형간염 바이러스 복제의 실험실 배양 시스템의 발전

대한소화기학회지 2008;52:196-199 □ EDITORIAL □

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C형간염 바이러스 복제의 실험실 배양 시스템의 발전

전북대학교 의과대학 내과학교실 소화기내과

김 대 곤

Advancement in in vitro Culture System of Hepatitis C Virus Replication

Division of Gatroenterology and Hepatology, Department of Internal Medicine, Chonbuk National University Medical School, Jeonju, Korea

전 세계적으로 약 1억 8천 명 정도의 인구가 C형간염 바 이러스(HCV)에 감염되어 있으며 대부분의 환자에서는 만성 보균상태가 되어 다양한 정도의 간염증과 섬유화를 야기한 다. 감염 20-30년 후에는 15-20% 환자가 간경변을 거쳐 간 세포암종으로 이행되므로 장차 HCV에 의한 간질환이야말 로 간이식에 주요 적응증이 될 것으로 추정된다.^1,2 배양에 서 HCV 복제를 확립하기 위해 많은 시스템들이 시도되었 으나 대부분의 이러한 시스템은 HCV 감염에 대해 허용적 (permissive)이며 효율적인 바이러스 생성을 유지하지는 못 하였다. 적절한 HCV 세포 배양 시스템의 부재는 바이러스 와 자연 숙주인 비형질전환 간세포 사이의 관계를 파악하는 데 있어 중대한 장애가 되었다.

HCV 배양에 있어 주요 발전은 안정성 준유전체 복제단 위(replicon) 시스템의 개발이었다.^3,4 이것은 인간 간암세포 주 Huh-7에서 고수준으로 자동 복제가 가능하였다. Lohman 등⁵은 최초로 감염된 인간 간장으로부터 분리된 viral RNA 에서 전장의 공통서열 유전체를 분리하여 HCV-IRES (inter- nal ribosomal entry site)을 이용하여 HCV-IRES-neo gene- EMCV-IRES-HCV 서열(NS2 or NS3 upto NS5B 및 authentic 3' end) 구조를 갖는 bicistronic subgenomic replicon을 간암세 포주 Huh-7에 transfection하여 G418 선택적 배양에 따라 HCV RNA와 단백을 지속적으로 발현하는 세포주를 확립하 였다. 이 시스템은 HCV 복제기전에 대한 연구에 강력한 도

구가 되어 항바이러스 탐색에 큰 도움이 되었으나 분리된 유전자형 1 HCV만이 복제가능 복제단위로 구성되었을 뿐 이었다.

2005년도 전격 간염환자에서 유전형 HCV JFH-1 바이러 스의 분리는 큰 도약의 계기가 되었다. 2003년도 Kato 등⁶은 전격 간염환자로부터 분리된 유전자형 2a인 JFH-1 클론으 로부터 새로운 복제단위시스템을 제조하였다. Huh7 세포주 에 G418 선택성 준유전체 전사구조를 transfection시킴으로 써 유전자형 1a보다 50배 이상의 집락(colony)형성이 관찰되 었다. JFH-1 복제단위 RNA는 복제단위를 갖고 있는 세포주 로부터의 세포 RNA를 transfection 시켜 새로운 Huh7 세포에 propagation이 가능하였으며, 클론된 복제단위 RNA의 염기 서열 분석에 의하면 전염된 세포 pool에서 증폭된 복제단위 RNA는 모두 돌연변이가 없었으며 복제된 RNA의 염기서열 분석에서는 모든 클론은 적어도 서로 다른 돌연변이를 1개 이상 갖고 있었다. 이 돌연변이의 하나는 JFH-1 복제단위의 집락형성효율을 증가시켰으며, JFH1 복제단위는 일과성 복 제 측정법에서 G418 선택 없이 효율적인 복제가 가능하게 하였다, 즉 이 바이러스는 적응변이(adaptive mutation) 없이 Huh-7 세포주에서 잘 복제되었다. 이 JFH-1 복제단위를 이 용하여 마침내 Wakita⁷는 HCV 유전자형 2a의 클론된 JFH-1 유전체를 Huh7 간암세포주에 transfection시켜 효율적으로 복제시키고 바이러스 입자를 분출시키는 데 성공하였다. 즉

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이전의 실험에서는 준유전체 복제단위가 in vitro 배양에서 는 효율적으로 복제되었으나 알 수 없는 이유 때문에 감염 바이러스 입자는 만들어지지 않았다. 이 방출된 바이러스 입자는 Huh7 세포주에 감염력을 갖고 있었으며 CD-81 특이 항체에 의하여 중화되었다. 이 세포배양유래 바이러스 입자 는 침팬지에 감염력을 갖게 되어 바이러스 생활주기와 항바 이러스 전략에 기여하게 되었다. 그 후 기능적으로 복제단 위 complex를 가시화할 수 있는 방법으로 NS5A의 C-말단부 위에 삽입된 녹색형광단백(GFP)은 크게 HCV RNA 복제에 영향을 주지 않으면서 HCV polyprotein 과정에 무관하다는 것을 알게 되었다.⁸ 더욱 중요한 사실은 발현 수준을 강화하 여 형광현미경으로 충분히 퓨전단백을 관찰하게 되었다는 것이었다. NS5-GFP 퓨전단백은 세포질에서 형광을 발하는 dot로 나타나고 공초점 레이저주사현미경에서는 다른 HCV nonstructural protein이나 발생기(nascent) 바이러스 RNA와 같 은 곳에 위치하게 됨을 관찰할 수 있었다. 이 연구는 NS5A 의 C말단부의 flexibility를 보여 주었으며 살아있는 세포에 서 HCV 복제 complex의 형성과 대사회전(turn-over)을 연구 할 수 있는 강력한 도구가 되었다. Huh-7.5 세포를 이용하여 제조한 이 세포주는 Huh-7.5 GFP-HCV replicon cell line I/5A-GFP-6라고 명명되었다. 종래의 Wakita⁷가 연구개발한 in vitro 전사된 JFH-1 genomic RNA에 감염된 Huh7 세포주 에서는 감염성 HCV 입자를 방출하나 감염효율이 낮으며 새로운 Huh-7 세포의 전파율이 낮다는 단점이 있었다.

Zhong 등⁹은 이점을 개선하기 위해 I/5A-GFP-6 replicon cell (Huh-7.5GFP-HCV-replicon cells)을 이용하여 HCV Huh-7.5.1 세포주를 개발하였다. 이 세포주는 HCV 세포배양 감염시스 템을 향상시킨, 즉 세포에서 감염 바이러스를 생성하는 고 자율 시스템을 확립하였다. 지금까지의 연구에서는 주로 in vitro 배양에서 subgenomic replicon을 사용하였으나 세포배 양 적응변이를 갖는 전장의 genome 실험에서는 감염성 바 이러스 입자를 생성하지 못했으며 in vivo에서는 더욱 성적 이 약화돠었다. 따라서 Lindenbach 등¹⁰은 역시 전장에 키메 라형 유전체 J6/JFH를 제조하여 Huh-7.5 세포주에서 감염 입자를 제조하였다. 즉 감염 바이러스 J6 (유전자형 2a)의 core-NS2 유전자 부위를 SGR-JFH1의 앞쪽에 위치함으로써 전염된 세포에서 core, NS2, NS5A 단백을 생성하게 하였다.

이 감염성이 있는 바이러스 입자는 바이러스 glycoprotein E2의 단클론항체에 의해 중화되었으며 바이러스 세포내 진 입은 추정된 세포 수용체 CD81에 의존적임을 관찰하였다.

이 HCVcc 복제는 인터페론 알파나 다른 항 HCV 특이 복합 제에의해 억제됨을 알게 되었는데 이는 in vitro 시스템이 항바이러스탐색에 크게 도움이 될 것으로 보고하였다.

이들 시스템에서 바이러스 생성은 현질전환된 세포에서 드문 전격 간염환자에서 분리된 단일 바이러스의 전염에 의

한 것이었으며, 최근에는 JFH-1 유래 핵산서열을 이용한 intragenomic와 intergenomic HCV 키메라의 제조,¹¹ 감염침팬 지로부터 감염 JFH-1 바이러스의 회수¹² 그리고 5종의 적응 변이를 갖는 유전자형 laH77-5 바이러스를 transfection 시킨 Huh7.5 세포주 개발¹³이 보고되었다. 그럼에도 불구하고 비 키메라형 바이러스나 HCV 바이러스에 감염된 환자의 혈청 에 노출된 후에 비형질전환 간세포에서 다양한 유전형의 HCV에 복제를 유지하는 시스템의 개발이 제일 우선한 과 제였다.¹⁴ Iacovacci 등¹⁵은 HCV 감염환자의 혈청에 노출된 인간의 태아 간세포(HFHs)에서 HCV 복제형(replicative form) 또는 복제중간물(replicative intermediates)의 검출을 보고하 였고 이는 HFHs에 HCV 복제의 허용(permissive)을 보여 주 었다. Fausto 그룹에서는 무혈청 HFH를 확립하였고 이 배양 시스템을 이용하여 유전자형 la HCV transfection이나 HCV 유전자형 1, 2 그리고 3의 환자 혈청에 의한 HCV transfec- tion 후 지속적인 HCV 복제를 유지하고 적어도 2개월간 고 HCV 농도가 배양액으로 방출되었음을 관찰하였다.^16,17 이러 한 바이러스 감염은 트렌스웰 배양시스템에서 새로운 세포 에 전달되었으며 이 감염은 인터페론알파 또는 람다 (IFN- α 또는 IFH-λ)를 세포에 처리함으로써 억제되었다. 이 배 양시스템은 비형질전환 인간 간세포에서 HCV 감염에 대한 반응을 연구하고 혈청 감염력을 분석하며, 감염된 환자로부 터 새로운 HCV 바이러스를 클론하는 데 사용될 수 있다고 보고하였다.

특히 Huh-7 세포를 이용한 JFH1 유전자형 HCV 감염은 IFH-β나 ISG (IFN-stimulated gene) 발현을 유도하지 않아 생체에서와 같은 세포내 신호전달 경로를 연구할 수 없었 다. HCV를 포함하는 다종의 바이러스에서 복제의 중간물인 이중나선 RNA에 의해 IFN-β 발현이 시동(trigger)되는 바 HCV 배양 시스템의 발전은 HCV 감염 후 오는 IFN 신호경 로 분석이 가능하게 하였다. 최근 Kanda 등¹⁸은 HCV core transfection에 의해 불멸화된 간세포 IHH를 이용하여 HCV 유전자형 1a (H77)나 2a (JFH1)을 transfection 시켜 IFN-β 신호경로가 인체 HCV 자연 감염시와 유사함을 확인하게 되었다. 즉 HCV 감염 IHH는 IFN-β와 ISG56 promoter 활성 을 증가시킨다. 그러나 Poly (I-C) 유도성 IFN-β와 ISG56 발 현수준은 HCV 감염에 의해 감소된다고 한다. HCV 감염 IHH에서는 IRF-3의 핵으로의 이동이 관찰되었다. HCV 감 염 IHH에서는 역시 IFN-β과 2'-5'-oligoadenylate synthetase 1 mRNA 발현이 보여지고 있다. 또한 STAT1과 ISG56 단백발 현이 관찰되었다.

이번 소화기학회지에 게재된 최 등¹⁹의 논문 ‘불멸화된 일 차 간세포를 이용한 C형 간염바이러스의 in vitro 배양’은 SV40 large 항원을 transfection시켜 분리 확립된 인간 일차 간세포 (IPHH)에 HCV 환자의 혈청과 조직 균질액에 노출

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하여 HCV를 감염시켰다. 혈청과 조직 균질액 혼합 접종에 노출된 IPHH에서만 nest PCR를 이용하여 바이러스＋strand HCV　RNA가 검출되었다. 저자들은 불멸화된 인간 간세포 주를 확립하고 그 기능과 특성을 분석하였으며 이를 HCV 의 in vitro 배양 모델에 응용하였다. 이는 HCV의 연구나 약 물의 스크리닝시 정확도를 높여주는 데 이용될 수 있으며 약물의 작용 기작을 밝히는 연구, 약물 독성, 약물 간의 상 호작용, 약물간의 구조적인 친화성을 연구하기 위한 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 기대한다.

불멸화 세포 또는 암 유래 세포주에 의해 인간 일차 간세 포가 보다 생리학적인 조건에서 HCV 복제를 검사하기 위 해서는 이상적이나 실험실 배양조건하에서는 인간 일차 간 세포가 증식되지 않는다. 따라서 최근 Aly 등²⁰은 인간 papillomaviruos 18형의 E6 및 E7 유전자나 hTERT 유전자를 발현시켜 일차 간세포로부터 불멸화 세포주(Hus)를 확립하 였다. El-Farrash 등²¹은 이 세포주를 이용하여 만성 HCV-4a 환자의 혈청으로 감염시킨 후 Huh-7.5나 PH5CH8 세포주보 다는 높게 HCV-4a 복제를 유도하여 CsA와 그 비면역억제 유도체 NIM811의 항 HCV 바이러스 효과를 보고하였다. 즉 CsA와 그 비면역억제 유도체 NIM811는 완벽하게 HCV-4a 감염력과 복제를 억제함을 관찰하였다. PH5CH8 세포주는 SV40 large T 항원으로 불멸화시킨 간세포주 PH5CH이며 확 립된 3 세포주들 중 하나의 세포주이다. 이 세포주에서 바 이러스 접종 후 배양온도가 37^oC에서 32^oC로 감소되었을 때 HCV 복제가 유지 되었다. 그 외 Chong 등²²은 일차간세포배 양법의 하나인 구상체(spheroid) 배양법을 이용하여 감염성 혈청을 간세포 구상체 배양에 접종하여 HCV RNA을 검출 하였고 HCV의 NS5A 또는 core 단백발현을 관찰하여 또 다 른 HCV연구의 좋은 방법적 도구임을 보고하였다.

결론으로 보다 효과적인 치료방법의 발달이 절실한 만성 HCV 감염에 있어 바이러스의 생활주기, 숙주 간세포와 HCV 간의 상호작용, 그와 관련된 신호전달경로, 면역학적 기전 등의 파악에 의한 치료표적의 발굴이 중요한 의미를 갖는다 하겠다. 따라서 이러한 목적을 위한 효율적인 in vitro 배양 시스템은 더욱 발전되고 개선되어야 할 것이다.

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