ORAC Assay

ORAC assay는 항산화력 측정 방법중의 하나로 reaction 과정을 buffer와 sample, FL (fluorescein disodium) solution을 mix 한 후 radical generator인 AAPH (2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride)를 첨가함으로써 반응이 시작된다¹³⁴. 실험원 리는 APPH에 의하여 FL decay 반응이 억제됨을 이용하여 측정한다. 샘플과 buffer 는 15분 동안 pre-incubation하며 혼합된 반응액을 37℃로 평형시켜 형광분광광도계 를 사용하여 형광의 감소 과정을 60분 동안 2분 간격으로 형광이 95% 감소될 때까 지 진행하였고 측정은 excitation 590 nm에서 실시하였다. Radical 소거 활성은 trolox 를 표준물질로 사용하여 trolox standard curve로부터 산출하였으며, aronia extracts을

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각 농도별로 희석하여 75 mM phosphate buffer에 녹여 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 ELISA (Biochrome EZ400, Korea)로 측정하여 ORAC value 를 측정하였다.

46 Table 6. Type of reactive oxygen species

Free radicals Non radicals

Hydroxyl radical OH• Hydrogen peroxide H2O2

Superoxide radical O2•• Singlet oxygen O2

Nitric oxide radical NO• Hypochlorous acid HOCl

Lipid peroxyl radical LOO• Ozone O3

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2.4.6. SOD assay

Hydrogen peroxide, superoxide, hydroxyl radical 같은 ROS는 모든 호기성 생물들의 산 소 대사산물이다. ROS가 생성되는 것은 mitochondria 전자 전달계의 에너지 생성 과 정의 결과로써, virus 또는 bacteria 같은 미생물에 대항하기 위한 방편이라고 할 수 있다. 또한 cytochrome p450 system과 관련된 대사 과정 등에서 발생되며, UV, ioniaing radiation, redox chemicals 등의 환경적인 요인에 의해서도 발생된다. 활성산 소의 공격을 차단, 또는 감소시키는 인체 내 자동 방어 기전을 항산화 기전이라 하 며, 이러한 항산화 방어 기전을 수행하기 위한 특수한 기능을 가진 물질은 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase 등의 항산화 효소와 vit E, β-carotene, uric acid, glutathione, thioredoxin 등의 저분자량의 항산화 물질로 구분된다.

대부분의 활성 산소들은 이와 같은 항산화 물질들의 작용에 의해 중화되지만 이런 방어 시스템을 능가할 만큼의 지나친 스트레스는 lipids, proteins, DNA와 같은 생체 분자들에 손상을 입히게 된다. SOD는 인체 내에서 생성되는 가장 강력한 항산화 작용을 가진 효소로서 방어 효과가 가장 높은 것으로 알려져 있다. SOD radical scavenging activity 측정은 19160 SOD determination kit (sigma, USA)을 사용하였으며, assay 방법은 xanthine-xanthine oxidase system을 nitroblue tetrazolium (NBT)로 발색시킨 SOD Kit를 이용하여 측정하는데, SOD Kit의 원리는 xanthine에 xanthine-oxidase가 작 용하면 O2

-가 생성되고 생성된 O2

-는 공존하는 NBT를 환원시켜 발색반응을 나타내 지만 생성된 O2

-는 제거능을 가진 물질로 인하여 발색이 저해되는 원리이다. 반응 조건은 완충액 19 mL에 기질 1 mL (WST solution)을 섞은 다음 희석용 완충액 25 mL에 효소 용액 15 μL 섞어 37℃의 incubator에서 15분 반응시킨 후 560 nm에서 ELISA reader (UVM-340)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, 항산화 활성 측정은 다음의 식과 같이 계산하였다.

Antioxidant activity (%) =𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑜𝑓 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑜𝑓 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑜𝑓 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 × 100

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2.4.7. Catalase assay

Catalase는 호기성 세포의 과산화소체(peroxisome)에 존재하며, H2O2를 분해하여 O2

와 H2O를 만들어 낸다. Catalase는 세포에서 발견되는 가장 효율적인 효소로써 catalase 한 분자는 초당 수백만 분자의 H2O2를 중화 시킨다. Catalase는 매우 견고하 고 안정된 구조를 취하고 있기 때문에 다른 효소에 비해 온도에 의한 변성이나 산 도에 대한 저항성, 단백질 분해에 대한 저항력이 있다. 본 실험에서는 catalase의 활 성을 측정하기 위해 catalase activity colorimetric fluorometric assay kit (Bio vision, USA) 을 사용하였으며, 실험 방법은 96 well plate 각각에 assay buffer 100 μL, methanol 30 μL, 1000배로 희석한 각각의 실험 샘플을 20 μL 넣고, 각 well에 hydrogen peroxide 20 μL 를 넣은 후 20분간 shaker에서 반응시켰다. 20분 후 각각의 well에 potassium hydroxide 30 μL, Catalase purpled 30 μL를 넣은 뒤 실온에서 10분간 shaker에서 반응시 켰다. 다시 10분 후에 각각의 well에 Catalase potassium periodate 10 μL를 넣고 실온에 서 5분간 shaker에서 반응시킨 후 microplate reader (Bio-Rad)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.