끄라차이담의 분획별 항산화 활성 및 화장품 소재 개발에 관한 연구 최미현

(1)

끄라차이담의 분획별 항산화 활성 및 화장품 소재 개발에 관한 연구

최미현․김경희․육홍선 충남대학교 식품영양학과

Antioxidant Activity and Development of Cosmetic Materials of Solvent Extracts from Kaempferia parviflora

Mi-Hyun Choi, Kyoung-Hee Kim, and Hong-Sun Yook Department of Food and Nutrition, Chungnam National University

ABSTRACT To confirm the antioxidant activity and potential of cosmetic materials of Kaempferia parviflora, ethanol extracts of K. parviflora were fractionated with n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol, and water. The extraction yield of the ethanol extract was 32.46%, while those of the other fractions were ≤10%. The total phenol content was 19.48∼92.26 gallic acid equivalent mg/g, with the highest content being found in the dichloromethane fraction. The flavonoid contents were 15.66∼67.73 catechin equivalent mg/g, with the ethyl acetate fraction showed the highest levels. The DPPH and ABTS radical scavenging ability and ferric reducing antioxidant potential activity of the ethyl acetate fraction was highest, whereas it was lowest in the water fraction. Evaluation of the tyrosinase inhibition activity, based on the whitening effect, revealed values of 52.89 to 79.68% at 1 mg/mL, with ethanol extract having the highest value. At the same concentration, elastase inhibition activity was significantly higher, with values of 38.60%, 36.85%, and 34.62% being observed in the dichloromethane, water, and n-butanol fractions, respectively.

These results imply that the ethanol extracts and solvent fractions of K. parviflora are potential sources of natural antioxidants with free radical scavenging activity that might be useful for inhibiting tyrosinase and elastase.

Key words: Kaempferia parviflora, antioxidant activities, tyrosinase inhibition activity, elastase inhibition activity

Received 15 January 2018; Accepted 4 March 2018

Corresponding author: Hong-Sun Yook, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-42-821-6840

서 론

생체 내에서 발생하는 superoxide anion radical, hydroxyl radical, singlet oxygen, hypochlorite, hydrogen peroxide 등과 같은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 정상적인 대사과정 중에서 지속해서 생성되는 부산물로 DNA, 단백질, 세포 분자들의 산화적 손상을 유발 하여 암, 심혈관 질환 및 퇴행성 장애 등 다양한 질병을 일으 키게 한다(1). 체내 대사 작용뿐만 아니라 환경오염물질 노 출, 각종 스트레스, 특히 자외선 등에 의하여 생성이 촉진된 free radical은 세포 생체막의 구성물질인 불포화지방산을 공격하여 과산화 반응을 발생시켜 피부에 존재하는 항산화 물질의 파괴, 결합조직 성분인 collagen과 elastin 및 hya- luronic acid 등의 결합 사슬 절단, 비정상적인 교차결합에 의한 주름 생성, 멜라닌 생성 촉진 등으로 노화를 가속화한 다(2,3).

천연 항산화제는 생체 내에서 노화를 억제하거나 동맥경 화증, 염증, 퇴행성 질환 암을 예방하는 데 매우 효과적인 것

으로 보고되어 있어 천연 식물체의 항산화 작용에 관한 연구 등이 많이 이루어지고 있다(4). 이러한 연구에 따르면 다양 한 식물에 함유된 페놀 화합물(phenolic compound)은 식물 의 광합성 과정에서 생성되어 활성산소로부터 자신을 보호 할 수 있는 효소와 이차 대사산물로서 free radical을 수용 할 수 있는 phenolic hydroxyl기를 여러 개 가지고 있는 물질로, 거대한 분자들과 결합하여 활성산소종을 제거하는 것으로 알려지고 있다(5-7).

플라보노이드(flavonoid)는 이러한 페놀화합물의 일종으 로 체내의 유해산소인 유리기의 활동을 억제하는 강력한 항 산화 작용, 항알레르기 작용, 항 모세혈관 투과작용, 항균작 용을 하는 것으로 알려져 있다. 그중 안토시아닌(anthocyanin)은 꽃이나 과피 등의 적색, 파랑, 보라색 등을 나타내는 식물들에 함유되어 있고(8), 세포의 재생촉진, 혈류 촉진작 용, 모세혈관의 보호, 피로회복, 망막과 동공의 작용을 좋게 하는 시력 보호 작용, 암세포의 증식 억제, 항염증 작용 등의 효과가 있다고 한다.

끄라차이담(Kaempferia parviflora)은 생강과(Zingibe- raceae)와 강황(turmeric)에 속하기도 하며 전 세계에 대략 60여 종이 있는 것으로 알려져 있다. 끄라차이담의 메탄올 추출물에서 분리한 플라보노이드 물질인 5,7,4’-trimeth- oxyflavone 및 5,7-dimethoxyflavone은 높은 cholines-

(2)

EtOH extract

n-Hexane fraction Aqueous layer

Dichloromethane fraction Aqueous layer

Ethyl acetate fraction Aqueous layer

n-Butanol fraction Water fraction

Water : n-Hexane (1:1)

Dichloromethane fraction

Ethyl acetate fraction

n-Butanol fraction

Fig. 1. Procedure for the fractionation of ethanol extract from Kaempferia parviflora powder by various solvent.

terase 저해 활성을 나타내어 알츠하이머성 치매의 치료제 로서의 가능성을 나타낸 바 있으며, 종래 부작용이 많았던 화학적 합성법에 따른 치료제보다 인체에 부작용 없이 안전 한 사용을 할 수 있다고 한다(9,10). 이외에도 끄라차이담은 위 점액 분비 조절 및 위산 분비 억제로 인한 위 보호 효과 (11), 항알레르기 효과(12), 부종 감소 효과(13) 등 다양한 생리 기능성이 보고된 바 있다. 그러나 끄라차이담에 대한 피부노화 감소 효과와 관련된 연구는 미비한 실정이며 국내 연구 또한 미비한 실정이다.

이에 본 연구는 끄라차이담을 에탄올로 추출하여 용매 분 획한 뒤, 이들 분획물의 항산화 활성과 화장품 소재로서의 가능성을 평가하여 끄라차이담의 산업적 이용 증대를 위한 기초자료를 제시하고자 한다.

재료 및 방법

용매 분획별 추출물의 제조

용매 분획별 추출물의 제조는 Fig. 1과 같이 나타내었다.

끄라차이담은 태국 현지에서 재배, 수확하여 세척하고 자연 상태에서 25일 동안 건조한 후 껍질을 제거하고 분쇄한 것을 얻어 사용하였다. 끄라차이담 분말 100 g에 30배량(w/v)의 95% ethanol(Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Pyeong- taek, Korea)을 가하여 48시간 동안 3회 추출한 다음, 추출 액을 여과지(Whatman No.4, Maidstone, UK)로 여과하였 다. 여액을 37~40°C의 수욕상에서 rotary vacuum evaporator(EYELA A-1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Ja- pan)를 사용하여 ethanol을 제거하고 감압･건조한 후 생성

된 ethanol 건조물을 separating funnel에 의한 용매별 분 획으로 동량의 증류수와 n-hexane(Samchun Pure Chem- ical Co., Ltd.), dichloromethane(Samchun Pure Chem- ical Co., Ltd.), ethyl acetate(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 및 n-butanol(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)로 3회씩 연속 추출하고 각 분획물을 rotary vacuum evaporator(EYELA A-1000S, Tokyo Rikakikai Co.)로 감압･건조하였다. 건조물은 100 mg/mL 농도의 stock으로 제조하여 4°C 이하의 온도로 냉장보관 하면서 실험 시료로 사용하였으며 stock 제조 시 건조물을 녹이는 데 사용한 유 기용매로써 n-hexane 및 ethyl acetate 분획 건조물은 di- methyl sulfoxide(DMSO, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에, ethanol, dichloromethane, n-butanol 및 water 분획 건조물은 methanol(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 용해하여 실험에 사용하였다.

총 페놀 및 총 플라보노이드 함량

페놀 화합물 함량은 페놀성 물질인 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 사용한 Folin- Denis 방법(14)을 사용하여 측정하였다. 0.5 mg/mL 농도의 시료액 50 μL와 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sig- ma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 50 μL를 섞어 3분간 실온에서 암반응 시킨 뒤, 10% sodium carbonate(Na₂CO₃, Duksan Pure Chemical Co., Ltd., Ansan, Korea) 용액 750 μL를 가하여 암실에서 1시간 동안 방치한 후 상등액의 흡광도를 765 nm에서 측정하였다. 이때 페놀성 화합물의 함량은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 사용 하여 표준 검량곡선을 작성한 후 대입하여 시료 1 g당 mg gallic acid로 산출하였다.

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(15)의 방법을 사용 하여 측정하였다. 시료 250 μL와 증류수 1 mL를 넣어 희석 한 다음, 5% sodium nitrite(NaNO2,Thermo Fisher Sci- entific Co., Ltd., Waltham, MA, USA) 75 μL를 넣어 5분간 방치하고 10% aluminium chloride(AlCl₃･6H₂O, Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 150 μL를 넣고 6분간 방치한 다음 1 M NaOH(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 500 μL를 가하여 11분 후 510 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 표준물질로 (+)catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 시료 1 g당 mg catechin hydrate로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois법(16)을 사용하여 평가하였다. 일정 농도로 제 조한 시료에 0.2 mM DPPH 용액을 1:1로 가하여 vortex mixing 하고 실온에서 30분간 암반응 시킨 후 분광광도계를 사용해 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의 한 흡광도 감소를 결정하였다. 이때 IC₅₀값(mg/mL)은 시료

(3)

대신 시료를 녹일 때 사용한 용매를 넣은 대조군의 값을 50

% 감소시키는 시료의 농도를 나타내었으며, ascorbic acid (Sigma-Aldrich Co.)를 양성대조구로 사용하여 비교하였 다. DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식에 의해 산출하였다.

DPPH scavenging

activity (%) ＝

(

^1－Absorbance of sample

)

^×100

Absorbance of control

ABTS 라디칼 소거 활성

2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) 라디칼 소거 활성의 측정은 Fellegrini 등(17)의 방 법에 따라 측정하였다. 7 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.) 와 140 mM K2S2O8(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)을 혼합하여 어두운 곳에 12~16시간 방치시킨 후, 이를 abso- lute ethanol(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)과 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 조절하여 ABTS solution을 제조하였다. 일정 농도로 제조 한 시료 50 μL에 ABTS solution 1 mL를 가한 다음 2.5분간 암반응 시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 IC50

값(mg/mL)은 시료 대신 시료를 녹일 때 사용한 용매를 넣은 대조군의 값을 50% 감소시키는 시료의 농도로 나타내었으 며, 기존의 항산화제인 ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.) 를 양성대조구로 사용하여 비교하였다. ABTS 라디칼 소거 능은 아래의 식에 의해 계산하였다.

ABTS scavenging

activity (%) ＝

(

^1－Absorbance of sample

)

^×100

Absorbance of control

FRAP(ferric-reducing antioxidant potential)

FRAP 측정 방법은 Benzie와 Strain(18)의 방법을 참고하 여 측정하였다. FRAP reagent는 acetate buffer(300 mM, pH 3.6)와 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2- pyridyl)-s-triazine(TPTZ), 20 mM FeCl₃･6H₂O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 섞고 37°C에서 10분간 반응시켜 제조하였다. 1 mg/mL의 농도로 녹인 시료 10 μL에 증류수 30 μL와 FRAP reagent 300 μL를 넣고 37°C의 incubation 에서 10분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 대조군은 0.1 mg/mL 농도로 제조한 ascorbic acid를 양성대조군으로 비교하였다. FRAP 활성은 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25 및 0.5 mM의 농도로 반복하여 작성한 FeSO4

의 검량식에 대입하여 환산하였다.

Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase 저해능은 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 dopachrome을 비색법을 사용하여 측정하였다(19). 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8)에 용해시킨 효소액 (mushroom tyrosinase, 100 unit/mL, Sigma-Aldrich Co.) 25 μL와 기질인 10 mM L-DOPA(dihydroxyphenylal-

anine) 50 μL, 0.1 M potassium phosphate buffer 125 μL 를 혼합한 후 시료 50 μL를 첨가하여 37°C의 incubation에 서 15분간 반응시킨 다음 475 nm에서 흡광도를 측정하였 다. Tyrosinase 저해능은 다음의 환산식에 의하여 계산하 였으며 tyrosinase 효소의 작용 저해 효과를 나타내는 대표 적인 물질인 kojic acid를 양성대조군으로 사용하여 비교하 였다.

Tyrosinase inhibition ability (%)＝

(

^1－ ^A－B_C

)

^×100

A: absorbance at 475 nm determined with sample B: absorbance at 475 nm determined with buffer

instead of enzyme

C: absorbance at 475 nm determined with buffer instead of sample

Elastase 저해 활성

Elastase 저해 활성 측정은 Kraunsoe 등(20)의 방법을 참고하여 측정하였다. 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0) buffer 350 μL에 n-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide 125 μL와 시료 20 μL를 첨가한 후 50 μL/mL elastase(pancreatic from porcine pancreas, PPE, 1.4 units/mg, Sigma-Aldrich Co.) 5 μL를 가하여 37°C의 incubation에서 20분 동안 반응시킨 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해 활성 은 다음의 환산식에 의하여 계산되었으며 노화된 피부를 개 선해주는 대표적인 물질인 ascorbic acid를 양성대조군으 로 사용하여 비교하였다.

Elastase inhibition ability (%)＝

(

^1－ ^A－B_C

)

^×100

A: absorbance at 410 nm determined with sample B: absorbance at 410 nm determined with buffer

instead of enzyme

C: absorbance at 410 nm determined with buffer instead of sample

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며, 얻어진 결과는 SPSS 22.0(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 분산분석을 실 시하였다. 유의성 검정은 다중검정범위(Duncan’s multiple range test)를 사용하였으며 유의수준은 P<0.05로 하였다.

결과 및 고찰

끄라차이담 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 추출 수율 산업적으로 천연물의 추출 수율 증가는 부가 가치적 측면 에서 매우 중요한 요소이다(21). 끄라차이담의 95% ethanol

(4)

Table 1. Yield of each fractions extracted from Kaempferia par- viflora

Solvent Yield (%, w/w) 95% Ethanol¹⁾ 32.46

Fractions of 95% ethanol extract²⁾ n-Hexane

Dichloromethane Ethyl acetate n-Butanol Water

2.20 3.57 0.13 0.37 4.63

1)Yield (%)＝(Weight of solid extract/ Weight of dry sample)×

2)100.Yield (%)＝(Weight of solid fraction/ Weight of 95% ethanol extract)×100.

Table 2. Total phenol and flavonoid contents of various solvent fractions from 95% ethanol extract of Kaempferia parviflora

(mg/g) Solvent Total phenol contents

(GAE mg/g¹⁾) Flavonoid contents (CE mg/g²⁾) 95% Ethanol

n-Hexane Dichloromethane Ethyl acetate n-Butanol Water

43.13±1.49^d3)4) 62.30±0.79^c 92.26±4.65^a 81.87±0.46^b 61.52±2.40^c 19.48±0.45^e

25.24±0.86^d 32.97±0.43^c 36.40±2.61^b 67.73±0.00^a 34.39±0.25^bc 15.66±0.25^e

1)GAE: gallic acid equivalent mg/g.

2)CE: catechin equivalent mg/g.

3)Value are mean±SD (n=3).

4)Values with different letters within the respective solvent ex- tract and fractions are significantly different at P<0.05 by Dun- can’s multiple range test.

추출물 및 용매 분획물의 추출 수율(dry basis, %)은 Table 1에 나타내었다. 95% ethanol 추출물의 수율이 32.46%로 추출물 중에서 가장 높은 수율을 보였으며, 이는 Kusirisin 등(22)의 연구에서 끄라차이담 뿌리의 95% ethanol 추출물 수율이 5.39%인 것에 비해 높았고 Kim 등(23)의 연구에서 생강의 80% ethanol 추출 수율이 4.59% 및 Lee 등(24)의 연구에서 생강 뿌리의 80% methanol 추출 수율이 2.3%라 고 보고한 것에 비해서도 높은 결과였다. Kwak과 Choi(25) 의 복숭아꽃의 ethanol 추출물과 분획물에 관한 연구에서 ethanol 추출물 수율이 34.7%인 것과는 유사한 결과를 나 타내었다. Ethanol 추출물에 대한 용매별 추출 수율은 water 분획물(4.63%)이 가장 높았고 다음으로 dichloromethane(3.57%), n-hexane(2.20%), n-butanol(0.37%), ethyl acetate(0.13%)의 순서로 높았으며 모두 95% ethanol 추출물의 수율에 비해 현저히 낮은 수치를 보였다. Lee 등 (24)의 연구에서 생강의 잎, 줄기, 뿌리의 80% methanol 추출물에 대해 hexane, chloroform, ethyl acetate 및 butanol 및 water 층으로 분획 및 농축하여 수율을 측정한 결 과에서도 분획물의 수율이 모두 10% 이하로 본 연구와 비슷 한 결과를 나타내었다. 이는 생강과 같은 황 함유 채소류가 80~90% 이상의 수분을 함유하고 있으며, 특히 생강은 섬유 질과 전분 함량이 높기 때문인 것으로 생각된다(23,24).

끄라차이담 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량

끄라차이담 용매 분획물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 Table 2에 나타내었다. 총 페놀 함량은 95% ethanol 분획물에서 43.13 GAE mg/g이었으며 dichloromethane 분획물에서 92.26 GAE mg/g으로 가장 높은 수치를 나타내 었다. 그다음으로 ethyl acetate(81.87 GAE mg/g), n- hexane(62.30 GAE mg/g), n-butanol(61.52 GAE mg/g), water(19.48 GAE mg/g) 분획물의 순서로 높은 페놀 함량 을 나타내었는데, 이때 n-hexane 분획물과 n-butanol 분획 물은 유의적인 차이가 없었다. Kusirisin 등(22)은 항산화능 이 뛰어난 태국 약초 5종의 95% ethanol 추출물에 대한 페

놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였으며 그중 끄라차이담 추출물의 페놀 함량은 100.15 GAE mg/g라고 보고하여 본 연구 결과보다 높은 수치를 보였으나, Choi 등(26)이 일부 국내 다류 제품을 열수로 추출하여 폴리페놀 함량을 측정한 결과 홍차는 101.51 mg/1 tea bag, 생강차는 28.30 mg/1 tea bag으로 나타나 끄라차이담이 비교적 많은 페놀 함량을 가진다고 생각된다. 또한, Shin 등(27)의 흑마늘 용매 분획 물에 관한 연구에서는 지방족 염화 탄화수소 물질로써 di- chloromethane과 비슷한 화학식 구조를 가진 chloroform 분획물이 가장 많은 총 페놀 화합물을 가지며 그다음으로 hexane, ethyl acetate, butanol 및 water 분획물의 순서로 페놀 함량이 높다고 보고하여 본 연구와 비슷한 결과를 나타 내었으므로 끄라차이담에 있는 페놀 화합물은 극성 물질보 다 비극성 물질이 더 많은 것으로 생각된다.

총 플라보노이드 함량은 95% ethanol 분획물에서 25.24 CE mg/g으로 나타났으며, n-hexane(32.97 CE mg/g), n- butanol(34.39 CE mg/g) 및 water 분획물의 순서로 총 페 놀 함량의 결과와 비슷한 경향을 보였다. 반면 ethyl acetate 분획물은 67.73 CE mg/g으로 나타나 분획물 중 가장 높은 수치를 보여 dichloromethane 분획물(36.40 CE mg/

g)에 비해 높았다. Kusirisin 등(22)의 연구에서 끄라차이담 95% ethanol 추출물의 플라보노이드 함량이 104.36 mg/g QE(quercetin equivalent)라고 보고하여 본 연구 결과보다 높았으나, Sutthanut 등(28)이 끄라차이담의 11가지 총 플 라보노이드 함량을 gas chromatography로 분석한 결과 23.9~61.0 mg/g으로 나타났다고 보고하여 본 연구와 비슷 하였다. 즉 페놀 함량은 dichloromethane 분획물이 여타 분획물에 비해 가장 높으나 페놀 화합물의 일종인 플라보노 이드의 함량을 비교한 경우에는 페놀 함량 대비 dichloromethane 분획물의 플라보노이드 함량이 약 39%이고 ethyl acetate 분획물의 플라보노이드 함량은 약 83%로 나타나 ethyl acetate 분획물의 페놀 화합물의 대부분이 플라보노 이드 성분인 것으로 판단된다. 이는 Azuma 등(29)이 HPLC

(5)

Table 3. DPPH radical scavenging activity and ABTS radical scavenging activity of various solvent fractions from 95% etha- nol extract of Kaempferia parviflora

Solvent DPPH radical scavenging activity

IC50 (mg/mL)¹⁾

ABTS radical scavenging activity

IC50 (mg/mL)²⁾ 95% Ethanol

0.48±0.30^de3)4) 3.62±0.39^b 1.62±0.06^c 0.38±0.01^e 0.79±0.03^d 9.16±0.20^a

3.17±0.08^b 2.73±0.05^c 2.05±0.01^d 0.41±0.01ê 0.57±0.07ê 13.24±0.59â

1)Amount required for 50% reduction of DPPH radical scavenging activity.

2)Amount required for 50% reduction of ABTS radical scavenging activity.

chromatography를 사용하여 dichloromethane 및 ethyl acetate 추출물의 플라보노이드를 정량한 결과 dichloromethane 추출물과 ethyl acetate 추출물의 주된 성분이 플 라보노이드의 일종인 7-methoxyflavone이며 dichloromethane 추출물에 비해 ethyl acetate 추출물에 함유된 플 라보노이드 함량이 더 많다고 보고한 결과와 유사하였다.

끄라차이담 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 라디칼 소 거 활성

끄라차이담 용매 분획물의 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디 칼 소거 활성을 측정한 결과는 Table 3과 같다. DPPH 라디 칼 소거 활성은 ethyl acetate 분획물이 가장 높았고, 다음 으로 95% ethanol, n-butanol, dichloromethane, n-hexane, water 분획물의 순으로 높았다. 이때 각각의 IC₅₀값은 0.38 mg/mL, 0.48 mg/mL, 0.79 mg/mL, 1.62 mg/mL, 3.62 mg/mL, 9.16 mg/mL였으며 ethyl acetate, 95% ethanol, n-butanol 분획물에서는 유의적인 차이가 없었다. 이 순서 는 Park 등(30)의 울금 추출물의 분획물에 관한 연구 결과 와 일치하였으며, Kim 등(23)의 연구에서 황 함유 채소류 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성의 IC₅₀ 값이 마늘 75.38 mg/mL, 양파 28.04 mg/mL, 파 32.08 mg/mL, 생강 1.57 mg/mL, 무 31.59 mg/mL, 부추 7.82 mg/mL로 나타난 것 과 비교하면 끄라차이담의 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활 성은 매우 우수한 것으로 생각된다. 또한, Jeong 등(31)의 열풍건조 삼채 분획물의 항산화 활성에 관한 연구에서 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가한 결과 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid의 IC₅₀ 값이 약 10 μg/mL였으며 각 용매 분 획물의 IC50 값은 0.06~9.27 mg/mL로 나타나 비교적 높은 라디칼 소거 활성이 있다고 하였으므로 본 실험 결과에서도 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid의 IC50 값인 13.08 μg/mL와 비교하였을 때 끄라차이담의 각 분획물은 비교적

높은 DPPH 라디칼 소거 활성이 있는 것으로 여겨진다.

ABTS 라디칼 소거 활성 또한 ethyl acetate 분획물에서 가장 높았고, 이어서 n-butanol, dichloromethane, n-hexane, 95% ethanol, water 분획물의 순으로 높았다. 각 분획 물의 IC50 값은 0.41 mg/mL, 0.57 mg/mL, 2.05 mg/mL, 2.73 mg/mL, 3.17 mg/mL, 13.24 mg/mL로 나타났으며 ethyl acetate와 n-butanol 분획물에서는 유의적인 차이가 없었다. 본 실험에서 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid 의 ABTS 라디칼 소거 활성의 IC50 값은 60.72 μg/mL로 이 와 비교하였을 때 ethyl acetate 및 n-butanol 분획물은 매 우 높은 활성이 있는 것으로 생각된다. Jeong 등(31)의 연구 에서도 열풍건조 삼채의 잎과 뿌리 분획물 중에서 ABTS 라디칼 소거 활성의 IC₅₀값이 ethyl acetate 분획물에서 가장 낮아 가장 높은 ABTS 라디칼 활성을 나타내었고 water 분획물이 가장 낮은 활성을 보였다고 보고하여 본 연구 와 유사한 결과를 나타내었다.

DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성의 결과를 종합 하면 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성 모두 ethyl acetate 분획물에서 가장 높은 활성을 나타내었으며 water 분획물이 가장 낮은 활성을 나타내었다. 이는 Kim 등(32)의 곤달비 잎 분획물에 관한 연구와 일치하는 결과이며 라디칼 소거 활성을 증가시키는 항산화 성분으로서 높은 플라보노 이드 함량이 영향을 미친 것으로 생각된다. 이러한 각 분획 별 DPPH 라디칼 소거 활성과 ABTS 라디칼 소거 활성은 다소 다른 경향을 보였는데 이는 DPPH 라디칼 소거 활성이 ABTS 라디칼 소거 활성과 상관관계가 높으나 DPPH는 free radical이고 ABTS는 cation radical이라는 점에서 차이가 있으며(33), DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼은 기질로서 결 합하는 반응물인 페놀물질의 종류가 상이하여 라디칼의 제 거능력에서도 차이가 있기 때문인 것으로 여겨진다(34).

끄라차이담 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 FRAP value 끄라차이담 추출물의 분획별 FRAP의 결과는 Table 4에 나타내었다. FRAP value는 ethyl acetate 분획물이 0.74 mM로 가장 높은 값을 나타내었으며, 그다음으로 n-butanol(0.41 mM), n-hexane(0.37 mM), 95% ethanol(0.31 mM), dichloromethane(0.27 mM), water(0.22 mM) 분획 물의 순서로 높았고 모든 분획물에 대해 유의적인 차이가 존재하였다. 분획물 중 가장 높은 활성을 나타낸 ethyl acetate 분획물은 Kim 등(23)의 황 함유 채소 추출물에 대한 연구에서 마늘(0.06 mM), 양파(0.25 mM), 파(0.30 mM), 생강(2.84 mM), 무(0.14 mM), 부추(1.65 mM)의 활성과 비교하였을 때 생강의 FRAP 활성보다는 낮았지만 비교적 높은 FRAP 활성을 보였으며 실험 시 양성대조군으로 사용 한 ascorbic acid(1.15 mM, 0.1 mg/mL)에 비해서도 낮은 활성을 나타내었으나 단일 물질이 아닌 것을 감안하면 비교 적 높은 활성을 가진 것으로 확인되었다.

(6)

Table 4. Ferric reducing antioxidant potential (FRAP) on the Kaempferia parviflora 95% ethanol extract by solvent fractiona- tion

Solvent FeSO4･7H2O (mM) (1 mg/mL)¹⁾ 95% Ethanol

0.31±0.01^d2)3) 0.37±0.01^c 0.27±0.01^e 0.74±0.02^a 0.41±0.01^b 0.22±0.01^f

1)Sample concentration (solvent fractions from 95% ethanol ex- tract of Kaempferia parviflora).

Table 5. Tyrosinase inhibition activity of various solvent frac- tions from 95% ethanol extract of Kaempferia parviflora

Solvent Tyrosinase inhibition activity (%) (1 mg/mL)¹⁾

95% Ethanol n-Hexane Dichloromethane Ethyl acetate n-Butanol Water

79.68±0.45^a2)3) 52.89±0.41^d 72.65±3.47^bc 53.93±0.92^d 70.40±2.24^c 74.59±2.10^b

Table 6. Elastase inhibition activity of various solvent fractions from 95% ethanol extract of Kaempferia parviflora

Solvent Elastase inhibition activity (%) (1 mg/mL)¹⁾

95% Ethanol n-Hexane Dichloromethane Ethyl acetate n-Butanol Water

19.40±0.54^c2)3) 28.21±1.97^b 38.60±1.92â 29.78±2.80^b 34.62±3.65â 36.85±2.36â

끄라차이담 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase는 멜라닌 생합성 과정의 key enzyme으로 melanocyte 내의 melanosome에서 연속적인 산화반응을 일으켜 멜라닌을 생성하는 것으로 알려져 있다(35). 따라서 tyrosinase 효소 활성을 저해하거나 중간체들의 산화반응 이 저해됨으로써 멜라닌 색소가 감소한다(36). 끄라차이담 분획물의 tyrosinase 저해 활성은 Table 5와 같다. 양성대 조군인 kojic acid는 0.5 mg/mL의 농도에서 약 90.72%로 높은 저해율을 보였고 끄라차이담의 95% ethanol 추출물은 79.68%로 분획물 중 가장 높은 저해 활성을 나타내었다.

이는 Ninomiya 등(37)의 연구에서 끄라차이담의 methanol 추출물이 멜라닌의 생성을 억제한다고 보고한 것과 An 등 (38)이 1 mg/mL의 농도에서 울금 ethanol 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 82.0%라고 보고한 결과와 유사하였 다. Jo 등(39)은 만형자의 acetone 추출물이 acetone 추출 물에 대한 분획물보다 효과적인 항암효과를 나타낸다고 하 였고, Han 등(40)은 포도씨의 methanol 추출물이 같은 농 도의 분획물보다 더 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내며 그 이유는 tyrosinase 활성을 측정하는 경우 유기용매를 사

용하여 극성별 유용성분을 추출한 추출물보다 극성, 비극성 물질의 유용성분들이 모두 추출되어 나온 methanol 추출물 이 crude extract로서 상호 간의 상승효과를 나타내기 때문 이라고 보고하였다.

끄라차이담 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 elastase 저 해 활성

세포외기질의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유 아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하고 피부의 기계적 견고성, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도, 결합 조직의 저항력과 조직의 결합력 등의 다양한 기능을 가지고 있다. 이러한 collagen은 피부의 주름 형성과 관련이 있어 collagen이 부족할 경우 주름이 유발된다(41). 끄라차이담 분획물의 elastase 저해 활성은 Table 6과 같다. 양성대조 군인 ascorbic acid는 0.1 mg/mL의 농도에서 71.45%의 저해율을 나타내었다. 끄라차이담의 용매 분획물 중에서는 dichloromethane(38.60%), water(36.85%) 및 n-butanol(34.62%) 분획물이 유의적으로 가장 높은 elastase 저 해 활성을 나타내었으며 95% ethanol 추출물은 19.40%로 가장 낮은 저해율을 보였다. Park과 Kim(42), Jung과 Kim (43)의 연구에 따르면 1 mg/mL 농도에서 끄라차이담 분획 추출물의 elastase 활성 저해능은 오배자(52.42%)보다는 낮으나 황기(3.73%), 자초(8.73%), 지실(15.59%)보다는 높은 활성을 나타내었다.

요 약

본 연구에서는 끄라차이담의 ethanol 추출물과 그에 대한 순 차적 분획물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량, 항산화 활성, tyrosinase 저해 활성과 elastase 저해 활성을 측정하여 끄 라차이담의 항산화 활성과 화장품 원료 소재로서의 가능성 을 확인하고자 하였다. 분획별 추출 수율은 ethanol 추출물 이 32.46%로 가장 높았으며 나머지 분획물에서는 10% 이

(7)

하의 수율을 보였다. 총 페놀 함량 측정 결과 19.48~92.26 GAE mg/g을 나타내었고 dichloromethane 분획물의 페놀 함량이 가장 높았으며, 플라보노이드 함량 측정 결과 15.66

~67.73 CE mg/g을 나타내었고 ethyl acetate 분획물이 가 장 높은 함량을 가진 것으로 관찰되었다. 항산화 측정 결과 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, FRAP 활성이 모두 ethyl acetate 분획물에서 가장 높았으며 water 분획 물에서 가장 낮은 것으로 확인되었다. 미백 효과를 나타내는 tyrosinase 저해 활성 측정 결과 끄라차이담 분획 추출물은 1 mg/mL 농도에서 52.89~79.68%의 활성을 보였으며 ethanol 추출물이 가장 높은 수치를 보였다. 주름 개선 효과 를 알 수 있는 elastase 저해능 측정 결과 1 mg/mL 농도에 서 dichloromethane 분획물이 38.60%, water 분획물이 36.85%, n-butanol 분획물이 34.62%로 유의적으로 높았 다. 이상의 연구 결과로 끄라차이담의 ethanol 추출물 및 그에 대한 용매 분획물은 우수한 항산화 활성을 가지고 있으 며 이에 플라보노이드 함량이 영향을 미치는 것으로 생각된 다. 또한, 끄라차이담은 tyrosinase 및 elastase 저해 효과 가 있어 건강기능식품 및 미백, 주름개선 화장품의 관련 제 품으로서 개발 가능성이 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구는 충남대학교 자체연구과제(과제번호 2017-1752- 01)를 통해 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.

REFERENCES

1. Lemberkovics E, Czinner E, Szentmihalyi K, Balazs A, Szoke E. 2002. Comparative evaluation of Helichrysi flos herbal extracts as dietary source of plant polyphenols, and macro- and microelements. Food Chem 78: 119-127.

2. Papa S, Skulachev VP. 1997. Reactive oxygen species, mi- tochondria, apoptosis and aging. Mol Cell Biochem 174:

305-319.

3. Fantone JC, Ward PA. 1982. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocyte-dependent inflamma- tory reactions. Am J Pathol 107: 395-418.

4. Jeon SM, Lee JY, Kim HW, Lee YM, Jang HH, Hwang KA, Kim HR, Park DS. 2012. Antioxidant activity of extracts and fractions from Aster scaber. J Korean Soc Food Sci Nutr 41: 1197-1204.

5. Shin SR, Hong JY, Nam HS, Yoon KY, Kim KS. 2006.

Anti-oxidative effects of extracts of Korean herbal materials.

J Korean Soc Food Sci Nutr 35: 187-191.

6. Jeon YH, Kil JH, Lim SM, Kim MH, Kim MR. 2008. Anal- ysis of antioxidative activity and antimutagenic effect of ethanol extract from Schizandra chinensis Baillon. J East Asian Soc Diet Life 18: 746-752.

7. Kwon TH, Kim JK, Kim TW, Lee JW, Kim JT, Seo HJ, Kim MJ, Kim CG, Jeon DS, Park NH. 2011. Antioxidant and anti-lipase activity in Halocynthia roretzi extracts. Ko- rean J Food Sci Technol 43: 464-468.

8. Matsubara K, Kaneyuki T, Miyake T, Mori M. 2005. Anti- angiogenic activity of nasunin, an antioxidant anthocyanin,

in eggplant peels. Food Chem 53: 6272-6275.

9. Seo SH. 2015. Isolation and identification of biological ac- tivity components from Kaempferia parviflora Wall. Ex.

Baker. MS Thesis. Dong-A University, Busan, Korea. p 30.

10. Sawasdee P, Sabphon C, Sitthiwongwanit D, Kokpol U.

2009. Anticholinesterase activity of 7-methoxyflavones iso- lated from Kaempferia parviflora. Phytother Res 23: 1792- 1794.

11. Rujjanawate C, Kanjanapothi D, Amornlerdpison D, Pojana- garoon S. 2005. Anti-gastric ulcer effect of Kaempferia par- viflora. J Ethnopharmacol 102: 120-122.

12. Tewtrakul S, Subhadhirasakul S, Kummee S. 2008. Anti-al- lergic activity of compounds from Kaempferia parviflora.

J Ethnopharmacol 116: 191-193.

13. Sae-wong C, Tansakul P, Tewtrakul S. 2009. Anti-inflam- matory mechanism of Kaempferia parviflora in murine mac- rophage cells (RAW 264.7) and in experimental animals.

J Ethnopharmacol 124: 576-580.

14. Folin O, Denis W. 1912. On phosphotungstic-phosphomo- lybdic compounds as color reagents. J Biol Chem 12: 239- 243.

15. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. 1999. The determi- nation of flavonoid contents in mulberry and their scaveng- ing effects on superoxide radicals. Food Chem 64: 555-559.

16. Blois MS. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200.

17. Fellegrini N, Ke R, Yang M, Rice-Evans C. 1999. Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2,2’-azinobis(3-ethyleneben- zothiazoline-6-sulfonic acid radical cation decolorization as- say. Methods Enzymol 299: 379-389.

18. Benzie IF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plas- ma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem 239: 70-76.

19. Flurke WH. 1991. Identification of tyrosinase in mushrooms by isoelectric focusing. J Food Sci 56: 93-95.

20. Kraunsoe JAE, Claridge TDW, Lowe G. 1996. Inhibition of human leukocyte and porcine pancreatic elastase by he- mologues of bovine pancreatic tyrosinase inhibitors. Bio- chem 35: 9090-9096.

21. Kim DM, Kim KH, Sung NY, Jung PM, Kim JS, Kim JK, Kim JH, Choi JI, Song BS, Lee JW, Kim JK, Yook HS.

2011. Effects of gamma irradiation on the extraction yield and whitening activity of polysaccharides from Undaria pinnatifida sporophyll. J Korean Soc Food Sci Nutr 40: 712- 716.

22. Kusirisin W, Srichairatanakool S, Lerttrakarnnon P, Lailerd N, Suttajit M, Jaikang C, Chaiyasut C. 2009. Antioxidative activity, polyphenolic content and anti-glycation effect of some Thai medicinal plants traditionally used in diabetic patients. Med Chem 5: 139-147.

23. Kim KH, Kim HJ, Byun MW, Yook HS. 2012. Antioxidant and antimicrobial activities of ethanol extract from six vege- tables containing different sulfur compounds. J Korean Soc Food Sci Nutr 41: 577-583.

24. Lee HR, Lee JH, Park CS, Ra KR, Ha JS, Cha MH, Kim SN, Choi Y, Hwang J, Nam JS. 2014. Physicochemical pro- perties and antioxidant capacities of different parts of ginger (Zingiber officinale Roscoe). J Korean Soc Food Sci Nutr 43: 1369-1379.

25. Kwak CS, Choi HI. 2015. In vitro antioxidant and anti-in- flammatory activities of ethanol extract and sequential frac- tions of flowers of Prunus persica in LPS-stimulated raw 264.7 macrophages. J Korean Soc Food Sci Nutr 44: 1439-

(8)

1449.

26. Choi Y, Kim M, Shin JJ, Park JM, Lee J. 2003. The anti- oxidant activities of the some commercial teas. J Korean Soc Food Sci Nutr 32: 723-727.

27. Shin JH, Lee HG, Kang MJ, Lee SJ, Sung NJ. 2010. Antiox- idant activity of solvent fraction from black garlic. J Korean Soc Food Sci Nutr 39: 933-940.

28. Sutthanut K, Sripanidkulchai B, Yenjai C, Jay M. 2007.

Simultaneous identification and quantitation of 11 flavonoid constituents in Kaempferia parviflora by gas chromatog- raphy. J Chromatogr A 1143: 227-233.

29. Azuma T, Kayano S, Matsumura Y, Konishi Y, Tanaka Y, Kikuzaki H. 2011. Antimutagenic and α-glucosidase inhibi- tory effects of constituents from Kaempferia parviflora. Food Chem 125: 471-475.

30. Park EY, Hur SJ, Kim KY, Whang WK, Yang KS. 2010.

Anti-oxidant and whitening effects of Curcuma longa L..

Korean Journal of Aesthetic Society 8: 111-120.

31. Jeong SJ, Kim KH, Yook HS. 2015. Whitening and antioxidant activities of solvent extracts from hot-air dried Allium hookeri. J Korean Soc Food Sci Nutr 44: 832-839.

32. Kim KH, Kim NY, Kim SH, Han IA, Yook HS. 2012. Study on antioxidant effects of fractional extracts from Ligularia stenocephala leaves. J Korean Soc Food Sci Nutr 41: 1220- 1225.

33. Wang M, Li J, Rangarajan M, Shao Y, LaVoie EJ, Huang TC, Ho CT. 1998. Antioxidative phenolic compounds from sage (Salvia officinalis). J Agric Food Chem 46: 4869-4873.

34. Lee SO, Kim MJ, Kim DG, Choi HJ. 2005. Antioxidative activities of temperature-stepwise water extracts from Inon- otus obliquus. J Korean Soc Food Sci Nutr 34: 139-147.

35. Wang KH, Lin RD, Hsu FL, Huang YH, Chang HC, Huang CY, Lee MH. 2006. Cosmetic applications of selected tradi-

tional Chinese herbal medicines. J Ethnopharmacol 106: 353- 359.

36. Shin JY. 2001. Screening of natural products that have ac- tivities against skin-aging. Korean J Food Nutr 14: 568-572.

37. Ninomiya K, Matsumoto T, Chaipech S, Miyake S, Kat- suyama Y, Tsuboyama A, Pongpiriyadacha Y, Hayakawa T, Muraoka O, Morikawa T. 2016. Simultaneous quantita- tive analysis of 12 methoxyflavones with melanogenesis in- hibitory activity from the rhizomes of Kaempferia parvi- flora. J Nat Med 70: 179-189.

38. An BJ, Lee JY, Park TS, Pyeon JR, Bae HJ, Song MA, Baek EJ, Park JM, Son HJ, Lee CE, Choi KI. 2006. Antioxidant activity and whitening effect of extraction conditions in Curcuma longa L.. Korean J Med Crop Sci 14: 168-172.

39. Jo K, Yoon M, Lee M, Cha M, Park H. 2007. The anticancer effect of extracts form Vitex rotundifolia on human colon carcinoma cell lines. J Korean Soc Appl Biol Chem 50: 228- 232.

40. Han J, Sung J, Kim DJ, Jeong HS, Lee J. 2008. Inhibitory effect of methanol extract and its fractions from grape seeds on mushroom tyrosinase. J Korean Soc Food Sci Nutr 37:

1679-1683.

41. Kang KS, Kim ID, Kwon RH, Heo YY, Oh SH, Kim MA, Jung HJ, Kang HY, Ha BJ. 2007. The evaluation of anti- wrinkle effects in oriental herb extract. J Life Sci 17: 1147- 1151.

42. Park JM, Kim KJ. 2010. The anti-wrinkle effects and whiten- ing effects of Galla Rhois. J Korean Orient Med Ophthalmol Otolaryngol Dermato 23: 135-148.

43. Jung JH, Kim KJ. 2009. Experimental studies about the inhibitory effect on tyrosinase and elastase activities by vari- ous herb medicines. J Korean Orient Med Ophthalmol Otol- aryngol Dermato 22: 82-91.