서
론
키나아제 (kinase)는 특정한 단백질에 아데노신3인 ─ ─ 113 ──방사성
-
인산화반응을 이용한 바이오칩기반
고효율 키나아제 분석
최미희1,2∙강정애1,3∙노종국1∙이기택2∙정영진3∙박상현1,* 1한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소 방사선생명공학연구부 2충남대학교 식품공학과, 3충남대학교 식품영양학과An Efficient Kinase Assay Based on a Biochip
Using Radio-phosphorylation
Mi Hee Choi1,2, Jung Ae Kang1,3, Jong Kook Rho1, Ki-Teak Lee2
Young Jin Chung3and Sang Hyun Park1,*
1Radiation Research Division for Biotechnology, Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea
2Department of Food Science and Technology, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea
3Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea
Abstract-- Kinases are of considerable interest to researchers involved in drug discovery and devel-opment, because of their role in a wide variety of diseases. Phosphorylation is a ubiquitous cellular regulatory mechanism found in all cells of the body. It occurs through the addition of a phosphate group to an amino acid residue via the transfer of a terminal phosphate from an adenosine triphos-phate (ATP) molecule catalyzed by kinases. In this study, an efficient kinase assay based on a bio-chip using radio-phosphorylation was established. It was found that the analytical method using radio-phosphorylation is hyper-sensitive and time saving when compared with other conventional analytical methods using ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and RIA (radioimmunoas-say). Results of the study indicate that radio-phosphorylation was effectively used for detecting the activity of cAMP-dependent protein kinase and revolutionized kinase research by making possible the rapid and specific measurements of kinases in minute amounts. Further, the biochip can be used to rapidly screen for kinases and kinase inhibitors resulting in diagnostic and therapeu-tic agents.
Key words : Kinase assay, Radio-phosphorylation, Biochip
* Corresponding authors: Sang Hyun Park, Tel. +82-63-570-3370 Fax. +82-63-570-3371, E-mail. [email protected]
산(ATP)으로부터 인산기를 붙여 인산화(phosphorylation) 시키는 효소로서 신호전달 기작에서 매우 중요한 위치 를 차지하고 있다. 키나아제는 인간 유전체 중에 약 2% 정도에 해당되는 518개의 코딩 (coding) 유전자가 있으며
(Manning et al. 2002), 전체 단백질 중 약 30% 정도가 키 나아제에 의해 인산화된다(Pinna et al. 1996; Cohen 2000). 키나아제에 의한 단백질의 인산화는 대사 (metabolism), 전사(transcription), 세포주기(cell cycle progression), 세포 사멸(apoptosis), 분화(differentiation) 등의 과정을 조절하 며 신경 (nervous system) 및 면역체계 (immune system)의 기능에도 중요한 역할을 한다.
세포내 일련의 신호전달 단계 (cell signal transduction
cascades)는 성장인자(growth factors),
사이토카인(cytoki-nes), 호르몬(hormones) 등과 같은 외부 인자들이 세포 표 면 수용체 (cell-surface receptor)에 붙음으로서 외부의 신 호가 내부로 전달된다. 외부로부터 전달된 신호의 전파 (propagation) 및 증폭 (amplification)은 다양한 효소들이 관여하고 있으며, 많은 신호 전달 효소들이 단백질 수식 화(post-translational modifications)를 통해 신호를 전파한 다. 그 중 키나아제에 의한 인산화가 가장 대표적인 단백 질 수식화이다(van der Geer et al. 1994). 인산화는 신호 전 달 효소가 그 기능을 할 수 있도록 활성화(activation) 시 킨다. 이러한 인산화를 통해 일어나는 신호전달 네트워크 는 매우 엄격하게 조절되고 있다 (Davis 2000). 일반적인 정상세포는 외부 자극을 통해 분열과 증식 을 계속하게 된다. 이러한 과정을 통제하는 단계로 세포 주기, 증식, 신호전달 체계가 있으며, 수명을 다한 세포는 세포사멸이 일어난다. 하지만, 정상세포에서 어떠한 한 단계에서 비정상적인 과정이 발생하게 되면 그 세포는 비정상적인 세포로 변하게 되며 곧 종양 또는 암으로 발전할 가능성이 매우 높아진다. 암세포의 일반적인 특 징은 세포의 비정상적인 증식이 나타나는데 이러한 현 상은 일련의 생화학적 반응에서 키나아제의 기능에 결 함 또는 변형으로 인한 분해 또는 과도한 활성화로 인 해 세포주기의 변화, 유사분열의 조절실패 및 과도한 성 장신호 전달 등으로 발생된다 (Blume-Jensen and Hunter
2001).
백혈병 치료제로 개발된 글리벡 (Gleevec, Novartis)은 암세포만을 공격하도록 만들어진 표적항암치료제이다. 글리벡이 표적으로 하는 특정 물질이 타이로신 키나아제
(tyrosine kinase)이다. 이레사 (Iressa, AstraZeneca)는 폐암 치료제로 개발되었으며, 타이로신 키나아제의 활동을 선 택적으로 억제함으로써 세포내 신호전달을 차단시켜 암 세포의 활성을 저해시킨다. 단백질 키나아제 C (PKC)는 세포증식에 중요한 역할을 하는 효소로 변이가 발생하 면 세포증식 조절의 교란이나 종양세포의 성장을 촉진 한다. 많은 암 환자에게서는 PKC가 정상인에 비해 더 많이 검출되고 있다 (Murray et al. 1999; Koivunen et al.
2006). 따라서 단백질의 수식에 관련된 키나아제의 활성 을 고감도로 정확히 분석하면 암이나 질환을 조기에 진 단할 수 있고 치료제도 개발할 수 있다. 키나아제 분석 법으로는 항체에 형광물질을 부착하여 항원-항체간의 결합반응을 이용한 분석기술로 효소결합 면역흡수 분석 법 (ELISA)과 방사성 면역분석법 (RIA)이 주로 사용되어 지고 있다. 그러나 항원-항체를 이용한 면역분석법은 분 해능이 높지 않고 단일강도측정에 기반하기 때문에 검 출감도가 낮으며, 항원-항체간의 반응을 이용하게 때문 에 높은 농도의 항원 또는 항체(mg 정도의 양)가 필요하 고 비특이적 반응이 쉽게 일어나며 분석시간이 오래 걸 린다. 따라서 면역분석법의 단점을 극복할 수 있는 고감 도의 새로운 분석방법이 요구되고 있다. 다국적 인간게놈연구사업 (HUGO)이 추진했던 인간게 놈프로젝트가 종료됨에 따라 방대한 염기서열이 해독되 었으며, 사람에 뒤이어 동물, 식물, 미생물의 유전체도 속 속 밝혀졌다. 이에 따라 사람을 비롯한 생명체의 유전질 환, 불치병, 식품유해 등을 진단 및 검지하고 생명현상을 분석하는 많은 장치들이 개발되고 있는데, 그 대표적인 것이 바이오칩의 등장이다 (최 등 2007). 최근 검출기기 의 감도가 한계에 달한 시점에서 극미량 검출을 위한 최적의 센서를 구현하기 위하여 센서칩 제작기술에 많 은 연구가 요구되고 있다. 지금까지 바이오칩의 개발은 칩의 형태, 제조방법, 프르브 (probe)와의 상호작용, 정보 처리, 칩의 응용 등 많은 부분에서 연구되어 왔으나 시료 의 고속처리 및 감도의 향상, 신속성, 정확성 향상 등의 해결해야할 과제가 남아있다 (Spisak et al. 2007). 따라서 본 연구에서는 방사성-인산화반응을 이용하여 바이오칩 기반 고효율 키나아제 분석법을 확립하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재 료1) Aldehyde coated slides (ALCS-25, Nuricell, Korea) 2) HybriSlipTM(Sigma-Aldrich, USA)
3) cAMP-dependent protein kinase (Promega, USA) 4) 0.4 mg ml-1E. coli malic enzyme-kemptide
(EMalE-Kemptide)
5) [γ-32P]ATP (IZOTOP, Hungary) 6) Microarry (QAarray mini, Genetix, UK)
8) Microarry printing (Genetix Pintheads, ArrayIT, USA) 9) Imaging plates (FUJIFILM, Japan)
10) IP Eraser3 (FUJIFILM, Japan)
11) Fluorescent image analyzing system (FLA-7000, FUJIFILM, Japan)
2. Microarray를 이용한 키나아제 기질의 칩 상 고정화 조건 확립
키나아제 기질로 사용된 융합 단백질(E. coli mailc
enzy-me-kemptide fusion protein)은 유전자 클로닝을 통하여 획 득하였다(Park et al. 2007). 키나아제 기질 융합 단백질을 고정하기 위하여 알데히드가 처리된 슬라이드 글라스
(Fig. 1)를 기질을 집적해 주는 마이크로어레이 (Fig. 2)의
slide holder에 위치한 후 진공을 작동시켜 슬라이드를 고 정시켰다. 마이크로어레이어의 조작을 위한 head, plate
source, slide design, slide layout, slide pin 수, pin의 washing 조건 설정 개요는 Table 1에 나타내었다.
정제된 융합단백질 0.4 mg ml-1 EMalE-kemptide를
well plate (Genetix plate, 384×7,022)에 최소 5μl를 넣고
마이크로어레이어로 알데히드가 처리된 슬라이드 글라 스에 스팟 (spot)의 지름이 약 450~500μm, 스팟간의 간 격이 5,000μm가 되도록 집적하였고, 마이크로 어레이를 통하여 스팟 횟수의 최적 조건을 확인하기 위하여 1번, 3번, 5번, 7번씩 집적하였다. 또한, 슬라이드 상에서 키나 아제의 최다 검출 조건을 알아보기 위하여 field layout을 7×7로 설정하여 집적하였다. 기질 (0.4 mg ml-1EMalE-kemptide)이 집적된 알데히드 가 처리된 슬라이드를 습윤 챔버(humid chamber)안에 넣 고 30�C에서 1시간 동안 반응시켜준 후 PBS (200 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM Na2HP4, 2 mM KH2PO4, pH 7.5)로 알데히드가 처리된 슬라이드 상의 부산물을 씻어내고 실 온에서 약 5분 동안 수분을 제거하였다. 3. 키나아제 기질의 칩 상의 반응 조건 확립 키나아제 기질 융합단백질이 고정된 슬라이드 글라스 칩 위에 키나아제 반응용액(40 mM Tris-HCl, 20μM MgCl2,
100μM ATP, 100 μCi [γ-32P]ATP와 50 unit ml-1
cAMP-dependent protein kinase를 포함하는 키나아제 완충용액)
25μl를 분주하고 커버 슬립(cover slip, HybriSlipTM)으로
덮어 37�C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS로 3회 세척하였고, 실온에서 약 5분 동안 수분을 제거하였 다 (Ko et al. 2009). 4. 방사성-인산화반응 이용 바이오칩 기반 키나아제 분석 키나아제 기질 융합 단백질이 고정된 슬라이드 칩 위 Fig. 1. Aldehyde coated slide.
Fig. 2. Microarray (QAarray mini, Genetix, UK).
Table 1. Spotting conditions of microarray
Program Parameters
Head 1-Pin microarraying head
Plate holder: Source plate holder (1×5) Source Plate type: Genetix plate 384×7,022
Total plate: 1 Plate Source order: Row
Slide: 3×1′′ Slide (1-Pin/10-Field) Slide design Field layout
Arraying pattern: Row count 2, Column count 2, Row pitch 5,000, Column pitch 5,000
Slide layout Sample slide: E. coli malic enzyme-kemptide Number of blots: 10
Max stamps per ink: 100
Print Number of stamps per spot: 1, 3, 5, 7 Stamp time (ms): 75
Inking time (ms): 2,000 Wash Water, Time (ms): about 3,000
에서 키나아제에 의한 기질의 방사성-인산화반응
(radio-phosphorylation)으로부터 생성된 방사선의 강도를 측정 하기 위하여 상기 반응시킨 바이오칩을 IP Eraser에서
45분 동안 자연방사선이나 백그라운드를 제거시킨
Imag-ing plate에 6시간 감광하였다. 감광 후 Fluorescent image
analyzing system (Fig. 3)을 사용하여 키나아제를 분석하 였다.
결과 및 고찰
선행 연구에서 키나아제 기질인 EMalE-kemptide에 대 한 방사성-인산화 반응이 키나아제의 농도에 따라 유의 성 있게 증가함을 확인 하였다 (Park et al. 2007). 본 연구 에서는 키나아제 기질인 0.4 mg ml-1EMalE-kemptide 융 합 단백질을 알데히드가 처리된 슬라이드 글라스 위에 집적시키고 집적 횟수에 따른 방사성-인산화 반응을 확 인하였다. 한 지점에서 집적 되는 횟수를 각각 1번, 3번, 5번, 7번으로 나누어 집적하였다. 슬라이드 글라스에 집적한 기질을 50 unit ml-1cAMP-dependent protein kinase와
100μCi [γ-32P]ATP로 반응시킨 후, 집적 횟수에 따른
EMalE-kemptide 융합 단백질의 방사성-인산화반응을
Imaging Plate에 감광시켜 Fluorescent image analyzer로 분 석하였다. 키나아제에 의한 방사성-인산화반응 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 1~7번 집적한 모든 기질에 대해 방 사성-인산화반응을 확인 할 수 있었으며, 같은 농도의 기 질이지만 집적 횟수에 따라 감도가 조금씩 차이나는 것 을 확인할 수 있었다. 슬라이드 글라스에 기질을 집적한 횟수가 증가 할수록 방사성-인산화가 점차 증가되는 현 상을 볼 수 있었으며, 집적 횟수 5번과 7번에서의 감도 는 크게 차이가 나지 않는 것을 확인 할 수 있었다. 한 슬라이드 상에서 검출될 수 있는 키나아제의 종류 및 수를 확인하기 위해 7×7로 집적하였고, 50 unit ml-1
cAMP-dependent protein kinase와 100μCi [γ-32P]ATP를
이용하여 바이오칩에 방사성-인산화반응의 적용 유효성 을 알아보았다 (Fig. 5). 이와 같은 조건으로 집적하여 방사성-인산화반응을 검출 할 경우 약 1,470개의 종류의 키나아제를 확인할 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 마이크로어레이어를 이용하면 동시에 효율적으로 여러 종류의 키나아제를 검출할 수 있을 것으로 예상된다. 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)이나 방사성 면역분 석법 (RIA)의 경우, 기질의 특정 아미노산을 인산화 시
Fig. 3. Fluorescent image analyzing system.
Fig. 4. Radio-phosphorylation based on the number of stamps per
spot on a aldehyde coated slide.
Printing mechanism
1 3 5 7
Fig. 5. Kinase assay based on a biochip using
radio-phosphory-lation.
7×7
킨 후 인산화된 아미노산 부위에 형광물질이나 방사성 동위원소가 결합되어 있는 2차 항체를 반응시켜야하는 간접검출법으로 많은 양의 시료가 필요하며, 비특이적 반응으로 인하여 정확한 정량분석을 하기에는 부족한 면이 있다. 형광물질을 이용한 항원-항체 분석법은 기질 의 검출 한계가 1.5 pg이다 (Lee et al. 2004). 그러나, 방사 성-인산화반응을 이용한 분석법의 경우, 기질에 직접적 으로 방사성 동위원소 (32P 또는 33P)가 표지되는 인산화 반응이므로 비특이적 반응이 매우 낮으므로 반응 후 정 확하게 검출결과를 정량화할 수 있을 뿐만 아니라, 극미 량의 기질 농도 (0.005 pg의 검출 한계)도 검출이 가능하 여 고감도의 검출효과까지 얻을 수 있다. 본 연구의 결 과는 바이오칩의 장점인 많은 양의 정보를 신속하게 분 석할 수 있는 점과 방사성-인산화반응의 장점인 정량화 및 고감도의 검출효과를 보여 주고 있다. 또한 극미량의 시료를 사용하여 한 번에 많은 양의 정보를 분석, 검출 할 수 있어 기존의 방사성 면역분석법과 비교할 때 취 급자의 방사선 피폭과 같은 위험도를 극소화 할 수 있 다. 따라서 본 연구의 방사성-인산화반응을 이용한 바이 오칩 기반 키나아제 분석법은 새로운 치료제로 가능한 키나아제의 저해물질의 신속, 정확한 발굴과 백혈병, 암 등과 같은 질병의 조기 진단에 효율적으로 활용될 수 있다. 더 나아가서는 신약 후보물질 및 생리활성 물질을 대량으로 신속하게 탐색할 수 있는 고속탐색기술 (High Throughput Screening)에 활용될 수 있을 것이다.
사
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이 연구는 교육과학기술부에서 시행하는 방사선기술 개발사업의 일환으로 수행되었습니다.참 고 문 헌
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Manuscript Received: May 14, 2010 Revision Accepted: May 24, 2010
