III. 결 과
3) 항산화가 변화
일반된장은 항 산화 효과를 어느 정도 가지고 있으므로 효소 처리된 된장의 항산화가(TBA value)를 측정하여 옥수수 β-glucosidase를 처 리한 후에 된장의 항산화가에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다.
된장 3g을 삼각 플라스크에 취하고 benzene 10ml를 혼합하여 용해 시킨 후 TBA혼합액 10ml을 가하고 4분간 반응시켰다. 이 액을 분액 깔때기에 옮겨 정치 시켜 2개 층으로 분리 시켰다. 층 분리를 시켰을 때 된장의 수용성 혼탁액이 완전히 제거되지 않아 6,700 x g에서 5분 동안 원심분리 하여 아래 층을 순수하게 분리하였고 100oC로 가열된 물에서 30분간 가열하고 다시 상온으로 냉각시켜 530nm에서 흡광도
를 측정하여 TBA value를 계산하였다(Zuccarello et al. 2002).
4) 색도
된장에 1 gram당 β-glucosidase 3unit를 처리하여 1일, 2일, 4일, 6일 간 25OC에서 반응시키면서 색도를 측정하였다. 색도를 측정하기 위해 Minolta CL300 색도계를 이용하였고 β-glucosidase를 처리하지 않 은 control과 비교하여 Hunter value(L, a, b) 값을 결정하였다.
III. 결과
2. β-glucosidase 활성 측정
1) 콩과 식물의 β-glucosidase 활성
된장의 genistin 의 genistein 으로의 전환에 식물체의 β-glucosida-se 를 이용하기 위하여 β-glucosidase 활성을 가지고 있는 것으로 알 려진 여러 콩과 식물의 β-glucosidase 활성을 비교해 보았다(Fig. 4).
건 옥수수에서의 β-glucosidase 활성이 5.02 unit/g로 비교적 높게 측정 되었지만 생땅콩 1.31 unit/g, 흑서리 0.97 unit/g, 백태 3.94 unit/g, 강낭콩 0.12 unit/g으로 효소활성이 낮게 나타났다. 흰 찰옥수 수와 검정 찰옥수수에서 분리한 씨눈에서의 효소활성이 6.24 unit/g, 5.56unit/g으로 매우 높았다. 그래서 옥수수 β-glucosidase를 된장에 서 genistin을 genistein으로 전환시키기 위해서 선택하였다.
Fig. 4. 건 옥수수(건조), 생땅콩, 흑서리, 백태, 강낭콩, 옥수수의 씨눈(수분포함)의 β-glucosidase activity(단위: unit/1g)
0
2) 생 옥수수의 β-glucosidase 활성
1 gram당 β-glucosidase의 활성이 높은 생 옥수수를 발아시키면서 β-glucosidase 활성을 측정한 결과는 Fig.5 와 같다.
씨눈과 debris를 직접 분리하여 실험한 결과 씨눈의 β-glucosida- se 활성이 높음을 알 수 있었다. 미리 침지시켜놓은 생 옥수수의 경 우 상온(약 25oC)에서 2일째 음지에서 배양시켜 발아하기 시작한 후 가 가장 활성이 높았으며 3일, 4일째 β-glucosidase 활성이 조금씩 감소하는 경향을 나타냈다.
Fig 5. 생 옥수수의 β-glucosidase 활성 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
1day 2day 3day 4day
day
activity(unit/g)
3) 건 옥수수의 β-glucosidase 활성
실제로 β-glucosidase 활성을 된장에 적용시켜 isoflavone을 전환 시키려고 할 때 대량 생산을 목적으로 실험을 생각해 본다면 매번 된 장을 제조할 때 마다 생 옥수수를 구해 처리해주는 것 자체가 보관 비용이나, 재료 수급 등의 문제점이 많기 때문에 건 옥수수를 이용하 는 계기가 되었다. 건조되어 냉장 저장된 옥수수를 배양시키며 씨눈 을 발아시켰다(Fig. 6). 씨눈과 debris를 분리시키지 않은 것을 사용 하여 β-glucosidase 활성을 측정한 결과 4일째 가장 높은 3.03unit/g 이 나왔다(Fig. 7). 생 옥수수와 건 옥수수의 씨눈이 발아하여 β-glucosidase 의 활성이 증가하는 시간이 차이가 났으며 이 차이는 건 옥수수 내부의 수분을 공급해주는 시간이 씨눈의 성장(Fig. 8)에 영향 을 미쳤기 때문이며, β-glucosidase 의 활성은 옥수수의 줄기세포가 배아로부터 성장하면서 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6, 7).
1일 2일 3일 4일 5일 7일
Fig. 6. 옥수수 발아 사진
1 1.3 1.6 1.9 2.2 2.5 2.8 3.1 3.4
0 1 2 3 4 5 6 7
Day
Unit/g
Fig 7. 건 옥수수의 β-glucosidase 활성
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
1day 2day 3day 4day 5day 6day 7day
Day
Weight ,g
debris 씨눈
Fig. 8. 옥수수 발아 시간별 배아(씨눈)의 무게
2. β-glucosidase 처리 후 된장 genistin의 genistein으로의 전환
Genistein peak 는 명확히 관찰되지 않았으나 genistein standard peak 와 비교하여 (Fig. 9A) retention time 이 26.5 분인 작은 peak
β-glucoside 결합이 β-glucosidase 에 의해 분해된 것을 의미하고, ret-ention time 5 분 51 초의 새로 생긴 peak 는 glucose standard 와 일치하여 β-glucoside 결합이 끊어지면서 생기 는 glucose 라는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 9B, D).
정량분석결과 genistein 19mg/kg, genistein 379mg/kg 으로 94.9%의 genistin 이 genistein 으로 전환된 것을 확인할 수 있었다(Table 3).
Fig. 9. HPLC peak 비교
2) 시판용 된장에서의 genistein 및 genistin 정성,정량 및 효소 전환
시판 된장의 HPLC peak 는 전통된장과 비슷한 형태로 genistin 의 peak 가 7 분대에 검출되었으며 genistien 은 극소량으로 peak 로 검출되지 않은 것을 볼 수 있었다(Fig. 9E). 시판 된장은 된장 1kg 중 genistin 296mg 을 함유하고 있었으며 5.8mg 의 genistein 이 들어 있는 것으로 나타났다(Table 3).
옥수수 β-glucosidase 를 처리한 후 시판된장의 peak 를 살펴보면 genistin peak 가 소멸되고 5 분대의 glucose peak 와 25 분대의 ge-nistein peak 가 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 실제로 peak 가 g-enistin 과 genistein 의 peak 인지 확인하기 위해서 효소 전환시킨 된장시료에 genistin, genistein 표준시료를 첨가하여 얻은 peak 를 살펴보았을 때 genistin 과 genistein 의 peak 가 성장하였다(Fig. 9G).
β-glucosidase 를 처리해준 peak 를 살펴본 결과 효소 전환된 된장에 genistin 이 92mg/kg 과 genistein 은 209.8mg/kg 이 함유되어 있었다.
따라서, genistin 의 69%가 genistein 으로 전환된 것을 확인할 수 있 었다(Fig. 9F, Table 3).
Genistin
3. 옥수수 β-glucosidase처리 후 된장의 물성 변화
된장에 주로 포함되어 있는 isoflavone인 genistin은 옥수수 β-gl-ucosidase의 기질로서 작용하기 때문에 genistein으로 전환시킬 수 있다. 그러나 genistin외에 β-glucosidase의 활성이 다른 화학물질에 관여를 하여 된장의 품질에 영향을 미칠 가능성이 있으므로 물성 실 험을 수행 하였으며 기본적으로 β-glucosidase 처리에 따른 pH 변화, 점도 변화를 측정하였다. 또한, TBA 항산화가, 색도변화를 측정하여 된장 내 기능성 물질들의 분해 및 전환이 일어나는지를 알아보았다.
(1) pH 변화
일반적인 된장의 pH는 4.9~5.3정도로 산성을 나타내고 있다. pH를 결 정하는 주된 인자는 곰팡이이다.
Aspergillus
속,Penicillium
속,Mucor
속,Rhizopus
속들이 된장의 발효에 관여하고 특히 호염성인Pedioc- occus halophilus
는 증식할 때 젖산을 생성하여 된장을 pH 5.0 정도 로 떨어뜨리며, pH 5.0부근이 되면 증식을 중지하게 된다. 15unit 옥 수수 β-glucosidase를 된장 5g에 처리하여 실제로 pH의 변화가 있 는지 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180분 동안 배양시켜 실험하였다(Fig.10). β-glucosidase처리 후에도 pH는 4.9로 변화가 거의 없었다.
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
0 50 100 150 200
Time(min)
pH
Fig. 10. β-glucosidase 처리 후의 pH 변화
(2) 점도 변화
생성된 melanoidin상의 물질로서 이러한 물질들이 β-glucosidase의 처리에 의한 반응에 안정하다는 것을 알 수 있었다.