157
재생불량성빈혈에서 혈관내피성장인자의 발현
전북대학교 의과대학 내과학교실1, 병리과2, 진단검사의학과3
이나리
1․송은기
1․윤현정
1․이호경
1․곽재용
1․임창열
1․정명자
2․임 현
3․최삼임
3The Expression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Aplastic Anemia
Na Ri Lee, M.D.1, Eun Kee Song, M.D.1, Hyun Jung Yoon, M.D.1, Ho Kyung Lee, M.D.1, Jae Yong Kwak, M.D.1, Chang Yeol Yim, M.D.1,
Myoung Ja Chung, M.D.2, Hyun Lim, M.D.3, and Sam Im Choi, M.D.3
Department of Internal Medicine1, Pathology2 and Laboratory Medicine3, Chonbuk National University Medical School and
Institute for Medical Sciences, Chonbuk, Korea
Background : Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent angiogenic peptide with biologic effects that include regulation of hematopoietic stem cell development, extracellular matrix remodeling, and inflammatory cytokine generation. VEGF plasma levels are elevated in circulation during tumor growth and bone marrow proliferative status. In this study, to investi- gate the role of VEGF expression in patients with aplastic anemia (AA), VEGF protein ex- pression and microvessel density (MVD) were evaluated.
Methods : Immunohistochemical staining for detecting VEGF protein was performed by the labeled avidin-biotin method on the formalin-fixed and paraffin embedded bone marrow biopsy samples of 25 patients with severe AA and 10 normal controls. Microvessels were scored in at least 3 areas (×200 fields) of the highest MVD in representative sections of each bone marrow biopsy specimen using immunohistochemistry for CD34 antigen.
Results : In AA, megakaryocytes and histiocytes expressed less intense cytoplasmic VEGF than in control (P<0.05). However, plasma cells had higher VEGF immunoreactivity in AA than in control. MVD was significantly lower in patients with AA (21.43±7.24), compared to controls (27.65±3.44) (P<0.05). MVD had a strong correlation with bone marrow cellularity. Also, the degree of VEGF immunoreactivity was correlated with bone marrow cellularity and MVD.
Conclusion : Angiogenesis as assessed by MVD and VEGF expression seems to have a role in the pathogenesis of AA. (Korean J Hematol 2003;38:157～163)
Key Words : Aplastic anemia, VEGF (Vascular endothelial growth factor), MVD (microvessel density)
1)
접수 : 2003년 2월 20일, 수정 : 2003년 6월 15일 승인 : 2003년 7월 25일
책임저자 : 곽재용, 전북 전주시 덕진구 금암동 634-18 전북대학교 의과대학 내과학교실
Tel : 063)250-1791, Fax : 063)254-1609 E-mail : [email protected]
서 론
혈관형성은 이미 존재하던 혈관구조로부터 새로운 혈관 들의 생성을 뜻한다. 여기에는 다단계 과정으로 세포외기 질을 이루는 단백질의 분해와 혈관내피세포와 혈관주위세 포의 활성화, 증식, 이동 등이 관계된다. 배란, 태반형성,
배형성 등의 생리학적 혈관신생에 부가적으로, 혈관형성은 고형종양의 성장 및 전이의 발생에도 중요한 역할을 하고 있다.1～4) 이러한 혈관형성의 정도를 측정하는 대표적인 지 표로서 종양내 미세혈관밀도(microvessel density, MVD) 가 사용되고 있다. 미세혈관밀도는 여러 고형종양에서 증 가되며, 이런 종양들의 독립적인 예후인자로서도 인정되고 있다.5～7) 혈관형성의 과정에는 크게 신생혈관형성 촉진인자 및 억제인자가 관계되는 것으로 밝혀졌다. 이중 여러 가지의 신생혈관형성 촉진인자의 발현이 백혈병과 골수이형성증후 군에서 증가되고, 골수증식성질환에서도 중요한 역할을 한
다.8～12) 이중 가장 강하고 특이적인 신생혈관형성 촉진인자
는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 염기성 섬유아세포성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)이다.13,14) 이중에서도 VEGF는 강 력한 혈관형성 단백으로서 조혈모세포 발달의 조절, 세포 외 기질의 개조, 염증성 사이토카인의 생성 등을 포함한 다 양한 생물학적 효과를 가지며, 또한 특이적인 내피세포 분 열촉진인자로서 역할을 한다.14)
저자들은 VEGF가 골수증식성질환과는 상반되는 골수부 전상태롤 초래하는 재생불량성빈혈에서 어떤 발현양상을 보이는지 발현 정도를 확인해 보고, 또한 VEGF의 발현과 미세혈관밀도, 세포충실도와의 상관관계에 대해 알아보고 자 하였다.
대상 및 방법 1. 대 상
1999년 1월부터 2001년 12월까지 종양혈액내과에서 진단 된 25명의 중증재생불량성빈혈 환자의 골수 조직 표본을 대 상으로 하였다. 중증재생불량성빈혈은 international aplas- tic anemia study group criteria에 따라 분류하였고, 1) 절 대 호중구 수 <500/µL, 2) 혈소판 수 <20,000/µL, 3) 교 정망상구 수 <1% 의 3가지 기준 중 2가지 이상을 만족할 경우로 정의하였다.15) 대조군은 같은 기간 진단된 골수 침 범의 증거가 없는 전이성 고형종양 환자 10명의 골수 조직 표본을 선택했다. 모든 골수 조직 표본은 포르말린에 고정 하여 파라핀에 보관된 상태로 이용하였다.
2. 방 법
1) VEGF의 면역조직화학적 염색 및 분석
면역조직화학적 염색을 시행하기 위해 이용한 1차 항체 는 VEGF (monoclonal 1:100 BC PharMingen, San
Diego, CA, USA) 였다. 보관된 골수조직 표본을 4µm 두 께로 박절한 다음 Probe on Plus Slide (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)에 부착시키고 58℃ 오븐에서 30분 동안 방치 한 후 100% xylene으로 파라핀을 제거하고 100%, 90%, 75% 알코올로 처리 한 후 증류수로 함수 시 켰다. VEGF의 감추어진 항원을 노출시키기 위해 citrate buffer (pH 6.0)에 담가 microwave oven에 10분간 처리하 는 과정을 3회 반복하였다. 내인성 과산화효소를 억제하기 위해 3% 과산화수소로 10분간 처리한 후 증류수로 수세하 였다. 비특이적 염색을 감소시키기 위하여 정상 말의 혈청 과 30분간 반응시킨 후 일차항체를 처리하여 실온에서 2시 간 반응시켰고 Tris-buffered saline (TBS, DAKO, Carpinteria, CA, USA)로 수세하였다. 비오틴이 부착된 이차항체에 10분간 반응시키고 수세한 후 스트렙타비딘 과 산화효소(Peroxidase-labelled streptavidine)에 10분간 반 응시키고 TBS로 수세하였다. 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)로 5～10분간 발색시키고 헤마톡실린으로 대조염색 을 시행하였다.
골수 표본에서 VEGF의 발현 정도는 Bellamy 등14)이 제 시한 방법에 따라 광학 현미경 400배율 하에서 발현된 세포 를 관찰하였고, 발현 정도에 따라 발현이 전혀 되지 않은 것은 0점, 그리고 발현 정도가 강할수록 1,2,3,4점으로 구 분하고 골수 표본 전체에 걸쳐서 해당 세포의 발현강도를 평가하였다. 대조군의 경우는 중증재생불량성빈혈 환자의 최대 세포수에 해당하는 개수 만큼의 세포를 세어 비교하 였고 발현된 세포 모든 표본은 환자의 임상 정보를 주지 않 은 상태에서 서로 다른 병리 의사에 의해 두 차례씩 평가하 였다.
2) 미세혈관밀도와 세포충실도의 측정
미세혈관 내피세포의 면역조직화학적 동정을 위하여 항- CD34 항체(anti-HpCA-1, Immunotech, Cedex, France) 를 사용하였다. 골수 조직 표본은 EDTA로 탈회시키고, 4 µm 두께로 박절한 다음 100% xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고, 증류수로 함수시켰다. 내인성 과산화효소 활성를 억제하기 위해 3% 과산화수소로 30분 간 처리한 후 phos- phate-buffered saline (PBS)으로 3차례 수세하였다. 10%
정상 말 혈청과 20분간 반응시킨 후 항-CD34 항체를 처리 한 후 실온에서 60분 반응시켰다. 비오틴이 부착된 이차항 체에 30분간 반응시키고 그 후 스트렙타비딘 비오틴 과산 화효소(streptavidin-biotin peroxidase reagent, DAKO) 에 30분간 반응시키고 PBS로 수세하였다. 항체는 ABC방 법을 통해 측정하였고, 3,3`-diaminobenzidine으로 발색 시키고 헤마톡실린으로 대조염색을 시행하였다.
미세혈관밀도는 Weidner 등의 방법6)과 international
Fig. 2. Representative pattern of immunohistochemical staining for vascular endothelial growth factor in megakaryocyte (upper) and histiocyte (lower) of bone marrow section from aplastic anemia (AA) and control (C). (upper left) moderate (2). (upper right) very intensely positive (4). (lower left) faint (1).
(lower right) moderately intensely positive (3) (X400).
Fig. 1. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expres- sion of bone marrow (*P<0.05). In aplastic anemia, mega- karyocytes and histiocytes expressed less intense cytoplas- mic VEGF than in control. However, plasma cells showed higher VEGF immunoreactivity in aplastic anemia than in control (P=0.56).
megakaryocyte histiocyte plasma cell
Degree of Expression
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Aplastic anemia Control
*
*
consensus report16)에 따른 골수조직절편의 정해진 구역 내에서 측정하였고, 모든 표본들은 환자의 신원 및 임상상 태에 대한 정보를 주지 않은 상태에서 경험 있는 병리 전문 의가 평가하였다. 각 미세혈관밀도의 측정은 두차례씩 시 행하였다.
각 표본은 처음 100배율로 관찰하여 미세혈관수가 밀집 되어 있는 부분 중 세구역을 “hot spots”으로 지정하고 다시 200배율로 관찰하여 세구역의 “hot spots”의 정해진 구역 내에서 미세혈관의 수를 계산하고 각각의 값을 합한 후 평 균값을 내어 이를 미세혈관밀도로 삼았다. 이 때 혈관 중에 서 6～8개 이상의 적혈구가 들어갈 만큼 큰 혈관, 두꺼운 근층이 있는 혈관은 제외하였고 괴사, 염증 및 경화가 있는 부위도 수복반응으로 인한 이차적인 혈관의 증식이 나타나 므로 제외하였다. 한 개의 혈관내피세포 또는 내강이 없는 내피세포의 소집단은 세포 하나를 한 개의 혈관으로 간주 하여 계산하였다.
3) 통계학적 분석
중증재생불량성빈혈 환자와 대조군 사이의 미세혈관밀 도와 세포충실도는 Student's t test를 사용하여 비교하였 고, 양군간의 VEGF발현, 미세혈관밀도, 세포충실도와의 연관관계는 Spearman's rank correlation test를 이용하였 다. SPSS 10.0 통계 프로그램을 이용하여 각각의 상관관 계를 correlation analysis법으로 분석하였으며, P<0.05를 통계학적 의의가 있는 것으로 간주하였다.
결 과 1. VEGF 발현정도
Fig. 4. Microvessel immunohistochemical staining of bone marrow section from patient with aplastic anemia (A) and control (B) using antibodies against CD34 (×200).
Fig. 3. Microvessel density (MVD) and bone marrow (BM) cellularity (*P<0.05). MVD is significantly lower in patients with aplastic anemia, compared with control. MVD has a strong correlation with bone marrow cellularity.
Aplastic anemia Control
MVD BM Cellularity 0
10 20 30 40 50 60 70
*
*
표본 골수 조직의 면역조직화학적 염색상 VEGF의 발현 을 보인 세포는 megakaryocyte, histiocyte, plasma cell이 었다. 중증재생불량성빈혈 환자군과 대조군 사이의 VEGF 발현의 정도는 각각 megakaryocyte에서는 0.44±0.61, 2.2±0.40, histiocyte에서는 1±0.35, 2.1±0.68 그리고 plasma cell에서는 1.6±1.5, 1.5±0.59로 나타났다(Fig.
1, 2). Megakaryocyte나 histiocyte에서 보인 VEGF 발현 정도는 중증재생불량성빈혈 환자에서 의의 있게 낮은 값을 보였으며(P<0.05), plasma cell에서는 중증재생불량성빈 혈 환자에서 더 높은 값을 보였으나 통계학적 유의성은 확 인 할 수 없었다(P=0.56).
2. 미세혈관밀도와 세포충실도
미세혈관밀도는 중증재생불량성빈혈의 경우 21.43±7.24, 대조군에서는 27.65±3.44로 중증재생불량성빈혈 환자의 경
우에 의의 있게 낮은 값을 보였다(P<0.05) (Fig. 3).
골수의 세포충실도는 중증재생불량성빈혈은 15±5.35
%, 대조군은 48.3±9.83%로 측정되었다(Fig. 4).
3. VEGF의 발현정도와 미세혈관밀도, 세포충실도와의 관계
중증재생불량성빈혈 환자군과 대조군을 모두 포함한 분 석에서 VEGF의 발현과 미세혈관밀도는 양의 상관관계를 가지고 있었으며(P<0.05), 미세혈관밀도와 세포 충실도 사이에도 유의한 상관관계를 가지고 있었다(P<0.05).
고 찰
VEGF는 34-, 42-kDa의 이량체 다기능 당단백으로 pla- telet-derived growth factor (PDGF)와 15～25%의 상동 성을 가진다. 이는 8개의 exon과 7개의 intron으로 구성되 며, 여러 가지의 동형체를 가지는데, 121-, 165-, 189-, 206- 아미노산형이 밝혀져 있다. 이중 대부분은 165-아미노 산 동형체이다.17) VEGF는 강한 혈관형성 단백질로서 조혈 모세포발달의 조절, 세포외 기질의 개조, 염증성 사이토카 인의 생성 등을 포함한 다양한 생물학적 효과를 가지며,14) 특이적인 내피세포 분열촉진인자로, 강한 신생혈관형성 촉 진인자로서 역할을 한다.18) VEGF의 생물학적 효과는 2가지 의 고친화성 tyrosine kinase 수용체인 160-kD c-fms-like tyrosine kinase (Flt-1, VEGFR-1)와 180-～200-kD fetal liver kinase-1 (KDR, Flk-1, VEGFR-2)와의 반응에 의해 나타난다.19～22) VEGF 수용체들의 세포발현은 증식하는 내 피세포에만 한정되어 있는 것이 아니라, 대식세포, 거핵세 포, 원시 조혈모세포에서도 발현된다.12,18)
VEGF는 여러 종류의 고형종양, 예를 들면 유방암, 폐
암, 위암, 대장암, 간암 등에서 그 발현이 증가됨과 혈관형 성과의 관련성 등이 증명되었다.23) 또한 최근 여러연구에 서 VEGF 및 다른 혈관형성 인자들이 혈액관련암에서도 중 요한 병태생리를 담당함을 보여주었다. Fiedler 등은 급성 골수성백혈병 환자 골수 표본의 72%에서 VEGF의 분비와 발현이 증가되고, Flt-1 또는 KDR유전자의 발현도 각각 환자의 52%, 19%에서 나타남을 보였으며,24) Pruneri 등 은 골수이형성증후군과 급성골수성백혈병에서 골수의 미세 혈관밀도가 증가하고, 또한 VEGF의 발현도 증가된다는 것 을 보고하였다.25) 김도연 등도 급성골수성백혈병에서 VEGF의 발현과 미세혈관밀도가 의미있게 증가되어 신생 혈관형성과의 관련성을 증명하였으며,11) 다발성 골수종에 서도 VEGF의 발현과 미세혈관밀도가 유의하게 증가되고 IL-6도 발현되어 이들이 병의 경과에 중요한 역할을 할것 임을 시사한 바 있다.12) 또 골수구의 VEGF단백량이 무병 생존율과 전체 생존율과 관련하여 독립적인 예후인자로서 고려될 수 있음을 밝힌 바 있다.17)
본 연구에서 VEGF와 함께 비교한 미세혈관밀도 역시 혈 관형성의 활성을 측정하는 대표적인 지표로서 유방암, 전 립선암, 난소암, 소화기계암을 포함한 여러 고형암에서 전 이와 예후 예측인자로서 이용될 수 있다고 보고되고 있으 며, B세포 비호지킨림프종 환자의 병기와 관련성을 가지 며, 다발성골수종에서도 현저히 증가되며, 소아의 급성림 프구성백혈병, 급성골수성백혈병에서도 증가되는 것이 증 명되어 백혈병 및 그 외 골수증식성질환에서 증가되는 것 이 밝혀져 있다.5,6)
지금까지 VEGF, 미세혈관밀도와 고형종양, 백혈병 및 골수증식성질환과의 상관관계에 관한 연구는 많으나 재생 불량성빈혈과 같은 골수부전질환과의 관계에 대해 아직 정 립된 바가 없다.
이번 연구에서는 골수부전질환의 대표격인 중증재생불 량성빈혈 환자와 대조군으로서 정상인의 골수에서 VEGF 의 발현정도를 비교하는 것에 중점을 두어 실험을 하였다.
VEGF는 모든 세포군에서 발현되는 것은 아니며, Bellamy 등의 연구에 따르면 적아구, 림프구, 골수구성 세포군에서 는 발현되지 않으며,14) 본 연구에서도 역시 거핵구, 대식 세포, 형질세포에서만 발현되었다. VEGF는 거핵구와 대 식세포에서는 중증재생불량성빈혈 환자에서 의의 있게 낮 게 발현이 되었지만, 형질세포에서는 대조군에서 더 낮게 발현되는 경향을 보였으나 통계학적인 유의성은 없었다.
형질세포에서 상반되는 결과를 보인데 대해서는 골수내 형 질세포의 비율이 너무 낮아 의의 있는 값을 보이지 못한 것 으로 생각된다.
이렇게 VEGF 발현 정도는 골수증식성질환과는 상반되
는 결과를 보였다. 또한 함께 비교한 미세혈관밀도와 세포 충실도와의 상관관계에서 미세혈관밀도 역시 의의 있게 중 증재생불량성빈혈 환자에서 낮은 값을 보였고, 세포충실도 역시 더 낮았다. 그러므로 낮은 VEGF 발현과 낮은 미세 혈관밀도, 세포충실도 사이에는 상관관계가 있는 것으로 보인다.
Ahn 등은 모든 다발성골수종 환자에서 미세혈관밀도가 증가되는 것이 아니며 골수내 형질세포의 백분율이 미세혈 관밀도와 중요한 상관관계가 있다고 하였다.5) 이렇듯 이번 연구에서도 적은 표본수로 인해 골수의 세포충실도의 정도 에 따른 VEGF의 발현과 미세혈관밀도와의 상관관계에 대 해 충분히 실험하지 못해 재생불량성빈혈의 중증도와 VEGF 및 미세혈관밀도와의 관계 및 이들이 예후에 미치는 영향에 대한 연구가 부족한 것이 단점으로 생각되며 앞으 로 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.
결론적으로 중증재생불량성빈혈 환자에서 VEGF의 발현 은 저하되어 있었으며, 미세혈관밀도 역시 낮은 값을 보였 다. 그리고 VEGF의 발현과 미세혈관밀도, 세포충실도는 서로 연관관계를 가지는 것으로 보였고, 재생불량성빈혈의 병인론의 연구 및 치료와 관련하여 VEGF에 대한 연구가 더욱 필요하리라 생각된다.
요 약
배 경 : Vascular endothelial growth factor (VEGF)는 강한 혈관형성 단백으로 조혈모세포발달의 조절, 세포외 기질의 개조, 염증성 사이토카인의 생성 등을 포함하는 다 양한 생물학적 효과를 가진다. 여러 실험에서는 VEGF가 백혈병과 골수이형성증후군에서 증가되고 골수증식성질환 에서 중요한 역할을 함이 밝혀졌다. 이번 연구에서는 골수 증식성질환과는 상반되는 재생불량성빈혈환자에서 VEGF 발현에 대해 살펴보고, 미세혈관밀도 및 세포충실도와의 상관관계에 대해 평가해 보고자 하였다.
방 법 : 25명의 중증재생불량성빈혈 환자와 10명의 정상 대조군의 골수조직표본을 대상으로 하여 VEGF단백을 검 출하기 위해 포르말린에 고정되고 파라핀에 보관된 골수조 직 표본에 labeled avidin-biotin 방법을 이용하여 면역조직 화학적 염색을 시행하였다. 미세혈관밀도는 CD34항원을 이용한 면역조직화학적 염색을 시행한 각 골수표본의 절편 에서 가장 높은 미세혈관밀도를 보이는 적어도 3구역 (×200)에서 계산되었다.
결 과 : 중증재생불량성빈혈에서 거핵구와 조직구의 VEGF의 발현이 대조군보다 의의 있게 낮았다(P<0.05).
그러나 형질세포에서는 대조군에 비해 재생불량성빈혈의
경우에 더 높은 VEGF의 면역반응을 나타냈다. 미세혈관밀 도는 대조군(27.65±3.44)에 비해 재생불량성빈혈(21.43
±7.24)에서 의의 있게 낮았으며(P<0.05), 미세혈관밀도 는 골수의 세포충실도와 깊은 상관관계를 가지는 것을 확 인 할 수 있었다. 또한, VEGF의 발현 정도도 골수의 미세 혈관밀도 및 세포충실도와 상관관계를 가지는 것으로 나타 났다.
결 론 : 미세혈관밀도와 VEGF 발현에 의해 평가된 혈관 형성이 재생불량성 빈혈의 병인론에서 중요한 역할을 담당 할 것으로 생각된다.
참 고 문 헌
1) Aguayo A, Kantarjian H, Manshouri T, Gidel C, Estey E, Thomas D, Koller C, Estrov Z, Brien SO, Keating M, Freireich E, Albitar M : Angiogenesis in acute and chronic leukemias and myelo-dysplastic syndromes. Blood 96:2240-2245, 2000
2) Kimura H, Weisz A, Kurashima Y, Hashimoto K, Ogura T, Acquisto FD, Addeo R, Makuuchi M, Esumi H : Hypoxia response element of the human vascular endothelial factor gene mediates transcrip- tional regulation by nitric oxide : Control of hypo- xia-inducible factor-1 activity by nitric oxide. Blood 95:189-197, 2000
3) Takakura N, Watanabe T, Suenbu S, Yamada Y, Noda T, Ito Y, Satake M, Suda T : A role for hematopoietic stem cells in promoting angiogene- sis. Cell 102:199-209, 2000
4) Antonio R, Atayde P, Stephen E. Sallan, Tedrow U, Connors S, Allred E, Folkman J : Spectrum of tumor angiogenesis in the bone marrow of children with acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol 150:815-821, 1997
5) Ahn MJ, Park CK, Choi JH, Lee WM : Clinical significance of microvessel density in multiple mye- loma patients. J Korean Med Sci 16:45-50, 2001 6) Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J :
Tumor angiogenesis and metastasis - correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 324:
1-8, 1991
7) Ziegler BL, Valtieri M, Porada GA, Maria RD, Muller R, Masella B, Gabbianelli M, Casella I, Pelo- si E, Bock T, Zanjani ED : KDR receptor : A key marker defining hematopoietic stem cells. Science 285:1553-1558, 1999
8) Tordjman R, Delaire S, Plouet J, Ting S, Gaulard P, Fichelson S, Romeo PH, Lemarchandel V : Ery- throblasts are a source of angiogenic factors. Blood 97:1968-1974, 2001
9) Pelletier L, Regnard J, Fellmann D, Charbord P : An
in vitro model for the study of human bone marrow angiogenesis : Role of hematopoietic cytokines. Lab Invest 80:501-511, 2000
10) Majka M, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J, Ehrenman K, Pietrzkowski Z, Kowalska MA, Gewirtz AM, Emerson SG, Ratajczak MZ : Nu- merous growth factors, cytokines, and chemokines are secreted by human CD34＋ cells, myeloblasts, erythroblasts, and megakaryoblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner. Blood 97:3075-3085, 2001
11) Kim DY, Im SA, Lee KE, Lee HJ, Nam EM, Seong CM, Lee SN, Park HR, Koo HS, Han WS : The significance of vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in acute myelogenous leukemia. Korean J Hematol 35:252-257, 2000 12) Park SY, Im SA, Nam EM, Kim DY, Choi YA, Lee
KE, Seong CM, Lee SN, Koo HS, Kim SS : Ex- pression of vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in multiple myeloma. Korean J He- matol 36:35-42, 2001
13) Brunner G, Nguyen H, Gabrilove J, Rifkin DB, Wilson EL : Basic fibroblast growth factor expres- sion in human bone marrow and peripheral blood cells. Blood 81:631-638, 1993
14) Bellamy WT, Richter L, Sirjani D, Roxas C, Gibson BG, Frutiger Y, Grogan TM, List AF : Vascular endothelial cell growth factor is an autocrine pro- moter of abnormal localized immature myeloid precursors and leukemia progenitor formation in myelodysplastic syndromes. Blood 97:1427-1434, 2001
15) Camitta BM, Thomas ED, Nathan DG : A prospec- tive study of androgens and bone marrow trans- plantation for treatment of severe aplastic anemia.
Blood 53:504-514, 1979
16) Vermeulen PB, Gasparini G, Fox SB, Toi M : Quan- tification of angiogenesis in solid human tumors: an international consensus on the methodology and criteria evaluation. Eur J Cancer 32:2474-2484, 1996
17) Aguayo A, Estey E, Kantarjian H, Mansouri T, Gidel C, Keating M, Giles F, Estrov Z, Barlogie B, Albitar M : Cellular vascular endothelial growth factor is a predictor of outcome in patients with acute myeloid leukemia. Blood 94:3717-3721, 1999 18) Mohle R, Green D, Moore MAS, Nachman R, Rafii
S : Constitutive production and thrombin-induced release of vascular endothelial growth factor by hu- man megakayocytes and platelets. Proc Natl Acad Sci 94:663-668, 1997
19) Hamada K, Oike Y, Takakura N, Jussila L, Dumont DJ, Alitalo K, Suda T : VEGF-C signaling path- ways through VEGF-2 and VEGFR-3 in vasculo- angiogenesis and hematopoiesis. Blood 96:3793-
3800, 2000
20) Hattori K, Dias S, Heissig B, Hackett NR, Lyden D, Tateno M, Hicklin DJ, Crystal RG, Moore MAS : Vascular endothelial growth factor and angiopoie- tin-1 stimulate postnatal hematopoiesis by recruit- ment of vasculogenic and hematopoietic stem cells. J Exp Med 193:1005-1014, 2001
21) Dias S, Hattori K, Heissig B, Zhu Z, Wu Y, Witte L, Hicklin DJ, Tateno M, Bohlen P, Moore MAS, Rafii S : Inhibition of both paracrine and autocrine VEGF/VEGFR-2 signaling pathway is essential to induce long-term remission of xenotransplanted human leukemias. Proc Natl Acad Sci 98:10857- 10862, 2001
22) Huang XL, Takakura N, Suda T : In vitro effects of angiopoietins and VEGF on hematopoietic and
endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 264:133-138, 1999
23) Fujisawa T, Watanabe J, Akaboshi M, Ohno E, Kuramoto H : Immunohistochemical study on VEGF expression in endometrial carcinoma - comparison with p53 expression, angiogenesis, and tumor his- tologic grade. J Cancer Res Clin Oncol 127:668- 674, 2001
24) Fiedler W, Graeven V, Ergun S : Vascular endo- thelial growth factor, a possible paracrine growth factor in human acute myeloid leukemia. Blood 89:1870-1875, 1997
25) Pruneri G, Bertolini F, Soligo D : Angiogenesis in myelodysplastic syndrome. Br J Cancer 81:1398- 1401, 1999
