Conditional KO 마우스 제작법과 관련 동향

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Conditional KO 마우스 제작법과 관련 동향

양 용 렬

울산과학기술원 E-mail: [email protected] 요약문 유전자 타기팅(Gene targeting) 기술은 특정 유전자를 동물에서 제거하는 기술로서, 유전자의 기능 규명 및 질병 연구에 활용되고 있다. Conditional KO 마우스는 gene targeting 기술을 이용하여 제작하게 되며, 연구자가 원하는 시기에 혹은 원하는 조직에서 특이적으로 특정 유전자를 삭제할 수 있는 마우스이다. 따라서 conditional KO 마우스 모델은 연구의 한계가 있는 conventional KO 마우스보다 다양한 연구에 활용되고 있다. KO 마우스 모델의 중요성 때문에 세계 주요국들이 국제공동프로젝트를 진행하고 있으며, 현재까지 수 많은 유전자 조작 배아줄기 세포 및 마우스 라인이 제작되었고 표현형 분석 및 데이터 구축을 하여 공유하고 있다. 유전자 조작 기술의 연구 개발을 통해서 다양한 응용이 가능한 conditional KO 마우스의 제작이 가능해졌고, 제작하는 방법 및 시간이 단축되고 있다. 본고에서는 conditional KO 마우스 제작의 기술적인 부분과 최신 다양한 gene targeting 기술 동향을 정리하였다.

Key Words: Conditional KO 마우스, Cre-loxP, chimera 마우스, germline transmission, Knockout-first conditional allele, IKMC, IMPC, genome editing

목 차

1. 서론 2. Conditional KO 마우스 제작과 이해 2.1 Cre-loxP 시스템 2.2 타기팅 벡터 제작 2.3 상동 재조합이 일어난 배아줄기 세포 선택

2.4 Chimera 마우스 제작 및 생식세포전달(germline transmission) 3. 마우스 모델 개발과 활용의 국제적 추세

3.1 국제 KO 마우스 컨소시움; International Knockout Mouse Consortium (IKMC)

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3.2 국제 마우스 표현형 컨소시움; International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC) 4. Conditional KO 마우스의 조직 특이적 유전자 삭제 5. DNA 이중나선절단을 이용한 conditional KO 마우스 제작 3. 결론 4. 참고문헌

1. 서론

사람과 마우스의 게놈 시퀀싱을 통해서 단백질을 코딩하는 유전자는 약 20,000개 정도가 있다고 밝혀졌다. 생명과학에서 중요한 과제 중에 하나는 모든 유전자의 기능을 규명하는 것이다. 유전자 타기팅을 통해서 만들어진 KO 마우스는 유전자의 기능 규명을 위한 중요한 마우스 모델이다. 유전자 타기팅은 상동 재조합(Homologous Recombination)을 이용하여 마우스 배아 줄기세포의 유전자를 조작하는 기술이다. 이 기술 초기단계에는 표적 유전자를 발생과정부터 결손시켜 제작하였다. 따라서 초기 발생에 중요한 기능을 하는 유전자를 KO 시키면 발생과정 중에 배아가 사망하게 되거나 태어나서 바로 사망하게 된다. 이러한 문제 때문에 발생단계 이후의 유전자 기능 연구가 어려웠다. 하지만 이러한 어려움을 해결한 마우스가 conditional KO 마우스이다. 이 마우스는 발생과정에 유전자가 타기팅 되었지만 연구자가 원하는 조직 및 시기에 유전자 결손을 유도할 수 있다. 현재는 이 기술을 다양하게 응용하여 유전자 기능 및 질병 연구에 이용되고 있다. 연구자가 연구 목적에 맞게 자체적으로 conditional KO 마우스를 제작하기도 하고, 미국, 캐나다, 유럽 중심으로 이루어진 국제 KO 마우스 컨소시움 International Knockout Mouse Consortium (IKMC)의 프로젝트에서 만들어진 유전자 조작 마우스를 분양 받아 연구에 이용하기도 한다. 최근에는 DNA 이중나선절단 효소를 이용한 보다 효율적인 제작 방법들이 개발되어 이용되고 있다. 본고에서는 conditional KO 마우스의 제작 방법과 원리의 이해를 돕고, 최근 개발된 conditional KO 마우스 제작 방법의 동향에 대해서 소개하고자 한다.

2. Conditional KO 마우스 제작과 이해

2.1 Cre-loxP 시스템

Conditional KO 마우스는 bacteriophage P1으로부터 유래한 Cre-loxP 시스템을 이용하여 제작이 가능했다. Cre 재조합 효소 (cre recombinase)는 두 개의 loxP 부위를 인식하여 재조합을 일으킨다. loxP는 34bp로 이루어진 DNA 단편으로 양끝에 두 개의 13-bp palindromic 시퀀스 부분과 중간에 8-bp asymmetrical core space 부분으로 구성되어 있다[1]. 재조합 효소는 palindromic 시퀀스에 결합하고 spacer 부위의 DNA를 자르고 교환한 후 DNA를 다시 연결 시킨다. 재조합은 spacer의 방향성에 따라 두 loxP 부위 사이에 있는 DNA 시퀀스가 삭제 (excision) 또는 역위 (inversion)가 일어난다. loxP 부위가 같은 방향이면 삭제가 일어나고, 반대방향으로 위치하고 있으면

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역위가 일어나게 된다 (그림1) [2]. FLP-FRT 시스템은 yeast로부터 유래 되었으며, flippase (FLP)는 Cre 재조합 효소와 같은 역할을 하는 interase family이고 FRT 부위를 인식하여 재조합을 일으킨다[3]. Cre-loxP와 FLP-FRT 시스템의 재조합은 동일한 메커니즘으로 일어난다 (그림1). 따라서 FLP-FRT 시스템 또한 conditional KO 마우스 제작 시 활용되고 있다. Conditional KO 마우스는 타깃 유전자 exon 부위의 양끝에 loxP 시퀀스가 삽입되어 있어 Cre 재조합 효소를 발현하는 Cre transgenic 마우스와 교배하게 되면 타깃 유전자가 삭제가 된다.

그림 1. Cre-loxP와 FRT-FLP 시스템

2.2 타기팅 벡터 제작

Gene targeting은 배아 줄기세포에 주입한 타기팅 벡터 (targeting vector) 의 상동 재조합(Homologous Recombination)을 통해서 이루어진다. 타기팅 벡터 제작은 타깃 유전자의 정보를 먼저 알아야 디자인이 가능하다. 유전자로부터 만들어진 단백질의 사이즈, functional domain의 위치를 확인하고 유전자의 위치, intron/exon 정보, 사이즈, 그리고 intron에 있는 enhancer등을 알아야 한다. 이러한 정보를 확인하여 타기팅 벡터의 상동재조합이 일어나도 유전자 발현에는 영향이 없으며 Cre-loxP 시스템으로 타깃 exon을 삭제했을 때만 frameshift가 일어나 단백질이 만들어지지 않는지 고려해야 한다.

아래 Genomic database 사이트에는 많은 정보들을 확인할 수 있다; •Ensembl http://www.ensembl.org/Mus_musculus/

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•EntrezGene http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene • Mouse Genome Informatics http://www.informatics.jax.org/

•NCBI Mouse Genome Resource http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/ •UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway

그림 2. Conditional KO targeting vector 제작

배아줄기세포는 129Sv strain 또는 C57BL/6J (B6) strain 마우스로부터 유래한 것을 사용한다. 하지만 B6 보다 germline transmission 효율이 높은 129Sv 배아줄기 세포를 더 많이 사용해 왔다. B6 background에서 연구를 하기 위해서는 다시 오랜 기간 B6 마우스와 backcross 교배를 해야 한다. 이러한 시간 문제 때문에 B6 배아줄기세포의 germline transmission 효율을 개선시키는 연구도 진행되어, 현재는 B6 배아줄기 세포로도 gene targeting을 하여 시간을 단축하기도 한다.

Conditional KO 마우스의 타기팅 벡터에는 상동 재조합을 위해서 두 homology arm이 필요한데, long arm은 최소 4kb 가 되어야 하고, short arm은 적어도 1~3kb는 되어야 한다 (그림2). 그리고 positive selection을 위한 Neo 유전자, Neo 유전자 양 옆에 FRT site, 타깃 유전자의 삭제 시킬 exon과 양 옆에 loxP site, negative selection을 위한 diphtheria toxin (DTA)이 클로닝 되어야 한다 (그림2). 타깃 유전자의 homology arm과 loxp site 사이에 삽입할 DNA fragment는 primary 마우스 세포의 genomic DNA 또는 BAC (Bacterial Artificial Chromosome)으로부터 PCR을 통해서

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타기팅 벡터에 클로닝 할 수 있다. BAC은 100-300kb의 genomic DNA를 포함한 사이즈가 큰 plasmid로써 원하는 유전자를 포함한 BAC clone을 구매할 수 있다.

2.3 상동 재조합이 일어난 배아줄기 세포 선택

제작된 circular 타기팅 벡터는 제한 효소로 linearization (one-cut) 하여 electroporation 방법으로 마우스 배아줄기세포에 주입한다. Single 배아줄기 세포는 colony를 형성하게 되고, 이 colony는 하나씩 96 well plate에 옮겨 배양한다. 타기팅 벡터는 여러 가지 형태로 재조합이 일어나게 되는데, 그 중에서 타기팅 하려는 유전자 위치에서 상동 재조합이 일어난 배아줄기세포 clone을 골라내야 한다. 상동 재조합은 long arm과 short arm에서 일어나기 때문에 Neo 유전자는 genomic DNA 안으로 삽입이 되고 DTA 유전자는 삽입되지 않는다. 따라서 비특이적으로 일어난 상동 재조합으로 DTA를 포함한 배아줄기 세포는 사멸하게 되고, Neo를 포함한 배아줄기 세포는 G418를 처리한 배지에 살아 남게 된다. 최종적으로 정확한 상동 재조합이 일어난 세포들을 찾기 위해서 PCR 이나 southern blot 스크리닝을 통해서 확인한다.

2.4 Chimera 마우스 제작 및 생식세포전달(germline transmission)

스크리닝을 통해서 확보한 유전자 타기팅 된 배아줄기 세포 (흰색 B6 or 흰색 129Sv 마우스)는 blastocyst에 microinjection을 통해서 넣어준다. 이 때 blastocyst는 B6 (검정색) 마우스로부터 분리하여 사용한다. 이렇게 다른 색을 사용하게 되면, 대리모에서 태어난 chimera 마우스는 두 가지 coat color가 섞여 나온다. 흰색 부분은 유전자 조작해서 넣어준 배아줄기 세포로부터 분화된 것이고, 검정색은 blastocyst로부터 분화된 것이다. 따라서 chimera 마우스는 유전자 타기팅이 특정 기관 및 조직에서만 되어 있다. Chimera 마우스 중에 유전자 타기팅된 배아줄기 세포(흰색)가 생식세포로 전달 (germline transmission)된 마우스는 다음 세대 자손에 유전자가 다시 전달되기 때문에 모든 조직에서 유전자 타기팅 된 마우스가 만들어지게 된다. 이 마우스를 확인하기 위해서 chimera 마우스와 B6 마우스 교배 하여 coat color를 확인해야 한다. 생식세포전달이 된 마우스는 B6 (검정색)와 교배하게 되면 갈색 마우스가 나오게 된다. 이 갈색 마우스가 모든 조직에서 유전자가 타기팅 되어 있는 conditional KO 마우스가 된다 (그림 3) [4].

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그림 3. Chimera 마우스 제작 및 germline transmission

3. 마우스 모델 개발과 활용의 국제적 추세

3.1 국제 KO 마우스 컨소시움; International Knockout Mouse Consortium (IKMC)

모든 유전자에 대한 KO 마우스를 제작하기 위해서 세계 주요국들은 2008년 국제협력프로젝트 (국제 KO 마우스 컨소시움)를 시작하였고 연구 성과와 기술을 서로 공유하고 있다. 각 기관에서는 유전자 타기팅을 위해서 고속화된 스크리닝 기술을 개발하여 효율적으로 마우스 모델을 개발하고 있다[5]. 아래 기관이 국제 KO 마우스 컨소시움에 참여하고 있다.

European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM) NIH-funded Knockout Mouse Project (KOMP)

North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM) Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM)

국제공동프로젝트를 통해서 약 11,000개 gene trap 유전자 KO 마우스를 만들 수 있는 배아줄기 세포를 확보하였다. 또한 약 15,000 Knockout first conditional targeting vector와 약 13,000 knockout first conditional mutation이 된 배아줄기 세포를 제작하였다.

3.2 국제 마우스 표현형 컨소시움; International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC)

IMPC는 공동프로젝트로 제작된 KO 마우스와 기존에 제작된 마우스의 표현형을 분석하고 database를 구축하려고 설립되었다. 궁극적으로 KO 마우스의 표현형 분석을 통해서 특정유전자와 인간질병의 관련성을 체계적으로 분석하려는 목표를 두고 있다. 세계 주요국의 연구 그룹들로

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Conditional KO 마우스 제작법과 관련 동향 양용렬 Page 7 / 11 구성되어 IMPC가 시작되었지만, 현재는 점차 참여국가가 확대되어 가고 있다. http://www.mousephenotype.org 사이트에서 자세한 정보를 확인할 수 있다.

4. Conditional KO 마우스의 조직 특이적 유전자 삭제

Conditional KO 마우스는 유전자 타기팅이 되더라도 WT 마우스와 동일하게 유전자가 정상적으로 발현한다. 조직 혹은 시기 특이적으로 타기팅 유전자를 삭제하기 위해서는 다양한 Cre recombinase를 발현하는 transgenic 마우스와 교배하여 연구에 이용할 있다. 이 교배 전에 불필요한 positive selection 유전자인 Neo를 먼저 제거한다. Neo의 양 옆에 FRT 사이트가 위치하기 때문에 Flippase를 발현하는 transgenic 마우스와 교배를 하여 Neo를 제거한다. PCR을 통해서 Neo가 제거된 것을 확인한 마우스와 원하는 Cre transgenic 마우스와 교배를 하여 타깃 유전자 삭제를 할 수 있다 (그림4).

IKMC에 참여하는 기관은 대량으로 빠르게 유전자 타기팅 된 마우스를 제작하기 위해서 다양한 기술을 활용하고 있다. 이 기관들에서 대표적으로 사용하는 두 가지 벡터는 viral gene trap 와 Knockout-first conditional KO 벡터이다. IKMC의 viral gene trap 벡터 splicing acceptor (SA)를 가지고 있어서 유전자 intron에 삽입되면, 정상적인 splicing을 막고 삽입된 SA에 의해서 splicing이 일어나고 transcription이 정지된다. SA를 포함한 벡터 양 끝에는 서로 반대 방향의 FRT와 loxP를 각각 삽입하여, FRP를 발현 시키면 inversion이 일어나게 되어 SA가 기능을 하지 못하게 된다. 그렇게 되면 다시 정상적으로 유전자 발현이 일어난다. 이 마우스에 Cre 재조합 효소를 발현시키면 또 다시 inversion이 일어나고 SA가 활성을 가지게 된다 (그림 5).

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그림 4. FLP와 Cre 재조합 효소에 의한 유전자 삭제

IKMC에서 사용하는 Knockout-first conditional KO 벡터를 이용하면 gene trap 유전자 KO 마우스가 먼저 만들어지게 된다 (그림5) [6]. 이 마우스가 일반적으로 사용된 conditional KO 마우스와 다른 점은 gene trap KO 마우스가 먼저 제작된 후에 FLP transgenic 마우스와 교배하면 일반적인 conditional KO 마우스가 만들어진다는 점이다. FLP를 발현시키면 FRT 사이트 사이에는 있는 SA, LacZ (reporter 유전자), Neo (positive selection 유전자)가 삭제되어 gene trap 시스템이 기능을 하지 못하고 conditional allele의 사용이 가능해 진다. 이 마우스를 이용하여 다양한 Cre transgenic 마우스와 교배하여 조직 특이적 유전자 KO을 시킬 수 있다. 또한 연구자가 gene trap KO 마우스를 이용한 연구도 병행해야 한다면 불필요한 Neo 유전자를 Cre transgenic 마우스와 교배한 후에 사용하면 된다.

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그림 5. IKMC vector-targeted allele

5. DNA 이중나선절단을 이용한 conditional KO 마우스 제작

최근에 인공 nuclease를 이용하여 타깃 유전자를 효율적으로 KO 시킬 수 있는 기술들이 개발 되었다. ‘유전자 가위’라고 불리는 이 기술은 현재 3세대까지 개발 되었다. 이 기술들을 도입하게 되면 DNA의 double strand break (DSB) 손상이 생긴다. 세포는 두 가지 경로를 통해서 DNA의 손상을 수리하게 된다. 하나는 Non-Homologous End Joining (NHEJ) 로서 잘려진 DNA 가닥이 유사염기서열을 이용하지 않고 잘린 말단을 바로 연결하거나 변이를 수반하여 교정하는 기작이다. 이 결과 손상 부위의 유전자 DNA 배열에 frameshift가 일어나게 되면 유전자 KO이 된다. 또 다른 하나는 homologous recombination (HR)로서, DNA 손상이 발생할 때 오류 없이 교정할 수 있는 메커니즘의 하나로, NHEJ와는 달리 유사한 염기서열을 주형으로 하여 DNA 말단이 연결되는 세포 내 수리 기작이다[7]. 이 HR 기작을 이용하면 conditional allele을 만들 수 있다. 유전자 가위 기술을 이용하여 타깃 유전자에 DSB를 만들고, DSB 부위에서 HR이 일어날 수 있도록 디자인한 template (loxp-target exon-loxp)를 주입하면 가능하다(그림 6). 1,2,3세대의 DSB를 유도하는 방법은 서로 다르다. 1세대인 ZFN (Zinc Finger Nuclese)기술은 3개 염기를 인식하는 DNA 결합모듈인 ZF (zinc finger)와 DNA의 인식 부위와 떨어진 곳을 자르는 제한 효소인 Fok1을 응용한 기술이다8_. 하지만 1개의 ZF 모듈이 3개를 동시에 인식하기 때문에 염기인식의 간섭을 일으키는 한계가 있다. 이러한 문제를 해결한 것이 제 2세대는 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)이다. ZFN 대신 식물병원세균으로부터 유래한 TAL effctor(TALE)를 이용하여 개발되었다[9]. TALE는 한 개 모듈이 한 개의 염기를 인식하기 때문에 염기인식의 간섭이 거의 일어나지 않는다. 제 3세대는 Archaea와 박테리아의 고유 면역 기작으로부터 유래한 CRISPR/Cas 시스템이다[10]. 타깃 부위를 인식하는 시퀀스를 가진 gRNA (guide RNA)는 타깃 부위에 결합하고 Cas9 nuclease 에 의해서

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Conditional KO 마우스 제작법과 관련 동향 양용렬 Page 10 / 11 DNA가 잘리게 된다. 이러한 유전자 가위 기술들은 벡터 디자인이 간편하고, 배아줄기 세포를 이용하기 않고 수정란에 직접 기술을 도입하여 유전자 타기팅 하기 때문에 germline transmission 확인 및 backcross 교배하는 시간이 필요 없게 된다. 그림 6. 유전자 가위 기술을 이용한 conditional allele 제작

6. 결론

유전자 타기팅 기술이 도입되면서 많은 KO 마우스가 제작되었고, 이에 따라 유전자들의 기능이 밝혀지고 있다. KO 마우스 모델은 유전자 기능 규명뿐만 아니라 질병 연구에도 매우 중요한 연구수단이 되었다. 이에 따라 KO 마우스의 제작과 더불어 관련 기술들이 급속도로 개발되었다. 또한 IKMC와 IMPC의 국제공동프로젝트로 인해서 세계 주요국에 의해서 KO 마우스들이 제작되고 있고, KO 마우스 분양을 통해서 유전자 기능연구가 더욱 활발하게 진행되고 있다. 현재 유전자 타기팅 기술 인프라가 없는 일반 기초연구자들이 IKMC에서 유전자 타기팅 된 KO 마우스를 쉽게 구매하거나, 유전자 타기팅 기술을 보유한 회사에 제작 의뢰를 하고 있다. 연구자들은 유전자 기능 연구를 위해 기본적인 유전자 타기팅 기술을 이해하고, 보유한 KO 마우스의 특성을 파악하여 활용해야 한다. 이러한 마우스 모델을 이용한 연구는 유전자 기능규명을 통한 생명현상의 이해를 돕고 질병의 이해와 극복에 크게 기여할 것으로 기대된다.

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7. 참고문헌

1. Hoess, R. H., Wierzbicki, A. & Abremski, K. The Role of the Loxp Spacer Region in P1 Site-Specific Recombination. Nucleic Acids Research 14, 2287-2300, doi:DOI 10.1093/nar/14.5.2287 (1986).

2. Sauer, B. & Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-5170 (1988).

3. Dymecki, S. M. Flp recombinase promotes site-specific DNA recombination in embryonic stem cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 6191-6196 (1996).

4. Yu, Y. J. & Bradley, A. Engineering chromosomal rearrangements in mice. Nat Rev Genet 2, 780-790, doi:Doi 10.1038/35093564 (2001).

5. Skarnes, W. C. et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature 474, 337-342, doi:10.1038/nature10163 (2011).

6. Rosen, B., Schick, J. & Wurst, W. Beyond knockouts: the International Knockout Mouse Consortium delivers modular and evolving tools for investigating mammalian genes. Mamm Genome 26, 456-466, doi:10.1007/s00335-015-9598-3 (2015).

7. Ciccia, A. & Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell 40, 179-204, doi:10.1016/j.molcel.2010.09.019 (2010).

8. Szczepek, M. et al. Structure-based redesign of the dimerization interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 25, 786-793, doi:10.1038/nbt1317 (2007).

9. Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326, 1509-1512, doi:10.1126/science.1178811 (2009).

10. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821, doi:10.1126/science.1225829 (2012).

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