간암 세포주 (SNU739, SNU475, Hep3B, Huh7)를 1.5 × 105으로 60mm배양 접시에 배양한 후 siRNA를 이용하여 유전자를 24시간 동안 발현 억제시킨 후에, trypsin으로 세포를 떼어 60mm 배양 접시에 2 × 103로 배양하였다. 1주일정도 지나 colony가 형성이 되면 이를 10% formaldehyde로 1시간동안 고정시킨 다음, 메탄올에 녹인 0.5% crystal violet으로 염색하였다.
Ⅲ.결과
Fig. 1 Up-regulation of NPFFR2 expression in cancer cell lines Gene expression of NPFFR2 were determined by quantitative RT-PCR in various HCC cell lines, normal cells and other cancer cell lines.
A. 여러 가지 암 세포주에서 높은 발현을 보이는 NPFFR2
quantitative RT-PCR 분석을 통하여 mRNA 수준에서의 정상 세포와 간암 세 포주 간의 NPFFR2의 발현 패턴을 비교하였다(Fig. 1 A). 정상 폐세포인 IMR90, WI38, 정상 표피 세포인 BJ, 정상 장 세포인 CCD18co와 같은 정상 세포보다는 Hep3B, SNU739, SNU709와 같은 간암 세포주에서의 발현이 높게 나타났다. 특 히, Hep3B와 SNU739, SNU709에서 NPFFR2의 발현이 모두 정상 세포주보다 높 은 것을 확인하였다. NPFF의 또다른 수용체인 NPFFR1의 mRNA 수준에서의 발현확인을 시도하였으나 PCR이 확인되지 않아 암세포주에서는 발현이 되지 않 는 것으로 판단하였다. 또한 페암 세포인 H460, 골육종세포 U2OS, 폐암세포 Calu1과 같은 다른 암세포주에서도 NPFFR2의 발현 역시 높았다(Fig. 2 B).
Fig. 2. Activation of ERK signaling by NPFF SNU739 and SNU475 cells were pre-incubated at low serum condition for 4hours, then NPFF peptide was treated with indicated concentration and the cells were harvested after 30min and 1hr. Immunoblotting were performed using the cell lysate with antibodies detecting p-ERK, p-AKT and β-actin.
B. 간암 세포에서 NPFF 처리에 의한 ERK의 활성 증가
여러 가지 간암 세포주에서 NPFFR2의 발현이 증가되어 있기 때문에 이 GPCR에 간암 세포주의 생존이나 암화기전에 역할이 있을 것으로 판단하였다.
해당 GPCR이 기존의 신경세포에서 ERK 신호전달을 촉진하는 것이 보고된 바 있고(Ankö와 Panula, 2006), 암세포에서 ERK는 중요한 신호전달 기전이기 때문 에 NPFFR2의 리간드인 RFamide 펩티드를 제작하였고, 간암 세포주 SNU739와 NPFF를 0.1uM, 0.3uM, 1uM, 3uM의 5가지 농도를 30분과 1시간을 처리하였다.
또한 SNU475 에는 1uM, 3uM ,10uM로 30분과 처리하였다. 암세포 주요 생존 기전인 ERK 및 AKT 활성도를 western blotting 을 통해 확인하였다. 그 결과 두 가지 세포주에서 펩티드 처리에 의한 ERK의 인산화가 증가하였다.
Fig. 3 Increase of invasion rate by addition of NPFF SNU449, SNU475, SNU398 cells were applied on the upper compartment of a Chamber with serum-free medium, and the lower compartment was filled with 2% FBS added 3uM NPFF. After 38hr later, the invaded cells were fixed and stained by crystal violet (A). Invaded cell were counted at 3 different region(B).
C. NPFF 처리에 의한 간암 세포주의 세포 침윤도 증가
ERK 및 AKT는 암세포의 침윤 및 생존 등에 중요한 신호전달 기전으로 알려 져 있다. 따라서 NPFF에 의해 증가한 ERK 신호전달이 간암 세포주에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 먼저 NPFF에 의한 간암 세포주 침윤도를 조사하 였다. NPFFR2의 발현이 낮은 세 가지 간암 세포주 SNU475, SNU449, SNU398 을 transwell에 배양하고 well 밖의 배지에는 2% FBS가 포함되어 있는 RPMI에 3uM의 NPFF를 처리 한 후, 38hr 후 침윤된 세포를 염색하여 현미경으로 관찰 하였고, 세 가지의 간암 세포주 모두에서 침윤도가 증가하는 것을 확인하였다.
Fig. 4 Increase of cancer cell migration by addition of NPFF (A)95%
confluent SNU475 cells were scratch wounded, and then incubated for 20h.
Image of wounded cells were taken at times 0h and 20h after treatment of NPFF (3uM) at 2% serum condition. (B)Migration was measured by calculation of % of enclosed distance compared to 0hr. NPFF was treated at different serum concentration (2% and 10%). (C)SNU475 cell was exposed to NPFF(3uM) for an transwell containing polycarbonate membrane. The lower chamber was filled with 750μl of 2% FBS-containing medium and was incubated 38hr. The cells that migrated to the lower chamber were fixed and counted using microscope.
D. NPFF 처리에 의한 간암 세포주의 세포 이동 증가
Wound healing assay을 수행하여 NPFF에 의한 세포의 전이성을 확인하였다.
6well에 SNU475 간암 세포주를 6 × 105/well씩 배양한 후, 세포가 100% 자라면, 성장 배지를 제거하고, 200ul 팁으로 일정한 굵기가 되도록 긁어주었다. 그 후 PBS로 두 세 번 닦아준 후 2% FBS가 포함되어 있는 배지로 갈아주고, 3uM의 펩티드를 처리하여 0시간과 20시간에 현미경으로 세포의 이동을 관찰하였다. 펩 티드를 처리한 실험군의 세포 이동이 더 크며 (Fig4. A), 특히, 혈청의 농도가 높 을 때보다 낮은 농도일 때 NPFF에 처리에 의한 세포의 이동의 차이가 상대적으 로 더 커지는 것으로 나타났다 (Fig4. B). 또한 transwell을 이용한 SNU475의 세 포 이동 역시 NPFF 펩티드를 처리한 실험군이 더 증가하였다 (Fig4. C).
Fig. 5. Decrease of cell invasion by depletion of NPFFR2 (A) SNU475 is transfected with 40nM of NPFFR2 siRNA or control siRNA, 24 post transfection, cells were applied on the upper compartment of a Chamber with serum-free medium, and the lower compartment was filled 2% FBS. After 38hr later, the invaded cells by were fixed and stained with crystal violet. (B) Invaded cell were counted at 3 different region.. (C) Immunoblotting were performed using the cell lysate with antibodies detecting NPFFR2 and β -actin.
E. NPFFR2의 발현 저해에 의한 세포 침윤도 감소
NPFFR2 발현 억제에 의한 간암세포주의 침윤도 변화를 확인하였다. SNU739, SNU709, SNU475 세 가지 간암 세포주에 NPFFR2를 siRNA를 이용하여 knockdown 시키고, transwell 밖은 2% FBS가 포함되어 있는 배지에 3uM에 NPFF를 처리한 결과 실험군의 침윤도가 대조군보다 감소하였다. 이것은 수용체 의 발현 억제로 인하여 펩티드에 의한 수용체의 민감도가 감소하여 침윤도가 감 소한 것으로 판단된다. 또한 SNU475 세포주에서 siRNA를 이용하여 NPFFR2의 단백질 수준에서의 발현이 저해된 것을 western blot을 이용하여 확인하였다.
Fig. 6 NPFF-induced invasion requires NPFFR2 (A) SNU7475 cells were knockdown using siNPFFR2 or control siRNA. 24hr post transfection, cell were applied on the upper compartment of a Chamber with serum-free medium, and the lower compartment was filled 2% FBS with NPFF. After 38hr later, the invaded cells were fixed and stained with crystal violet (B) Invaded cell were counted at 3 different region. (C) Immunoblotting were performed using the cell lysate with antibodies detecting p-PKCα/β II, phospho-p38/MAPK, MMP9, MMP2, p-ERK, p-AKT and β-actin.
F. siNPFFR2에 의한 NPFF 민감도 감소에 따른 간암 세포 침윤도 감소 NPFF에 의한 간암 세포주의 침윤도가 NPFFR2 수용체의 활성화와 연관되어 있을 것으로 예상된다. 이를 검증하기 위하여 NPFF에 의한 침윤도가 NPFFR2의 발현억제에 의해 영향을 받는지를 확인하였다. SNU475에 NPFFR2 siRNA를 이 용하여 발현을 억제시킨 후, NPFF 펩티드를 처리한 결과 SNU475의 침윤도가 대조군에 비하여 증가하였고, NPFFR2의 발현억제에 의하여 NPFF에 의한 SNU475의 침윤도가 영향을 받아 감소하는 것을 확인하였다. 또한 관련 신호 전 달인자인 p-PKCα/β II와 ERK 및 MMP2 활성이 감소하였으며, MMP9과 phospho-p38/MAPK에는 변화가 없었다.
Fig. 7 Increase of invasion rate by NPFFR2 overexpression SNU475, Huh7 cells were transfected with 2μg of NPFFR2 plasmid or control vector After 24hr later, cells were trypsinized and applied on the upper compartment of a Chamber with serum-free medium, and the lower compartment was filled with cultured media. After 38hr later, the invaded cells by were fixed and stained with crystal violet.
G. NPFFR2의 과발현에 의한 암세포 침윤 증가
NPFF에 의해 활성화된 수용체에 의해 암세포의 침윤이 증가했으므로 NPFFR2 과발현 또한 증가할 것으로 생각하였다. 먼저, NPFFR2의 발현이 낮은 세포주인 SNU475와 Huh7에 NPFFR2 plasmid를 각각 2μg씩 transfection 하고 48시간 후에 harvest하여, 수용체의 과발현 또한 암세포의 침윤 능력을 증가시킨 것을 확인하였다.
Fig. 8 Inhibition of clonal survival by NPFFR2 depletion SNU739, Hep3B, SNU7475, Huh7 cells were transfected with 40nM of NPFFR2 siRNA or control siRNA. After 24hr later, cells were trypsinized and plated 2000 cell/dish and the plates were incubated at 37℃. Seven to eleven days later, the cells were fixed and stained with cystal violet in methanol.
H. siNPFFR2에 의한 세포 생존 억제
간암 세포주에서 NPFFR2가 증가하였고 과발현 및 발현억제에 의해 세포의 침윤성에 영향을 주었기 때문에, NPFFR2 발현억제가 간암세포의 생존에 영향을 줄 가능성을 확인하였다. 먼저, NPFFR2의 발현이 낮은 세포주인 SNU475와 Huh7 그리고 발현이 높은 세포주인 SNU739, Hep3B 총 네 가지 세포주에 siRNA를 transfection 하고 NPFFR2의 발현을 Real time PCR을 통해 확인한 결 과 siRNA에 의해 NPFFR2의 발현이 효율적으로 억제되는 것을 알 수 있었다 (Fig.8 A). 해당 간암 세포주에서 NPFFR2의 발현을 억제시킨 후, 세포 생존에 미치는 영향을 clonogenic assay를 통해 확인하였다. 그 결과 NPFFR2 발현 억 제에 의해 세포의 생존이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.8 B).
Ⅳ. 고찰
는 cDNA산물 (intron retained NPFF, GI : 219878493)이 클로닝 및 RT-PCR 과 정 중에 합성되었기 때문으로 이 산물은 펩티드를 합성할 수 없는 기능이 결여된 cDNA임을 밝혔다. 이 산물이 증폭되는 조건에서도 실제 NPFF는 증폭이 불
낮은 상태였을 때 펩티드 처리에 의한 세포의 이동이 더 큰 차이를 보이는 것으 로써 (Johnson 와 Dhanasekaran, 1989; Simon 등1991), 활성화된 PLC는 inositol triphosphate (IP3) 와 diacylglycerol (DAG)를 생성하기 위하여 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)를 hydrolyses 한다. IP3와 DAG는 세포 내부 칼슘의 저장과 방출을 통하여 직간접적인 경로를 통해 Protein kinase C (PKC)를 조절하고, PKC에 의하여 ERK의 활성이 일어나는데 PKC가 암의 진 행에 높은 연관성이 있고 (Jussi 등 2006), PKCα의 발현이 암세포에서 matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)와 matrix metalloproteinase -9 (MMP-9) 등 MMP의 발현을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 보고가 있는 것으로 보아 (Wu 등, 2008) NPFF 펩티드를 처리하였을 때, PKCα/βll의 인산화, MMP2의 증
가가 암세포의 침윤을 증가시켰을 것으로 판단 된다 (Fig.6).
이러한 일련의 실험 결과를 종합해 보면 간암 세포에서 수용체의 발현이 정상 세포에 비해 높아져 이것이 PKC를 활성화시켜 ERK 신호를 통해 간암 세포 의 침윤, 생존과 전이를 촉진할 가능성이 있는 것으로 판단된다.
향후 G protein 관련 돌연변이 벡터, 칼슘 및 ERK 관련 저해제를 이용하여 실 제 해당 신호전달기전이 세포의 침윤성과 관련성이 있는지를 추가적으로 연구할 필요가 있다. 또한 NPFFR2의 발현억제는 암세포 생존과 전이능을 모두 감소시 켰으나 전이능을 확인하는 단계는 생존에 영향을 주지 않는 초기단계에서 실험 을 진행하였고, 암세포 생존실험은 low density colony formation assay를 통해 서 진행하여 10일 정도 세포생존을 확인하였기 때문에 NPFFR2 발현억제에 의 한 전이 능력 억제가 암세포 생존에 영향을 받은 결과가 아닌 것으로 판단하였 다. 따라서 암세포의 생존에 관련한 NPFFR2의 기능을 추가적으로 연구할 필요 가 있다.
Ⅴ. 결론
간암 세포주에서 NPFF 펩티드에 의한 NPFFR2 활성화 및 siRNA를 이용한 NPFF 신호전달 기전 억제에 의해 ERK 및 MMP2 , PKCα/βⅡ의 활성이 영향 을 받는 것을 발견하였고, 이러한 세포 신호 전달의 변화가 암 세포주의 세포 이 동 및 침윤 능력에도 영향을 미치는 것을 발견하였다. 뿐만 아니라 수용체 단독
간암 세포주에서 NPFF 펩티드에 의한 NPFFR2 활성화 및 siRNA를 이용한 NPFF 신호전달 기전 억제에 의해 ERK 및 MMP2 , PKCα/βⅡ의 활성이 영향 을 받는 것을 발견하였고, 이러한 세포 신호 전달의 변화가 암 세포주의 세포 이 동 및 침윤 능력에도 영향을 미치는 것을 발견하였다. 뿐만 아니라 수용체 단독