20% HCl은 D.W 37.5 ml와 농축된 HCl (10.18 M, dens=1.16 kg/l) 62.5 ml를 혼합하여 100ml로 만든 후 식물의 조직을 20% HCl으로 염색하고 관찰하였다.
12. T-DNA가 삽입된 돌연변이체 선별
ZAT1의 돌연변이를 선별하기 위해서 SALK_009776 (zat1-1)를 사용하였다.
SynLB3와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 돌연변이 band를 얻었고, LP primer와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 야생형
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밴드를 얻었다. 2가지 결과를 비교하여 homozygous 돌연변이 종자를 선별하였다.
ZAT9의 돌연변이의 선별은 Wisceq_DsLox477-480D18 (zat9-1)를 사용하였다.
WisLT_6과 RP primer로 PCR을 진행하여 돌연변이 band를 얻었고, LP primer와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 야생형 밴드를 얻었다. 2가지 결과를 비교하여 homozygous 돌연변이 종자를 선별하였다. ZAT4의 돌연변이를 선별하기 위해서는 GABIseq_181A01 (zat4-1)를 사용하였고, LBb1.3, RP primer 로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 전기영동을 진행하여 돌연변이 band를 얻었고, LP primer와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 야생형 밴드를 얻었다. 2가지 결과를 비교하여 homozygous 돌연변이 종자를 선별하였다.
13. Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
QIAGEN사의 식물용 RNeasy kit를 사용하여 제조사의 설명서에 따라서 야생 형 및 돌연변이 유식물에서 RNA를 추출한 다음, RNA를 Eppendorf사의 biophotometer를 사용하여 정량하였다. 정량한 1 ug의 RNA를 취한 다음, Invitrogen사의 DNaseI을 처리해서 게놈 DNA를 분해하였다. 이 반응은 상온에서 15분간 진행되었으며 EDTA 용액을 첨가한 후 65℃의 heating 블록에 10분간 옮 겨주어 반응을 종결시켰다. cDNA의 합성은 Agilent사의 AccuscriptTM cDNA합성 kit를 사용해서 제조사의 설명서를 따라 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 1st strand cDNA를 제조하였고 이를 주형으로 사용하여, 유전자 특이적인 primer 조합을 사 용해서 94℃에서 3분간, 72℃ 5분간 30회 PCR 반응을 수행하였다.
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III. 결과
1. 활성표지도입으로 유도된 돌연변이체들의 표현형 관찰
애기장대의 뿌리 발달을 조절하는 새로운 유전자들을 선별하기 위하여 뿌리 말단의 전역에서 GAL4-VP16 전사인자를 높은 수준으로 발현하는 Q2610 배경에 5x UAS 활성표지(Waki et al., 2013)를 도입하였다. 약 3000여개의 형질전환된 T1
식물체들을 hygromycin B 항생제 배지에서 선별하여 표현형을 관찰한 결과 야생형과 다른 표현형을 가진 다수의 형질전환 식물들을 선별할 수 있었다(Song, 2016). 이러한 식물들 중에서 짧고 뒤틀린 뿌리를 형성하며 뿌리 표피세포의 패턴이 손상된 돌연변이를 선별하였으며, 이를 defective root development2-dominant (drd2-D)로 명명하였다. 야생형 식물과 비교하였을 때, drd2-D homozygous 식물의 경우, hemizygous 식물에 비하여 더욱 뿌리가 짧고 극심하게 튀틀린 형태로 생장하였다(Figure 8A). 뿌리 표피세포의 패턴 형성의 표지 유전자로써 non-hair cell 위치에 특이적으로 발현되는 GL2p:GUS와 CPCp:GUS 리포터 유전자를 drd2-D hemizygous 배경에 도입하여 뿌리 표피세포의 발달 양상을 조사하였다. 야생형 배경에서는 두 종류의 리포터 유전자들은 발현 세포열과 비발현 세포열에서 규칙적으로 발현되었으나 drd2-D 배경에서는 규칙적인 발현 패턴이 사라지고 상대적으로 무작위적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Figure 8B). 이러한 결과는 drd2-D 원인 유전자의 과대발현이 정상적인 뿌리 패턴 형성을 저해하는 것을 의미한다.
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Figure 8. Root phenotype of drd2-D mutants.
A, drd2-D hemizygous and homozygous seedlings showing twisted root and random hair patterning phenotype together with WT at 4 day after germination. B, Compromised root hair patterning of drd2-D seedlings visualized by marker gene expression of GL2p:GUS and CPCp:GUS together with WT controls. Scale bar (upper panels) = 0.5 mm, scale bar (lower panels)
= 0.05 mm.
A
B
WT
drd2-D hemizygous
drd2-D
homozygous
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2. TAIL-PCR을 이용하여 삽입된 위치 확인
drd2-D의 T-DNA 삽입 위치를 찾기 위해 게놈 DNA를 추출해서 LB primer (LB172, LB262, LB372)와 degenerated primer (DEG1)을 활용하여 TAIL-PCR을 진행하였다. LB372부터 LB172까지 3번에 걸쳐서 차례로 PCR을 진 행한 결과, PCR을 진행함에 따라 PCR 산물의 크기가 2차 반응에 비하여 감소하는 3차 반응 생산물이 합성되었으며, 그 크기는 약 600 bp로 확인되었다(Figure 9). 3 차 PCR 결과로 생성된 DNA 밴드를 gel purification을 통해서 순수 분리하였고, pGEM-T-easy vector에 클로닝한 다음 sequencing을 시행하였다. 그 결과 pBIB-UAS 벡터에서 유래한 5개의 UAS 활성표지가 존재하는 것을 확인하였고, T-DNA는 애기장대의 At1g02030 (ZAT1) 유전자의 잠정적인 개시 코돈에서 133bp 상류 지역에 위치한 프로모터 영역에 삽입된 것을 확인하였다(Figure 10A).
RT-PCR 분석을 통해서 drd2-D에서는 Q2610과 비교하여 ZAT1의 전사 수준이 증가된 것을 확인하였다(Figure 10B). 이러한 결과들을 통해서 drd2-D의 표현형 이 ZAT1의 과대발현에서 유래하였을 것이라고 추정할 수 있었다.
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Figure 9. Gel electrophoresis results of three consecutive TAIL-PCR by using drd2-D genomic DNA as template.
The PCR product at the third reaction was shorter than that at 2nd reaction. The DNA was visualized with ethidium bromide. DNA was amplified by TAIL PCR by using border-specific primers (LB372, LB262, LB172) together with random primers DEG1. M is 1 kb (+) DNA ladder marker.
1 2 3
M M
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Figure 10. T-DNA insertion site inducing drd2-D phenotype is localized in the promoter region of At1g02030.
A, The T-DNA insertion site inducing drd2-D phenotype was determined by the sequencing analysis of the TAIL-PCR product. The underlined sequences are the 5x UAS enhancers. The underlined T letter in boldface indicates the Arabidopsis flancking sequence where T-DNA is inserted. B, 4-day-old seedlings were used for the extraction of total RNA. For the amplification of ZAT1 and EF1 transcripts, 25 cycles of PCR was performed.
A
B
ZAT1
EF1
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3. 5x UAS promoter를 이용한 과대발현 표현형 관찰
ZAT1 유전자의 과대발현이 진정으로 drd2-D 표현형을 유도하는가를 재확인 하기 위해서 ZAT1 유전자를 5x UAS 프로모터에 의해서 조절되는 발현벡터에 클 로닝한 후, 애기장대에 도입하였다. 형질전환된 UASp:ZAT1 애기장대 식물들을 Q2610 enhancer trap line과 교배하여 F1 세대에서 표현형을 관찰하였다. 발아 후 4일이 경과한 Q2610>>ZAT1 식물들의 경우 야생형에 비하여 확연하게 뿌리의 생 장이 억제된 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 drd2-D의 표현형이 ZAT1 유 전자의 과대발현에 의해서 유도되었음을 암시한다. 한편 다른 조직에 특이적으로 발 현되는 enhancer trap 라인들과의 교배를 통해서 ZAT1에 의한 조직 특이적인 생 장억제를 유도하였다. J1721>>ZAT1`의 경우, 발아 초기 때부터 극심하게 생장이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 J1721이 옥신에 반응하는 전사인자를 암호 화하는 MONOPTEROS (MP) 유전자 인접지역에 위치하여 MP와 유사하게 발현되 는 것을 고려할 때(Gagne et al., 2010) 배발생과정에서부터 ZAT1이 높은 수준으 로 발현되어서 발달과 생장이 크게 저해된 결과라고 설명할 수 있다.
J2301>>ZAT1, Q0990>>ZAT1, Q2500>>ZAT1의 유식물의 경우 야생형과 비교하 였을 때, 각각 뿌리가 뒤틀리고 뿌리털의 패턴이 망가진 표현형을 볼 수 있었다 (Figure 11). 이러한 결과들을 종합해 보면 강약에 차이가 있지만 ZAT1이 여러 종 류의 enhancer trap line에 의해서 과대발현되었을 경우에, 야생형에 비해 뿌리의 생장과 발달이 크게 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, J0571>>ZAT1 경우는 유식물에서 뿌리 패턴에 이상이 발생하였지만 상대적으로 뿌리의 생장이 지속되었 다. 지상부에서는 잎의 확장이 억제되었고, silique 주름지고 매우 짧게 발달하였다.
phloroglucinol 염색으로 리그닌 축적을 조사한 결과 J0571>>ZAT1 식물체의 지 상부에서 야생형과 비교하여 강하게 리그닌이 축적되는 것을 관찰할 수 있었다 (Figure 12).
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Figure 11. The ectopic expression of the ZAT1 gene under various enhancers suppresses the growth of transgenic seedlings.
The ectopic expression of zinc finger protein gene by Q2610 enhancer recapitulated drd2-D phenotypes. F1 seedling of UASp:ZAT1 crossed to J0571, J1721, J2301, Q0990, and Q2500.
Seedlings were observed at 4 day-after germination. Scale bars = 0.5 mm
WT Q2610>>ZAT1 J0571>>ZAT1 J1721>>ZAT1 J2301>>ZAT1 Q0990>>ZAT1 Q2500>>ZAT1
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Figure 12. Misexpression of ZAT1 suppresses the growth of above-ground organs.
Transgenic plants misexpressing J0571>>ZAT1 exhibit reduced leaf expansion (A), development of short siliques (B), and increased lignin accumulation (C), as visualized by phloroglucinol staining. Scale bar (left panel) = 1 cm, scale bars = 0.5 mm.
WT
J 0 5 7 1 > > ZA T1 WT
A
C
B J0571>>ZAT1
line #2 line #3
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4. Reporter 유전자를 이용한 ZAT1 유전자 발현양상
ZAT1 유전자의 발현 위치를 조사하기 위해 β-glucuronidase (GUS)를 암호 화하는 GUS 유전자의 발현이 ZAT1의 프로모터에 의해서 조절되는 ZAT1p:GUS 를 제조하여 애기장대에 도입하였다. ZAT1p:GUS는 근단의 외각 세포층, 관다발 세 포층, 성숙과정의 내피세포층, 수공에서 발현되었다(Figure 13A). ZAT1p:GUS의 발현이 ZAT1 또는 근관의 형성에 중요한 역할을 담당하는 SMB에 의해서 조절되 는지를 알아보기 위하여 교배를 통해서 각각 drd2-D (Q2610>>ZAT1)와 drd4-D (Q2610>>SMB) 배경에 도입하여 발현양상을 관찰하였다. 특히, drd4-D의 경우 근관세포의 층이 야생형에 비하여 증가하는 표형형을 나타낸다. ZAT1p:GUS는 두 활성표지 도입 돌연변이 배경하에서도 주로 근관의 최외각 세포층에서만 한정적으 로 발현되었으며(Figure 13B), 이러한 결과는 ZAT1의 발현이 ZAT1이나 SMB의 과대발현에 의해서 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다. ZAT1 유전자의 발현양상 을 RT-PCR을 통해서 조사한 결과 다양한 조직과 기관에서 발아 후 5일째 유식물 의 뿌리에서부터 어린 화서의 조직에 이르기까지 발현되고 있음을 확인할 수 있었 다(Figure 13C).
ZAT1 프로모터의 발현위치를 보다 명확하게 파악하기 위해서, green fluorescent protein (GFP)를 암호화하는 GFP 유전자의 발현이 ZAT1의 프로모터 에 의해서 조절되는 전사융합(transcriptional fusion) construct인 ZAT1p:GFP5-ER과 번역융합(translational fusion) construct인 ZAT1p:ZAT1-GFP를 제조하여 애기장대에 도입하였다. 공초점 현미경을 통해서 유식물의 근단을 관찰한 결과, 근 관의 최외각 층에서 특이적으로 GFP5-ER이 발현되었으며, 측면근관에 비교하여 중축근관에서 상대적으로 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. ZAT1-GFP에서 도 근관 최외각 세포층의 핵에서 관찰되었으며, 내피의 성숙과정에서도 발현되는 것 을 확인하였다(Figure 14A). 근관 세포층의 증가가 ZAT1의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, 근관의 세포층이 증가하는 표현형을 가진 smb-3 돌연변이에서
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ZAT1p:GFP5-ER과 ZAT1p:ZAT1-GFP의 발현양상을 관찰하였다. 그 결과, smb-3에서 근관의 세포층이 증가하였음에도 불구하고 GFP는 근관의 최외각 세포 에서만 특이적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 14B). 이러한 결과는 ZAT1 프로모터의 활성이 SMB에 대해서 비의존적이라는 것을 의미한다.
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Figure 13. Tissue-specific expression pattern of ZAT1 in WT and ZAT1/SMB overexpression background visualized by ZAT1p:GUS and expression patterns of ZAT1 transcripts in various tissues.
A, ZAT1p:GUS reporter gene expression was found in the mature root caps, vascularture, endodermis and hydathodes. B, Border cell-specific expression of ZAT1p:GUS expression in drd2-D (Q2610>>ZAT1) and drd4-D (Q2610>>SMB) where the number of root cap layer was increased. 4 day-old seedlings were used to observe the ZAT1p:GUS expression in roots while 2 week-old plants were for the ZAT1 expression in above-ground tissues. Scale bars = 0.05 mm. C, RT-PCR was performed with the cDNA synthesized by using total RNA isolated from various tissues of Col-0 plants such as roots of 5, 7, 9, 11 day-old-seedlings, leaves of 2 and 3-week-old plants and young inflorescence (YI). EF1 was used as a control for 25 cycles of reaction.
A B
drd2-D (Q2610>>ZAT1)
drd4-D (Q2610>>SMB)
WT
ZA T1 p: GUS
ZAT1 EF1
Root Leaf YI
C
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Figure 14. Expression pattern of ZAT1 visualized by ZAT1pro:GFP5-ER and ZAT1pro:ZAT1-GFP in WT and smb-3 background.
A, ZAT1-GFP translational fusion was localized in the nucleus. B, In the sombrero-3 mutant background where the layers of columella root caps are increased, ZAT1 reporter gene expression is still restricted in the outermost cell layer. Arrow heads indicate the quiescent center (QC).
Parentheses indicate layers of columella cells from initials to borders. Arrows indicate endodermis.
Scale bars = 20 μm
2
En
A
B
ZA T1 p: GFP 5 -ER ZA T1 p: ZA T1 -GFP
WT smb-3 WT smb-3
ZA T1 p: GFP 5 -ER ZA T1 p: ZA T1 -GFP
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5. ZAT1 과대발현 배경하에 다양한 유전자들의 발현양상 조사
ZAT1 유전자가 과대발현된 형질전환식물에서 뿌리의 생장이 저해되는 원인을 이해하고자 뿌리의 생장에 중요한 역할을 수행하는 표지 유전자들의 발현을 조사하였다. WOX5 는 뿌리의 정지중심부에서 발현되며 증축근관세포의 분화를 억제하는 것으로 알려져 있어서(Sarkar et al., 2007), 야생형 유식물의 뿌리에서 WOX5p:GUS 는 정지중심부에 특이적으로 강하게 발현되는 것을 관찰하였다.
반면에 Q2610>>ZAT1 의 배경에서 WOX5p:GUS 는 두 층의 세포에 분산되어 약하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과, ZAT1 의 과대발현이 정지중심부의 형성에 결함을 주고 WOX5 의 발현을 저해한다는 것을 의미한다.
한편 CYCB1;1 유전자는 세포분열주기에서 G2 / M 시기에 강하게 발현되는 특성을 가지고 있어서(Doerner et al., 1996), 야생형 뿌리에서 CYCB1;1p:GUS (Colon-Carmona et al., 1999)는 강하게 발현되는 것을 관찰하였다. 반면에, 뿌리의 생장이 상대적으로 약하게 저해된 Q0990>>ZAT1 배경에서 CYCB1;1p:GUS 는 매우 약하게 발현되는 것을 관찰하였다. 이 결과는 ZAT1 의 발현에 의해서 세포분열이 억제된다는 것을 의미한다. 또한, ZAT1 의 과대발현이 ZAT1p:GUS 의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해서 ZAT1 의 과대발현 배경들에서 ZAT1p:GUS 를 관찰하였다. 관찰한 결과 근관에서의 발현양상은 야생형 Q2610>>ZAT1 및 J2301>>ZAT1 배경에서 큰 차이를 나타내지 않았지만, 피층에서의 발현은 J2301>>ZAT1 배경에서 크게 증가하는 것을 관찰하였다. 이러한 ZAT1 의 발현 조절양상은 직접적인 것인지 아니면 ZAT1 의 과대발현이 식물의 발달 과정에 영향을 미쳐 초래된 간접적인 것인지 명확하게 구별하기는 어렵다(Figure 15).
CEL5 는 근관의 최외각 층에서 특이적으로 발현되며 근관의 탈리에 관여하는 것으로 알려져 있다(del Campillo et al., 2004). Q2610>>ZAT1 과대발현 배경에서 CEL5p:GUS 의 발현은 야생형 배경과 유사하게 근관의 최외각 세포층에서만 관찰되었다(Figure 16A). 또한, SMB 는 야생형 근관세포 전체에서
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발현되는데(Kamiya et al., 2016) Q2610>>ZAT1 배경에서도 SMBp:GUS 의 발현은 근관세포 전체에서 대등하게 발현되었다(Figure 16B). 이러한 결과는 CEL5 와 SMB 는 ZAT1 의 과대발현에 영향을 받지 않고 독립적으로 발현됨을 의미한다.
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Figure 15. Expression pattern of various reporter genes in the background of WT and ZAT1 overexpression lines.
A, WOX5p:GUS expression pattern in WT-like seedlings and Q2610>>ZAT1 (first column), B, CYCB1;1pro:GUS expression pattern in WT-like seedlings and Q0990>>ZAT1 (second column), C, ZAT1p:GUS expression pattern in WT-like seedlings and Q2610>>ZAT1 (third column), D, E, ZAT1p:GUS expression pattern in WT-like seedlings and J2301>>ZAT1 (fourth fifth columns) seedlings at 4day after germination. Scale bars = 0.05 mm.
WOX5p:GUS CYCB1;1p:GUS WT UA S p :Z A T1
ZAT1p:GUS
Q2610 Q0990 Q2610 J2301 J2301
A B C D E
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Figure 16. Expression patterns of CEL5p:GUS and SMBp:GUS in root cap.
4-day-old seedlings were used to observe the CEL5p:GUS and SMBp:GUS expression pattern in WT-like sibling and Q2610>>ZAT1 lines. Scale bars = 0.05mm.
Q2610>>ZAT1 Line #1
Q2610>>ZAT1 Line #2
Q2610>>ZAT1
Line #3 WT-like sibiling
Q2610>>ZAT1 Line #1
Q2610>>ZAT1
Line #2 WT-like sibiling
A
B
S M Bp :GU S
CE L5 p:GUS
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6. Genotyping을 통한 zat1 돌연변이체 확보
근관의 최외각 층에서 특이적으로 발현되는 ZAT1의 기능상실 표현형을 알아보기 위하여 ABRC에서 SAIL_142_F08 종자를 분양 받았다. ZAT1의 암호화 지역에는 1개의 exon이 존재하고 있으며 이 라인에는 exon의 중반부에 T-DNA가 삽입이 되어 있다(Figure 17). T-DNA가 암호화 지역에 삽입된 돌연변이를 확보하기 위해 SAIL line의 특이적인 left border primer인 SynLB3를 사용하여 PCR을 진행하였다. 그 결과, 동형접합 돌연변이를 얻을 수 있었으며 이 식물을 zat1-1이라고 명명하였다. 동형접합 돌연변이의 유식물을 1/2 MS배지에서 수직으로 배양하여 표현형을 관찰한 결과 야생형의 표현형과 비교하여 명확한 차이점을 발견하지 못하였다. 따라서, ZAT1의 기능이 ZAT1 유사유전자와 중첩될 가능성이 높다고 판단하였고 애기장대 유전자의 데이터베이스에서 유사한 유전자를 탐색하였다.
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Figure 17. Identification of T-DNA insertion lines for ZAT1.
A, this figure showing the location of T-DNA insertions in mutant line (SAIL_142_F08) for the ZAT1. also, the positions of primers used for homozygous screening (LP, RP, SynLB3) are shown.
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7. ZAT1 및 유사 단백질의 multiple sequence alignment.
ZAT1 유전자는 C2H2 유형의 zinc finger 단백질을 암호화하고 있으며 기존의 연구를 통해서 ZAT1이라고 명명된 바 있다(Kagale and Rozwadowski, 2011; Ohta et al., 2001). 이 유형에 속하는 단백질들은 EAR motif (Knee et al., 2000)를 가지고 있어서 전사를 억제시킴으로써 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 애기장대에서 ZAT1과 유사한 기능을 가진 유전자를 BLAST 프로그램으로 활용하여 선별하였고 가장 유사한 유전자로는 AT3G60580 (ZAT9)와 AT2G45120 (ZAT4)인 것으로 나타났다. ZAT1, ZAT9, ZAT4 유전자들이 암호화하는 아미노산 서열간의 유사성을 조사하기 위하여 아미노산들을 clustal omega 프로그램을 활용하여 유사한 부분을 비교하였다(Figure 18). 분석한 결과 ZAT1, ZAT9과 ZAT4는 모두 C2H2 zinc finger protein으로 EAR motif를 가지고 있었다. ZAT1의 경우 130~134번째 아미노산서열인 LSLML과 250~255번째 아미노산 서열에서 DLNLPA, 두 곳에서 EAR motif들이 존재하였다. 반면, ZAT9와 ZAT4에서는 각각 271~276번째 아미노산 서열과 295~300번째 아미노산 서열에서 DLNLPA라는 특이적으로 보존된 EAR motif가 존재하였다.
ZAT1, ZAT9과 ZAT4사이에서 PAUP 프로그램을 활용한 분지도를 구성한 결과 다른 유전자에 비하여 높은 수준의 유사도를 보였다(Figure 19). ZAT1과 유사 단백질들 사이의 아미노산 서열의 유사도를 조사한 결과, ZAT1과 ZAT9는 전체 267개 아미노산 중 117개의 아미노산이 일치하여 43.8% 일치도를 나타냈으며, ZAT1과 ZAT4는 전체 267개의 아미노산 중에서 116개의 아미노산이 일치하여 43.4%의 일치도를 보였다. 한편, ZAT9과 ZAT4의 경우 전체 288개의 아미노산 중에서 174개의 아미노산이 일치하여 60.4%의 일치도를 보였다.