67 서 론
어성초(Houttuynia cordata Thunb.)는 약모밀, 삼백초라 불 리우는 다년생 초본으로, 독특한 냄새를 함유한 생리활 성물질들이 있어, 몸의 신진대사를 도와 혈액을 맑게 하 고, 신장기능을 촉진시켜 체내독소를 배출하는 등의 효 능이 알려진 민간약초이다.1,2) 어성초는 이뇨, 해독, 항균
작용, 항암작용이 있으며, 통풍, 당뇨병, 고혈압 등의 치 료와 피부미용을 위하여 사용된다.3∼5) 현재 우리나라에 서는 주로 차로 다려 먹거나, 생즙 또는 엑기스, 환 종류 가 건강보조식품으로 판매되어 섭취되고 있다.
어성초잎에 함유되어 기능성을 내는 물질로는 fla- vonoid성분이 잘 알려져 있다.6,7) 특히 quercetin, quercitrin, rutin및 myricetin 등이 함유되어 있다.8) 이들 성분 중 quercetin은 많은 약리 작용이 알려져 있는데 과산화지질
Correspondence to：Kun-Young Park
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, 30 Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: +82-51-510-2839, Fax: +82-51-514-3138 E-mail: [email protected]
Ames 실험계에서 어성초 물분획물의 항돌연변이 효과
1부산대학교 식품영양학과, 2동주대학 외식조리&영양계열
길정하1․김은영1․공창숙1․김소희2․박건영1
Antimutagenic Effects of Aqueous Fraction from Houttuynia Cordata in Ames Test System
Jeung-Ha Kil1, Eun-Young Kim1, Chang-Suk Kong1, So-Hee Kim2 and Kun-Young Park1
1Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
2School of Cookery & Nutrition, Dong-Ju College, Busan 604-080, Korea
The antimutagenic effects of methanol extracts of sun dried and freeze dried Houttuynia cordata (HC) using Salmonella typhimurium TA100 in the Ames test system were evaluated. The methanol extract of freeze dried HC showed higher antimutagenic effect against aflatoxin B1 (AFB1) than that of sun-dried HC by approx. 10%. Whereas, the inhibitory activity of the methanol extracts of the HC on N-methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) was somewhat lower compared to AFB1. The separated fractions from the methanol extract showed strong antimutagenic activities both in chloroform and aqueous fractions against AFB1. However, in case of MNNG, the aqueous fraction exhibited antimutagenic effect while the chloroform fraction did not show the antimutagenic activities. From this results, the lipid soluble (chloroform) fraction from the methanol extract of HC exhibited strong antimutagenic effect on AFB1
which is an indirect mutagen, but not on MNNG which is a direct mutagen, however, the aqueous fraction from the methanol extract of HC showed strong antimutagenic effects both on AFB1 and MNNG. The aqueous fraction of HC which generally be prepared as a folk medicine or tea proved to have the antimutagenic activity in this study. (Cancer Prev Res 10, 67-72, 2005)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Houttuynia cordata Thunb, Aqueous fraction, Antimutagenicity, Ames test
책임저자：박건영, ꂕ 609-735, 부산시 금정구 장전동 30 부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2839, Fax: 051-514-3138 E-mail: [email protected]
접수일：2005년 1월 20일, 게재승인일：2005년 2월 21일
형성 억제작용,9) 항바이러스,10,11) 항균효과,12,13) 항돌연변 이 작용14) 및 발암성 물질의 활성감소, 변이 암세포의 생 육저해, 혈압강하, 모세혈관 강화작용 등의 약리작용이 알려져 있다.15)
현재까지 어성초에 대한 기능성 연구로는 지질개선 및 간개선, 항산화성 그리고 면역기능 등에 대한 연구는
많으나,16∼22) 암예방 및 항암성에 대한 기능성 연구로는
암세포의 성장 저해,23) 항종양 효과24)에 관한 실험이 연 구되어 있으나 아직 부족한 실정이며, 암의 개시단계에 서 돌연변이 유발을 억제할 수 있는지에 대한 실험은 알 려진 바가 거의 없다.
본 연구에서는 어성초의 항돌연변이 효과를 알아보았 는데, 특히 어성초는 자연건조된 것을 차로 끓어서 섭취 하거나 한약재로 다려 먹는 일이 많으므로 자연건조 한 어성초와 비교로 동결건조 한 시료를 메탄올로 추출하 여 그 효과를 측정하여 보았다. 또한 어성초의 항돌연변 이 활성물질이 지용성인지 수용성인지를 알아보기 위해 어성초 메탄올추출물을 클로로포름분획물과 물분획물 로 나누어 항돌연변이 효과를 비교하였다.
재료 및 방법 1. 어성초 시료 및 추출물의 조제
생어성초(잎과 줄기)와 자연 건조된 어성초는 경남 함 안군 여항면에서 채집한 것을 기증받아 실험에 사용하 였다. 생시료는 흐르는 물에 깨끗이 씻어, 동결건조하여 분쇄하였고, 건조어성초는 그대로 하여 각각 시료 중량 의 20배의 메탄올을 첨가하고 12시간 교반을 3회 반복하 여 메탄올 추출을 하였다. 이것을 회전식 진공농축기로 농축한 후, dimetyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 실험에 사 용하였다.
2. 어성초의 클로로포름분획물 및 물분획물
위와 동일한 방법으로 메탄올추출물을 제조하고, 이 메탄올추출물에 20배의 chloroform-methanol (2：1, v/v) 용 매를 가하여 균질화한 다음 분획 여두에 옮겨 증류수로 씻어 분리되는 클로로포름층을 취하여 클로로포름분획 물을 만들고, 남은 부분을 물분획물로 분리시킨 후 농축 하여 실험에 사용하였다.
3. Ames 실험계를 이용한 항돌연변이 실험
간접돌연변이 유발물질인 aflatoxin B1 (AFB1)과 직접돌 연변이 유발물질 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)
은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Mo. USA)에서 구 입하여 각각 DMSO와 증류수에 녹여 사용하였다. 사용 균주로는 Salmonella typhimurium TA100으로 미국 California 대학 B. N. Ames 박사로부터 제공받아 실험에 사용하였 다. 그리고 이 실험균주는 매 실험직전 histidine 요구성, deep rough (rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이, R factor 등의 유 전형질을 확인하여 사용하였다. AFB1 돌연변이원을 활 성화시키기 위하여 Maron과 Ames의 방법25)에 따라 간의 microsomal 효소화합물인 S9 mixture를 조제하였다. Prein- cubation test는 S9 mix 0.5 ml, 하룻밤 배양된 균주(1∼2×
109 cell/ml) 0.1 ml, 희석된 시료(50μl)와 돌연변이 유발 물질(50μl)을 ice bath에 담긴 cap tube에 넣고 가볍게 vortex한 후 37oC에서 30분간 배양하였다. 45oC의 top agar 2 ml씩을 각 tube에 붓고 vortex한 후 minimal glucose agar plate에 도말하고 37oC에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변 이 숫자를 계수하였다. MNNG는 S9 대신에 인산용액 0.5 ml을 이용하여 위와 같은 방법으로 하였다. 한편, 실험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험 (dose response 및 독성실험)을 통하여 결정하였다.25) 4. 통계 분석
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 SAS sys- tem (v8.2 SAS Institute Inc., NC, USA)에서 t-test와 Dun- can’s multiple range test를 이용하여 통계분석을 행하였 다.
결 과 1. 어성초 추출물의 항돌연변이 효과
자연건조 어성초와 동결건조 어성초의 메탄올추출물 의 간접돌연변이원인 AFB1에 대한 항돌연변이 효과는 Table 1과 같다. 시료의 메탄올추출물의 농도에 따른 Salmonella typhimurium TA100에 대한 독성실험을 해 본 결 과 자연건조 어성초와 동결건조 어성초 메탄올추출물 10 mg/plate 농도까지 독성은 나타나지 않았기 때문에 본 실험은 5 mg/plate 이하의 농도에서 실험을 행하였다. 어 성초의 메탄올추출물은 농도가 증가함에 따라 항돌연변 이성도 증가하였는데, 자연건조 어성초 보다 동결건조 어성초가 높은 저해율을 나타냈다. 자연건조 어성초의 저해율을 보면 시료 농도가 0.05 mg/plate일 때는 28%의 저해율을 나타난 것에 반해 0.25 mg/plate 와 0.5 mg/plate 일 때는 각각 70%와 83%의 저해율을 보여 농도가 증가
함에 따라 저해율이 증가하였지만, 고농도인 2.5 mg/
plate 와 5 mg/plate의 농도로 시료를 처리했을 때는 저해 율이 각각 93%와 97%로 더 이상 증가하지 않는 것을 볼 수 있다. 동결건조 어성초의 경우에도 저농도로 시료를 처리하였을 때 농도가 0.05, 0.25, 0.5 mg/plate로 증가함 에 따라 각각 44%, 79%, 97%의 저해율을 보여, 시료의 농도가 증가함에 따라 저해율을 높아졌지만, 2.5, 5 mg/
plate의 고농도에서는 농도가 증가하여도 저해율은 97%
로 더 이상 증가하지 않았다. 그리고 자연건조 어성초와 동결건조 어성초의 효과를 비교했을 때 동결건조 어성 초가 다소 높은 항돌연변이효과를 나타냈지만, 고농도 에서는 차이가 없었다.
직접돌연변이원인 MNNG에 대한 항돌연변이성은 Table 2와 같다. 간접돌연변이원에 대한 항돌연변이성에 비해 직접돌연변이원인 MNNG에 대한 저해율이 다소 낮게 나타났다. 동결건조 어성초 메탄올 추출물을 농도 별(0.05, 0.25, 0.5, 2.5, 5 mg/plate)로 처리한 결과 저해율 이 각각 50%, 55%, 56%, 70%, 70%로 나타나, 저농도에 서는 시료 농도 증가에 따라 농도 의존적으로 저해율이 높아지나 2.5 mg/plate 이상의 고농도에서는 항돌연변이 효과가 70% 이상 더 증가되지 않았다.
2. 클로로포름분획물과 물분획물의 항돌연변이 효과 자연건조 어성초의 클로로포름분획물과 물분획물의 AFB1에 대한 항돌연변이 효과를 실험한 결과는 Fig. 1과 같다. 클로로포름분획물과 물분획물 모두에서 시료의 농도가 증가함에 따라 항돌연변이 효과가 높게 나타났 다.
Table 1. Effect of methanol extracts of freeze dried and sun dried Houttuynia cordata (HC, mg/plate) on the mutagenicity induced by aflatoxin B1 (AFB1, 0.15μg/plate) in Salmonella typhimurium TA100
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Revertants/plate
Sample ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Sun dried HC Freeze dried HC ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Spontaneous 84±121)
Control (AFB1) 1246±187 AFB1+Low Conc. (mg/plate)
0.05 916±160 (28)2) 734±65* (44) 0.25 456±43 (70) 324±50* (79) 0.50 283±51 (83) 123±8* (97) High Conc. (mg/plate)
2.5 164±6 (93) 114±14* (97) 5.0 123±33 (97) 112±5 (97) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
*Means in the same concentration between HC and freeze dried HC are significantly different (p＜0.05) by t test.
1)Values are mean±SD.
2)Inhibition rate (%)
Table 2. Effect of methanol extracts of freeze dried Houttuynia cordata on the mutagenicity induced by N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (MNNG, 0.40μg/plate) in Salmonella typhimu- rium TA100
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Revertants/plate ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Spontaneous 121±191)
Control (MNNG) 569±119a
MNNG+Low Conc. (mg/plate)
0.05 349±67b 502)
0.25 327±27b 55
0.50 320±37b 56
High Conc. (mg/plate)
2.5 262±69bc 70
5.0 262±11c 70
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
1)Values are mean±SD.
2)Inhibition rate (%)
a∼cMeans with the different letters in the same column are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
Fig. 1. Antimutagenic effect of chloroform fraction and aqueous fraction from methanol extract of sun dried Houttuynia cordata on the mutagenicity of aflatoxin B1 (AFB1, 0.2μg/plate) in Salmonella typhimurium TA100.
Spontaneous number was 19±4.
a∼dMeans with the different letters are significantly different (p＜
0.05) by Duncan's multiple range test.
그리고 동결건조 어성초의 메탄올추출물을 클로로포 름분획물과 물분획물으로 나누어 간접돌연변이원인 AFB1
에 대한 항돌연변이 효과를 실험해 본 결과는 Fig. 2와 같다. 클로로포름분획물과 물분획물 모두에서 비슷한 정도의 항돌연변이 효과가 나타났다. 또한 클로로포름 분획물과 물분획물 모두에서 시료의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 항돌연변이 효과가 높아지는 것 을 관찰할 수 있었다.
자연건조 어성초의 분획물의 직접돌연변이원인 MNNG 에 대한 항돌연변이 효과는 Fig. 3와 같다. 클로로포름분 획물은 모든 실험농도에서 직접돌연변이원에 대한 저해 율이 나타나지 않았으나, 물분획물을 2.5∼5 mg/plate 농 도로 처리하였을 때 78∼83%의 저해효과가 나타나서 직 접돌연변이원인 MNNG에 대해서는 물분획물의 효과가 클로로포름분획물보다 높게 나타났다. 물분획물을 낮은 농도인 0.5 mg/plate 농도로 처리하였을 때는 항돌연변이 효과가 나타나지 않았으나, 2.5 mg/plate 이상으로 처리 하였을 때는 높은 항돌연변이 효과를 나타내었다.
고 찰
간접돌연변이원인 AFB1에 대해서 자연건조 어성초와 동결건조 어성초 모두에서 높은 저해율을 나타내었는 데, 자연건조 어성초 보다 동결건조 어성초가 다소 높은 저해율을 보였으나 높은 농도에서는 차이가 나타나지
않았다. 또한 직접돌연변이원인 MNNG에 대한 항돌연 변이성은 다소 낮게 나타났다. 따라서 어성초는 직접돌 연변이원에는 효과가 낮았으나, 간접돌연변이원에 큰 효과를 나타내므로 S9 활성에 영향을 미치는 것으로 사 료되어 진다. 그리고 어성초 메탄올추출물을 물분획물 과 클로로포름분획물으로 분획하여 항돌연변이를 알아 본 결과 AFB1에 대해서는 두 층 모두 효과가 있었지만, MNNG에 대해서는 물분획물이 높은 효과를 보였다. 이26) 는 어성초가 구강유암피암종세포에 대해 에탄올추출물 과 물추출물이 클로로포름분획물이나 핵산분획물 보다 높은 암세포 증식억제 효과를 보였다고 하여 본 연구결 과와 유사한 효과를 보고하였다. 어성초는 일반적으로 한약재로 사용되거나 차로 끓여서 섭취한다. 본 실험에 서 물분획물은 간접돌연변이와 직접돌연변이원 둘 다에 광범위하게 효과가 있었으므로, 어성초는 한약제나 차 로 섭취하는 것이 좋은 방법으로 사료된다.
어성초의 수층에서 높은 항돌연변이 기능성을 나타내 는 원인 물질으로는 어성초에는 flavonoid성분이 함유되 어 있는데, 이26)는 어성초의 에탄올추출물을 생육시기나 부위에 따라 다소 차이는 있으나 0.5∼0.7% 정도의 quercetin을 함유하고 있다고 하였다. 또한 건조 어성초를 80oC에서 30분간 추출하여 tannin의 함량을 측정한 결과 생육시기에 따른 차이는 없으며 잎에 2.3% 정도 함유되 어 있다고 하였다.
어성초의 신선한 잎에는 항암성이 알려진 quercetin뿐 Fig. 2. Antimutagenic effect of chloroform fraction and aqueous
fraction from methanol extract of freeze dried Houttuynia cordata on the mutagenicity of aflatoxin B1 (AFB1, 0.2μg/plate) in Salmonella typhimurium TA100.
Spontaneous number was 19±4.
a∼dMeans with the different letters are significantly different (p＜
0.05) by Duncan's multiple range test.
Fig. 3. Antimutagenic effect of chloroform fraction and aqueous fraction from methanol extract of sun dried Houttuynia cordata on the mutagenicity of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG, 0.40μg/plate) in Salmonella typhimurium TA100.
Spontaneous number was 139±20.
a∼cMeans with the different letters are significantly different (p＜
0.05) by Duncan's multiple range test.
만 아니라 quercitrin이 함유되어 있는데, quercitrin도 높은 항암효력이 있다고 기록되어 있고,2) quercitrin, isoquerci- trin, quercetin은 인체 대장암세포, 생쥐 임파성 백혈병 세 포에 큰 효과를 나타낸다고 보고된 바 있다.27) 그리고 어 성초에 2.3% 함유된 tannin은 Kaur 등28)의 연구에 의하면 Salmonella typhimurium TA98과 TA100를 이용한 Ames test에 서 높은 항돌연변이 효과가 보고되었다.28)
이와 같은 결과는 민간요법으로 사람들이 어성초를 항암 약제로 사용한 과학적 근거를 증명한 것으로, 어성 초를 차로 끓여 섭취하거나 한약재로 이용하는 것이 효 과적인 암예방수단으로 사용될 수 있을 것으로 보인다.
결 론
어성초는 간접돌연변이원인 AFB1에 높은 저해율을 나 타내었으며, 동결건조시료가 자연건조 시료보다 다소 효과가 높았다. 그러나 직접돌연변이원인 MNNG에 대 한 항돌연변이성은 낮게 나타났다.
어성초 메탄올추출물을 클로로포름분획물과 물분획 물으로 분획하여 각각의 AFB1에 대한 저해율을 알아본 결과 자연건조 어성초와 동결건조 어성초의 효과는 비 슷하였으며, 클로로포름분획물과 물분획물 모두에서 높 은 항돌연변이효과가 나타났다. 그러나 MNNG에 대한 효과는 클로로포름분획물은 나타나지 않았으나, 물분획 물에서 높은 항돌연변이성을 나타냈다. 그러므로 어성 초는 직접돌연변이원보다 간접돌연변이원에서 더 높은 효과가 있는데, 이는 간에서 효소계 대사에 작용하여 간 접돌연변이원에 의한 돌연변이 발생을 억제하는 것으로 사료된다. 특히 물분획물은 직접돌연변이원과 간접돌연 변이원 모두에서 광범위하게 작용하는데, 이는 물분획 물에 quercetin이나 quercetrin 등의 flavonoid 성분이 함유 되어 있기 때문으로 사료되며, 따라서 어성초잎을 차로 끓여 마시거나 한약재로 다려 먹는 것은 암예방에 효과 적일 것으로 사료된다.
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