DPPH radical scavenging and ABTS radical scavenging activity of Quercetin

50

DPPH radical scavenging

Concetration ( g/mL)

0 100 200 300 400 500

Activity(%)

0 20 40 60 80 100

C-3-G Aronia(I) Aronia(D) Gallic acid Quercetin

Fig. 8. DPPH radical scavenging effect of aronia extracts and polyphenols.

51

ABTS radical scavenging

Concetration ( g/mL)

0 100 200 300

Activity(%)

0 20 40 60 80 100

C-3-G Aronia(I) Aronia(D) Gallic acid Quercetin

Fig. 9. ABTS radical scavenging effect of aronia extracts and polyphenols.

52

2.5. 2. SOD activity of Aronia melanocarpa extracts

Superoxide radical (O2

-•) 은 전자 환원에 의한 반응성이 매우 강하여 세포 독성을 일 으켜 각종 질병과 암을 유발하고 피부를 노화시킨다¹³⁵. 인체 내에서는 superoxide radical을 제거하기 위하여 SOD가 분비되어 세포에 유해한 superoxide radical을 과산 화수소(H2O2)와 정상상태의 산소로 전환시켜주는 반응(2O2

- + 2H⁺ → H2O2 + O2)을 하 는 것으로 알려져 있으며, SOD에 의해 생성된 H2O2는 생체 조직을 산화시키기도 하고 peroxidase나 catalase에 의하여 인체에 무해한 물 분자와 산소 분자로 전환된 다¹³⁶. SOD와 유사한 역할을 하는 저분자 물질로 주로 phytochemicals에 속하는 것으 로 보고되어 있다¹³⁷.

C3G, quercetin, gallic acid, aronia extracts 대한 superoxide anion (O2

-•) 소거 활성을 측정 한 결과는 Fig. 11에 나타내었다. Superoxide anion 소거 활성에 대한 C3G IC50값은 28.25 μg/mL으로 확인되었으며, quercetin은 48.84 μg/mL, aronia와 양파껍질 extracts은 각각 125.27 μg/mL, 272.69 μg/mL를 나타내었다. Aronia와 양파껍질 extracts은 천연물 기준으로 매우 높은 항산화 활성을 나타내었다.

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Fig. 10. The reaction principle of SOD.

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Fig. 11. Superoxide dismutase activity of polyphenols.

Concentration (g/ml)

0 100 200 300 400 500 600

Activity (%)

0 20 40 60 80 100

A

Cyanidin-3-galactoside Quercetin

Aronia(I) Onion skin

C-3-g IC₅₀ 28.25µ g/ml

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2.5. 3. Oxygen radical antioxidant capacity (ORAC) activity of Aronia melanocarpa extracts

Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay는 수소 전자의 전달에 의한 환원력을 측정하는 방법으로 식물 내에 친수성 및 소수성 성분과 모두 반응하기 때문에 응 용 범위가 넓으며 항산화 측정에 매우 적합하다¹³⁸. ORAC value는 Ou ¹³⁹ 등 의 실험 방법을 응용하여 평가하였다. 본 실험에서 사용한 시료 및 표준물질의 희석과 시약 의 제조는 75 mM phosphate buffer (pH 7.4)를 이용하였다. 실험 직전 AAPH (150 mM) 는 37℃에서 15분간 정치하여 활성화한 뒤, 96-well plate에 희석된 착즙액 25 μL와 fluorescein (40 nM) 150 μL를 혼합하고 측정 직전에 AAPH (150 mM) 25 μL를 첨가하 였다. 혼합액은 ELISA (UVM-340)를 사용하여 485 nm에서 전자를 여기 후 535 nm에 서 방출되는 조건으로 37℃에서 90분간 3분마다 fluorescence의 감소율을 측정하였 다. 결과값은 착즙액 첨가와 blank의 area undercurve (Net AUC) 값을 나타낸 후 trolox를 이용하여 작성한 검량선에 대입하여 나타내었다. ORAC assay를 통하여 항 산화를 측정한 결과 C3G, quercetin, aronia extract 모두 14±0.25 μM TE/mL으로 높은 ORAC 수치를 나타내었으며, positive control으로 사용한 Trolox의 ORAC 지수는 14±

0.14 μM TE/mL이었다. Aronia extracts가 천연물인 것을 감안했을 때 positive control과 비슷한 수준의 항산화 활성을 나타낸다는 것은 매우 높은 항산화 활성을 갖고 있 음을 의미한다.

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Time (min)

0 5 10 15 20 25 30

RLU /RLU

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

100 M 50 M 25 M 12. 5 M 6.25 M 0 M

Fig. 12. Relative luminescence intensity as increased in trolox concentration for 30 min.

57

Trolox (M)

0 20 40 60 80 100

Ne t AU C

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Fig. 13. Net luminescence intensity as increased in trolox concentration at 30 min.

58

Concentration (M)

0 20 40 60 80 100

N e t A U C

0 2 4 6 8 10 12 14

Trolox Maquiberry C3G

Aronia Quercetin

Fig. 14. Net luminescence intensity as increases in polyphenols concentration at 30 min.

59

2.5.4. Catalase activity of Aronia melanocapa extracts

Catalase는 인체 내에서 생성된 H2O2를 H2O로 분해하는 효소이다. SOD에 의해서 환 원된 H2O2뿐만 아니라 peroxisome의 효소, mitochondria의 전자전달계, xanthine oxidase에 의해 생성된 H2O2를 분해 함으로써 인체를 보호하는 역할을 한다. 본 실 험에서는 Catalase assay kit (CAT 100)을 사용하여 항산화 활성을 측정하였다. 실험 결과 aronia extracts (F)의 IC50 값은 25.52 μg/mL, aronia extracts (D)는 45.48 μg/mL으로 측정되었다. 선행연구에서 aronia 열매 및 잎의 extracts 또는 분획의 항산화 활성을 확인하였는데 aronia 열매와 잎 extracts의 경우 50% 에탄올 extracts의 활성산소 소 거 활성은 각각 25.00 μg/mL 및 37.27 μg/mL, 에틸아세테이트 분획은 각각 2.86 μg/mL 및 8.38 μg/mL, 아글리콘 분획은 각각 1.80 μg/mL 및 3.38 μg/mL을 나타내었 으며, aronia 열매의 아글리콘 분획은 비교 물질로 사용된 L-ascorbic acid (OSC50 = 1.50 μg/mL)와 유사한 항산화 활성을 보고하였다¹⁰². 또 다른 선행 연구에서는 aronia anthocyanin 분획에서 높은 항산화 활성을 보고하였으며, 기타 베리류(acai berry, blue berry, cranberry, black currant)보다 2배 이상의 높은 항산화 활성을 보고하였다¹⁴⁰. 이 와 같은 결과로 보았을 때 aronia extracts를 적절한 방법과 농도로 사용한다면 피부 에 안전하고 노화를 방지하는 천연 항산화제의 응용이 가능할 것으로 판단된다.

60

A

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

H

O

conc . (  mole )

0 20 40 60 80

Coefficients:

b[0]-1.8005100283 b[1]59.9869010639 r ² 0.9948724116

Fig. 15. Calibration curve of absorbance intensity at 520 nm wavelength vs. Hydrogen peroxide (H2O2) concentration.

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Catalase activity

Concentration (g/mL)

0 20 40 60 80 100 120

Activity(%)

0 20 40 60 80 100 120

Aronia(I) Aronia(D) Anthocyanin

Fig. 16. Catalase activities (%) of polyphenols according its concentration.

62

2.5.5. Statistical analysis

실험 결과는 3번 반복 실험 후 SPSS version 22를 이용하여 통계처리 하였으며, 실 험에 의해 얻어진 값들의 평균 ±표준편차로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 t-Test를 사용하였으며, p<0.05 수준에서 검정하였다.