Columbia 식물에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 특정한 primer (Table 1)와 Nanohelix사 제품의 buffer와 polymerase를 사용하여 94℃에서 3분동 안 반응하였고, 94℃에서 30초간, 52℃ 30초간, 72℃ 1분동안 25회동안 반응 하였고, 마지막으로 72℃에서 5분동안 반응시켰다.
6-2. 클로닝 벡터로의 클로닝 방법
PCR product를 pJET vector에 ligation 시킨 후 상온에서 overnight으로 반응시켰다. 다음날 ligation product 5 μl에 competent cell 100 μl를 첨가해 얼음에 10분동안 반응시킨 후, 42℃ 항온수조에서 45초 반응시킨 후 바로 얼음에 2분동안 방치하였다. LB 액체배지를 500 μl를 첨가한 후 37℃
배양기에서 20분동안 배양한 후, 37℃ shaking incubator에서 40분동안 배양하였다. 그 후, ampicillin이 함유된 LB 고체배지에 도말하였고, 37℃
배양기에서 overnight동안 배양하였다. Colony를 주형으로 PCR을 진행하여 insert DNA를 확인한 후, LB 액체배지 3 ml에 colony 한 개를 이쑤시개를 이용하여 넣어준 뒤 37℃ shaking incubator에서 overnight 시켰다.
Nanohelix사의 plasmid prep용 kit를 이용하여 plasmid DNA를 추출한 후
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37℃ 항온수조에서 특정한 제한효소로 절단하여 insert DNA을 확인하였다.
그 후, 염기서열을 분석하여 이상 유무를 확인한 후, 37℃ 항온수조에서 특정한 제한효소로 절단한 후 전기영동을 진행한 뒤, Nanohelix사의 gel purification kit를 이용하여 삽입된 DNA를 추출하였다.
6-3. Binary 벡터로의 클로닝 방법
삽입할 DNA의 끝 부분에 존재하는 같은 특정한 제한효소를 이용하여 reporter 유전자들이 삽입되어 있는 pCB308, pCB302 vector를 절단하고 염기서열이 이상이 없는 삽입할 DNA와 ligation을 시킨 후 상온에서 overnight을 시켰고, 5x UAS promoter가 삽입되어있는 pCB302는 삽입할 DNA의 끝 부분에 존재하는 같은 특정한 제한효소를 이용하여 절단한 후 염기서열이 이상이 없는 DNA와 ligation 시킨 뒤 상온에서 overnight 시켰다(Figure 5, 6, 7). 다음날 ligation product 5 μl에 competent cell 100 μl를 첨가하여 얼음에서 10분 동안 반응시킨 후, 42℃ 항온수조에서 45초 반응시킨 후 바로 얼음에 2분동안 방치하였다. LB 액체배지를 500 μl를 첨가하고 37℃ 배양기에서 20분 동안 배양한 뒤 37℃ shaking incubator에서 40분 동안 배양한 후 kanamycin이 첨가되어 있는 LB 고체배지에 도말 하였고, 37℃ 배양기에서 overnight동안 배양하였다. Insert DNA를 확인하기 위해, colony를 주형으로 colony PCR을 진행하였고, band가 있는 colony를 LB 액체배지 3 ml에 colony 한 개를 이쑤시개를 이용하여 넣어준 뒤 37℃ shaking incubator에서 overnight동안 배양하였다.
Nanohelix의 plasmid prep용 kit를 이용하여 plasmid DNA를 추출한 후 특정한 제한효소로 37℃ 항온수조에서 절단하여 insert DNA를 확인하였다.
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Table 1. List of primers for PCR
Target gene Primer Sequence
ZAT1
Forward 5`-AGGATCCATGGAAGAGAGGCATAAGTG–3`
Reverse 5`-CTCTAGATTAAAAAACCGACGAGGCCAT–3`
ZAT1promoter
Forward 5`-CTCTAGACACTTGGCGTCTTCTGCAGA-3`
Reverse 5`-AGGATCCTTCCTCAATTTACCAAAACAGAG-3`
ZAT1coding
Forward 5`-AGGATCCATGGAAGAGAGGCATAAGTG-3`
Reverse 5`-CTCTAGAAAAAACCGACGAGGCCATCTC-3`
GFP5ER
Forward 5`-GGATCCATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTT-3`
Reverse 5`-CTCTAGATTAGAGTTCGTCGTGTTTGTAT-3`
smRSGFP
Forward 5`-ACTAGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3`
Reverse 5`-CTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3`
ZAT9
Forward 5`-GGATCCATGGAGAGTTACAAGTGCAG-3`
Reverse 5`-ACTAGTTCATTGAAACACCACAGAGAC-3`
ZAT9promoter
Forward 5`-GTCTAGAGCCTAGAGTTGTTGTCGCTC-3`
Reverse 5`-GGATCCAGTAAAGAGAAGTGGAATCTACA-3`
ZAT9coding
Forward 5`-GGATCCGAGAGTTACAAGTGCAGGGTT-3`
Reverse 5`-ACTAGTTCATTGAAACACCACAGAGACTTC-3`
ZAT4
Forward 5`-GGATCCATGGAGAGATACAAGTGTAGAT-3`
Reverse 5`-ACTAGTCCATTCATCAAACACCAAAGAA-3`
ZAT4promoter
Forward 5`-CTGCAGAATGTGAGATTATATAGTAGTTTGA-3`
Reverse 5`-GGATCCTTTTCAACACGACAAAAATTACAG-3`
ZAT4coding
Forward 5`-GGATCCATGGAGAGATACAAGTGTAGAT-3`
Reverse 5`-CTCTAGACCATTCATCAAACACCAAAGAA-3`
SynLB3 5`-TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC-3`
LBb1.3 5-`ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3`
Wis_LT6 5`-AATAGCCTTTACTTGAGTTGGCGTAAAAG-3`
GABI_kat_o8409 5`-ATATTGACCATCATACTCATTGC-3`
GABI_kat_o8474 5`-ATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTT-3`
pBIBLB372 5`-GCAGCTGGCACGACAGGTTTC-3`
pBIBLB262 5`-GCTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3`
pBIBLB172 5`-GTCGACAGATCTCATGCCTGCA-3`
DEG1 5`-WGCNAGTNAGWANAAG-3`
DEG2 5`-AWGCANGNCWGANATA-3`
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Figure 5. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT1 gene under the control of 5x UAS promoter and ZAT1 promoter.
A, A diagram showing the construct for the expression of the ZAT1 gene under the control of 5x UAS promoter. B, A diagram for the recombinant DNA construct to express of ZAT1-GFP translational fusion (B) and GFP5-ER (C) under the regulation of ZAT1 promoter.
A
B
A
C
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Figure 6. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT9 gene under the control of 5x UAS promoter and ZAT9 promoter.
A, A diagram showing the construct for the expression of the ZAT9 gene under the control of 5x UAS promoter. B, A diagram for the recombinant DNA construct to express of ZAT9-GFP translational fusion (B) and GFP5-ER (C) under the regulation of ZAT9 promoter.
A
B
A
C
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Figure 7. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT4 gene under the control of 5x UAS promoter and ZAT4 promoter.
A, A diagram showing the construct for the expression of the ZAT4 gene under the control of 5x UAS promoter. B, A diagram for the recombinant DNA construct to express of ZAT4-GFP translational fusion (B) and GFP5-ER (C) under the regulation of ZAT4 promoter.
A
B
A
C
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