건 옥수수의 β-glucosidase 활성 - 결 과 - β -glucosidase 처리에 의한 된장의 Genistein 함량변화 및 물리적 성질의 변화 석사학위 논문

III. 결 과

3) 건 옥수수의 β-glucosidase 활성

실제로 β-glucosidase 활성을 된장에 적용시켜 isoflavone을 전환 시키려고 할 때 대량 생산을 목적으로 실험을 생각해 본다면 매번 된 장을 제조할 때 마다 생 옥수수를 구해 처리해주는 것 자체가 보관 비용이나, 재료 수급 등의 문제점이 많기 때문에 건 옥수수를 이용하 는 계기가 되었다. 건조되어 냉장 저장된 옥수수를 배양시키며 씨눈 을 발아시켰다(Fig. 6). 씨눈과 debris를 분리시키지 않은 것을 사용 하여 β-glucosidase 활성을 측정한 결과 4일째 가장 높은 3.03unit/g 이 나왔다(Fig. 7). 생 옥수수와 건 옥수수의 씨눈이 발아하여 β-glucosidase 의 활성이 증가하는 시간이 차이가 났으며 이 차이는 건 옥수수 내부의 수분을 공급해주는 시간이 씨눈의 성장(Fig. 8)에 영향 을 미쳤기 때문이며, β-glucosidase 의 활성은 옥수수의 줄기세포가 배아로부터 성장하면서 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6, 7).

1일 2일 3일 4일 5일 7일

Fig. 6. 옥수수 발아 사진

1 1.3 1.6 1.9 2.2 2.5 2.8 3.1 3.4

0 1 2 3 4 5 6 7

Day

Unit/g

Fig 7. 건 옥수수의 β-glucosidase 활성

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

1day 2day 3day 4day 5day 6day 7day

Day

Weight ,g

debris 씨눈

Fig. 8. 옥수수 발아 시간별 배아(씨눈)의 무게

2. β-glucosidase 처리 후 된장 genistin의 genistein으로의 전환

Genistein peak 는 명확히 관찰되지 않았으나 genistein standard peak 와 비교하여 (Fig. 9A) retention time 이 26.5 분인 작은 peak

β-glucoside 결합이 β-glucosidase 에 의해 분해된 것을 의미하고, ret-ention time 5 분 51 초의 새로 생긴 peak 는 glucose standard 와 일치하여 β-glucoside 결합이 끊어지면서 생기 는 glucose 라는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 9B, D).

정량분석결과 genistein 19mg/kg, genistein 379mg/kg 으로 94.9%의 genistin 이 genistein 으로 전환된 것을 확인할 수 있었다(Table 3).

Fig. 9. HPLC peak 비교

2) 시판용 된장에서의 genistein 및 genistin 정성,정량 및 효소 전환

시판 된장의 HPLC peak 는 전통된장과 비슷한 형태로 genistin 의 peak 가 7 분대에 검출되었으며 genistien 은 극소량으로 peak 로 검출되지 않은 것을 볼 수 있었다(Fig. 9E). 시판 된장은 된장 1kg 중 genistin 296mg 을 함유하고 있었으며 5.8mg 의 genistein 이 들어 있는 것으로 나타났다(Table 3).

옥수수 β-glucosidase 를 처리한 후 시판된장의 peak 를 살펴보면 genistin peak 가 소멸되고 5 분대의 glucose peak 와 25 분대의 ge-nistein peak 가 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 실제로 peak 가 g-enistin 과 genistein 의 peak 인지 확인하기 위해서 효소 전환시킨 된장시료에 genistin, genistein 표준시료를 첨가하여 얻은 peak 를 살펴보았을 때 genistin 과 genistein 의 peak 가 성장하였다(Fig. 9G).

β-glucosidase 를 처리해준 peak 를 살펴본 결과 효소 전환된 된장에 genistin 이 92mg/kg 과 genistein 은 209.8mg/kg 이 함유되어 있었다.

따라서, genistin 의 69%가 genistein 으로 전환된 것을 확인할 수 있 었다(Fig. 9F, Table 3).

Genistin

3. 옥수수 β-glucosidase처리 후 된장의 물성 변화

된장에 주로 포함되어 있는 isoflavone인 genistin은 옥수수 β-gl-ucosidase의 기질로서 작용하기 때문에 genistein으로 전환시킬 수 있다. 그러나 genistin외에 β-glucosidase의 활성이 다른 화학물질에 관여를 하여 된장의 품질에 영향을 미칠 가능성이 있으므로 물성 실 험을 수행 하였으며 기본적으로 β-glucosidase 처리에 따른 pH 변화, 점도 변화를 측정하였다. 또한, TBA 항산화가, 색도변화를 측정하여 된장 내 기능성 물질들의 분해 및 전환이 일어나는지를 알아보았다.

(1) pH 변화

일반적인 된장의 pH는 4.9~5.3정도로 산성을 나타내고 있다. pH를 결 정하는 주된 인자는 곰팡이이다.

Aspergillus

속,

Penicillium

속,

Mucor

속,

Rhizopus

속들이 된장의 발효에 관여하고 특히 호염성인

Pedioc- occus halophilus

는 증식할 때 젖산을 생성하여 된장을 pH 5.0 정도 로 떨어뜨리며, pH 5.0부근이 되면 증식을 중지하게 된다. 15unit 옥 수수 β-glucosidase를 된장 5g에 처리하여 실제로 pH의 변화가 있 는지 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180분 동안 배양시켜 실험하였다(Fig.

10). β-glucosidase처리 후에도 pH는 4.9로 변화가 거의 없었다.

3 3.5 4 4.5 5 5.5 6

0 50 100 150 200

Time(min)

Fig. 10. β-glucosidase 처리 후의 pH 변화

(2) 점도 변화

생성된 melanoidin상의 물질로서 이러한 물질들이 β-glucosidase의 처리에 의한 반응에 안정하다는 것을 알 수 있었다.

(4) 색도 변화

장류의 갈변은 영양성분인 단백질로부터 유래한 아미노산과 탄수화 물로부터 유래한 당류가 서로 반응하여 형성하는 갈색의 멜라노이딘 (melanoidin, 갈색색소)으로 인하여 발생한다. 멜라노이딘은 인체 내 내당성을 개선하고 트립신 저해작용 등으로 당뇨병의 예방이나 개선 에 이바지 할 것으로 기대되며 위암발생, 니트로소 아민의 생성 감소 및 유산균 증식효과, 과잉 섭취된 철 성분과 체내결합방지, 유리기 발 생에 의한 세포막 확산 방지 등의 효과를 가지고 있어 여러 가지 기 능성을 나타내고 있다. 이와 같은 기능성 물질에 있어서 β-glucosi- dase가 된장 색소와 반응하여 분해산물을 나타내는지 아니면 안정한 지를 알아보기 위해 된장의 색도를 1일부터 6일간 측정한 결과 β-g-lucosidase를 처리하지 않은 대조구는 Hunter value가 L: 30.44, a:

7.1, b: 11.39였으며 β-glucosidase처리 후의 Hunter value는 L:34.2, a:6.84, b:12.39로 측정되어 된장의 색도 변화에는 그렇게 영향을 미 치지 못함을 알 수 있었다(Fig. 13).

0 1 2 3 4 5 6

0 50 100 150 200

시간(min)

cp(x10^6) cp(처리전)

cp(enzyme 처리 후)

Fig. 11. β-glucosidase 처리 후 된장의 점도 변화

100 200 300 400 500 600 700

0 50 100 150 200 250 300 350

시간(min)

TBA value

Fig. 12. β-glucosidase 처리 전, 후 된장의 TBA value 변화

Fig. 13. β-glucosidase처리 전, 후 된장의 색도 변화(Hunter value) 0

5 10 15 20 25 30 35 40

- + - + - +

L a b

chromaticity

0day 1day 2day 4day 6day

IV. Discussion

1. 된장에서의 genistein 전환

1) Genistein으로 전환 시킴으로써 얻는 이점

배당체인 genistin이 비배당체인 genistein으로 전환 되었을 때 체내 이용률이 증가하는 등 여러 가지 이점이 따른다. 특히 항암 활 성 및 항산화 효과를 비교하였을 때도 체내에서 genistein의 형태가 다른 isoflavone류와 비교하여 가장 활성이 높아 기능성이 더욱 좋은 것으로 알려졌다. 또한, genistein이 보강된 식품을 개발한다면 섭취 해야 할 식품의 양이 줄어들어 요즘 들어 서구화되고 간편화된 우리 식생활 문화를 개선 할 수 있을 것이다. 또한 전통 식품의 소비 증대 및 여러 질병에 효과를 나타낼 수 있어 앞으로의 응용 범위가 넓다.

2) 95% 전환시킨 된장의 genistein함량

전통된장 및 시판된장에 포함되어 있는 genistein의 양은 각각 5.8, 10mg/kg 으로 소량으로 존재하였다. 이는 1Kg의 된장 중에 genistein 6.0mg이 함유 되었다는 보고(Choi et al. 1999)와 유사한 결과이다.

이렇게 소량 존재하고 있는 genistein을 효소전환 시켜 69%~95%의 genistin이 전환되는 것을 확인하였다. 따라서 genistein 보강 된장의 경우 209.8mg/kg~379mg/kg의 genistein이 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 일반적으로 genistein의 효능을 보기위해서 20~30mg/

day를 섭취해야 하기 때문에 95% 전환률을 기준으로 genistein 보강 된장 약 50g 을 섭취해야 한다.

효소 전환된 된장의 섭취해야 할 양이 상당히 줄어든 것을 볼 수 있 었으며 실제로 된장과 함께 두부 및 콩 기반 식품과 같이 섭취를 한 다면 하루에 섭취 가능한 양이며 기존 된장보다 기능성이 배로 증가 될 것이라고 생각된다.

3) Genistin의 섭취 전 전환의 필요성

Genistin과 같은 배당체의 isoflavone은 신체에 흡수되기 전 위와 장에서 미생물에 의해 비배당체로 분해 될 수 있다는 사실이 알려졌 다(Kim et al., 1999). 하지만 genistein이 장내 미생물에 의해 genis- tein으로 전환될 경우 기본 isoflavone구조의 작용기(R1)에 methyl기 와 같은 기존 isoflavone과 다른 작용기가 붙게 될 확률이 높기 때문 에 genistein이 장내 효소에 의해 가수분해가 되더라도 genistein으로 만 전환되는 것이 아니다.

따라서 isoflavone 배당체 섭취 전에 genistin에 기질 특이성을 갖는 β-glucosidase를 처리하여 전환시키는 것이 중요하다고 할 수 있겠 다.

2. Genistein이 보강된 기능성 된장의 생산

기존의 된장 제조공정은 우선 소맥분, 대두, 밀쌀을 스팀을 이용하여 증자시킨 후 제국실로 이동시켜 증자된 소맥분에 종국(황국균)을 접종하여 약 42 시간 동안 증식시켜 단백질 및 탄수화물을 분해하는 효소를 생산한다. 제국된 소맥분과 증자된 밀쌀, 대두에 식염, 정수를 일정비율로 혼합하여 숙성탱크로 이송하고 숙성탱크에서 일정한 발효기간을 거쳐 잘 숙성된 반제품을 메주 및 기타 첨가물을 첨가하 여 열처리한 다음 냉각시켜 마쇄기로 갈은 후 완제품 서비스 탱크로 이송한다. 이 과정에서 β-glucosidase 를 처리하여 된장중의 genistein 함량을 높이려면 우선 원료를 배합하여 숙성 후 바로 β-glucosidase 를 처리해야 한다. 25^oC 에서 약 3 시간 교반시켜 genistin 을 효소전환 시킨 후 식염, 정수를 혼합한다면 genistein 보강 된장을 생산할 수 있을 것이라고 본다(Fig. 14).

원료증자 과정 소맥분 제국과정

옥수수 β-glucosidase 첨가

incubation (25^oC)

원료혼합(소맥분,밀,쌀,식염,정수) 원료배합

포장제품 완성

Fig.14. Genistein보강 된장 제조 공정

V. 결 론

옥수수 β-glucosidase 를 이용하여 된장 중의 genistin 을 체내 흡 수율 및 건강 기능성이 높은 genistein 으로 69% 전환된 genistein 이 보강된 된장을 개발하는데 성공하였다.

이번 실험을 바탕으로 효소 처리량이나 배양시간 등을 조절 한다면 된장의 genistin 전환율을 더 높일 수 있을 것이라고 예상되어지며 g-enistein 이 보강된 기능성 된장의 제조에 적용될 수 있을 것이다.

VI. References

1. Anderson, K., (1998). Sex and long-term soy diets affect the metabolism and excretion of soy isoflavones in humans. Am. J.

Clin. Nutr. 68: 1500~1504.

2. Bae, E. A., Kwon, T. W. (1997). Isoflavone contents and antio-xidative effects of soybeans, soybean curd and their byproducts.

J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 26: 371~375.

3. Carrao, P. M., Kitamura, K. (1995). Isoflavone content in Braz- ilian soybean cultivars. Breeding Sci. 45: 295~300.

4. Choi, C., Choi, K. S. (1996). Characteristics and action pattern of protease from

Bacillus subtillis

CCKS-111 in Korean traditional soy source. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 25: 915~921.

5. Choi, S. Y., Cheigh, M. J. (1999). Growth suppression effect of traditional fermented soybean paste(

Doenjang

) on the various t-umer cells. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 28: 458~463.

6. Choi, U. K., Ji, W. D. (1998). Characteristics of Chunggugjang produced by

Bacillus subtillis

DC-2. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr.

27: 846~851.

7. Decker, C. H., Visser, J. (2001). β-glucosidase multiplicity fr-om

Aspergillus tubingensis

CBS 643.92: Purification and charac-terization of four β-glucosidases and their differentiation with r-espect to substrate specificity, glucose inhibition and acid

toler-ence. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 157~163.

8. Djuric, Z., Chen, G., Doerge, D. R., Heilbrun, L. K., Kucuk, O., (2001). Effect of soy isoflavone supplementation on markers of oxidative stress in men and women. Cancer Lett. 172: 1~6.

9. Freer, S. N. (1985). Purification and characterization of the e-xtracellular β-glucosidase produced by

Candida wickerhamii

. Arch. Biochem. Biophy. 243: 515~522.

10. Freer, S. N. (1993). Kinetic characterization of a β-glucosidase from a yeast,

Candida wickerhamii

. J. Biol. Chem. 268:

9337~9342.

11. Hakkak, R., Korourian, S., Shelnutt, S. R., Lensing, S., Ronis, M.

J., Badger, T. M., (2000). Diets containing whey proteins or soy protein isolate protect against 7, 12-dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary tumors in female rats. Cancer Epidemiol. Bio- markers Prev. 9: 113~117.

12. Hernandez, L. F., Espinosa, J. C. (2002). β-glucosidase activity in a

Saccharomyces cerevisiae

wine strain. Int. J. Food Mic- robiol. 10: 2471.

13. Hsieh, M. C., Graham, T. L. (2001). Partial purification and c-haracterization of a soy bean β-glucosidase with high specific activity towards isoflavone conjugates. Phytochemistry 58: 995

~1005.

14. Hessler, P. E., Constantinou, A. I. (1997). Isolation of isoflav-ones from soybased fermentations of the erythromycin produci- ng bacterium

Saccharopolyspora erythraea

. Appl. Microbiol. Bio-technol. 47: 398~404.

15. Jeong, J. H., Kim, J. S. (1998). Studies on the contents of free aminoacids, organic acids and isoflavones in commercial soybean paste. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 27: 10~15.

16. Kim, J. S. Yoon S. (1999). Isoflavone contents and β-glucosidase activity of soybean, Meju, and

Doenjang.

Korean J. Food Nutr. 31: 1405~1409.

17. Kim, S. H., Lee, Y. J. (1999). Isolation of angiotensin conver- ting enzyme inhibition from

Doenjang

. Korean J. Food Nutr. 31:

848~854.

18. Kim, S. H., Yang, J. L. (1999). Physiological functions of Chon- gkukjang. Food Ind. Nutr. 4: 40~46.

19. Kil, J. O., Kim, G. N. (1998). Production and characterization of fibrinolytic enzyme: Optimal condition for production of the e-nzyme from

Bacillus

sp. KP-6408 isolated from Chungkookjang.

19. Kil, J. O., Kim, G. N. (1998). Production and characterization of fibrinolytic enzyme: Optimal condition for production of the e-nzyme from

Bacillus

sp. KP-6408 isolated from Chungkookjang.

문서에서 β -glucosidase 처리에 의한 된장의 Genistein 함량변화 및 물리적 성질의 변화 석사학위 논문 (페이지 36-0)