 50 100 150
inotodiol 등의 triterpene 계열의 polyphenol 성분들이 높 은 항암활성을 갖는다고 보고하였다 (Kahlos and Hiltunen
1983). 따라서 본 연구에서도 방사선 조사에 따라 차가 버섯 추출물의 항암활성이 증가된 원인으로 환원력이나 유리 라디칼 소거활성 같은 항산화능이 발암과정 중에 서 중요한 역할을 하는 것을 감안할 때 암세포 증식을 저지하는 한 요인으로 작용할 것으로 판단되어 항산화 활성에 관하여 평가하여 비교하였다. 2. 감마선 조사된 차가버섯 추출물의 항산화 활성 DPPH는 생체내에 존재하는 라디칼은 아니지만 그 자 체가 홀수 전자를 갖고 있어 517 nm에서 강한 흡광도를 나타낸다 (Blois 1958). 따라서 항산화능이 있는 물질과 반응하게 되면 안정한 형태로 돌아가면서 흡광도 값이 감소한다. 방사선 조사된 차가버섯 추출물의 항암활성 증가에 관한 원인을 규명하기 위하여 방사선 조사 및 비조사된 차가버섯 추출물의 DPPH라디칼 소거능에 관 하여 평가하였다 (Table 1). 또한 대조구로써 합성 항산화 제로 알려진 BHT를 사용하였다. DPPH라디칼 소거능에 관하여 관찰한 결과 BHT는 IC50값이 36.1±0.60μg ml-1 로 관찰 되었으며, 비조사구의 경우 22.1±0.30μg ml-1, 조 사구의 경우 10 kGy로 조사된 차가버섯 추출물의 경우 9.0±0.20μg ml-1, 50 kGy의 조사선량에서는 17.7±0.45 μg ml-1, 100 kGy의 조사선량에서는 16.0±0.70μg ml-1, 150 kGy의 조사선량에서는 15.0±0.20μg ml-1으로 방사 선 조사선량에 유의적으로 라디칼 소거능이 증가하는 것으로 관찰되어 천연 항산화제로써 높은 잠재력을 가 지고 있는 것으로 사료된다. 차가버섯의 높은 항산화 활 성은 차가버섯이 함유하는 다양한 폴리페놀 성분으로부 터 기인되고, 이중 항산화 활성이 높은 성분으로는
lano-sterol, inotodiol, trametenolic acid 및 ergosterol peroxide 등
이 있으며 (Kahlos et al. 1989), 최근에는 inonoblins A, B, 및 phelligridins D, E, F 등의 구조를 갖는 물질들이 새롭 게 밝혀졌고, 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 보고되고 있다 (Lee et al. 2007). 또한 방사선 조사에 의한 이러한 항산화 활성 증가에 관하여 Kahlos et al. (1987)은 고분자 구조의 페놀성 화합물들이 방사선의 영향에 의하여 단 분자로 형태로 변환되어 항산화 활성이 증가한다고 보 고하였으며, Adamo et al. (2004)의 연구에 의하면 방사선 조사로 인하여 가용성 폴리페놀 증가하고 이러한 증가 로 인하여 항산화 활성이 증가한다고 보고하고 있다. 또 한 Kim et al. (2009)의 보고에 따르면 방사선의 조사 시 발생되는 이온화 에너지는 고분자의 polyphenol compound 의 연결 고리인 glycosidic bond를 절단하여 단분자로 변 형시키고 이때 생성된 단분자는 고분자일때 보다 더 높 은 항산화 능력을 갖는다고 보고 하고 있어, 본 연구의 결과를 뒷받침한다. 또한 이러한 항산화 활성의 증가는 항암 활성과 밀접한 연관을 갖는다는 An et al. (2006)과 Lee et al. (2005)의 연구들을 근거로 추론하여 볼 때, 본 연구에서도 방사선 조사된 차가버섯 추출물에 관하여 암세포억제 능력이 증가한 것은 방사선 조사에 의해 차 가버섯 추출물 내에 함유되어 있는 거대 polyphenol com-pound의 변형에 따른 효과라 사료된다.
결
론
본 연구에서는 방사선 조사된 차가버섯 추출물의 암 세포 억제 활성에 관하여 평가하였다. 차가버섯 추출물 은 증류수를 이용하여 70�C에서 4시간 동안 열수 추출 하였으며, 얻어진 열수 추출물 (10 mg ml-1)에 10, 50, 100, 150 kGy의 방사선을 조사하여 방사선 조사에 따른 차가 버섯 추출물의 암세포 억제 활성 변화를 관찰하였고, 이 러한 암세포 억제 활성 변화에 따른 원인을 알아보기Table 1. DPPH radical scavenging activity (mean±standard
devia-tion) of the Chaga mushroom extract after gamma irradia-tion Groups IC50values (μg ml-1) BHT 36.1±0.60a1) 0 kGy 22.1±0.30b 10 kGy 19.0±0.20c 50 kGy 17.7±0.45c 100 kGy 16.0±0.70d 150 kGy 15.0±0.20d
1)Mean±standard deviation (n==3). a,b,c.dMeans values with different
super-script letters within a same column are significantly different at p⁄0.05. Fig. 2. Normal cell (RAW 264.7) survival percentage of
gamma-irradiated (10, 50, 100, 150 kGy) and non gamma-irradiated (0 kGy) Chaga mushroom extract (CME).
Cell survival (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 PBS 0 10 50 100 150
위하여 항산화 능력을 평가하였다. Human 기원의 위암 세포와 대장암세포를 통하여 암세포 억제 활성에 관하 여 관찰한 결과 방사선 조사에 따라 암세포 억제 활성 이 증가하는 것으로 관찰되었고 이러한 원인에 관하여 알아보기 위하여 방사선 조사 및 비조사구의 항산화능 을 DPPH 라디칼 소거능을 통하여 알아본 결과, 방사선 조사선량이 증가 할수록 항산화능이 증가하는 것으로 관찰 되어졌다. 이러한 결과들로 미루어 보아 방사선의 조사는 암세포 억제 활성과 항산화 활성이 증가하는 차 가버섯 추출물을 얻기 위한 효과적인 방법이라고 사료 된다.
사
사
본 연구는 한국원자력연구원의 기본연구사업 및 교육 과학기술부 지원 원자력 연구개발산업의 지원에 의해 수 행되었습니다.참 고 문 헌
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Manuscript Received: February 15, 2011 Revision Accepted: March 1, 2011
