고압 및 한외여과 처리가 발아 검정콩의 생리활성에 미치는 영향 김민영

고압 및 한외여과 처리가 발아 검정콩의 생리활성에 미치는 영향

김민영¹․이윤정¹․송명섭¹․오현아¹․장귀영²․김경미³․이준수¹․정헌상¹

1충북대학교 식품생명공학과

2농촌진흥청 국립원예특작과학원

3농촌진흥청 국립농업과학원

Effects of High Hydrostatic Pressure and Ultrafiltration Treatment on Physiological Activities of Germinated Black Soybeans

Min Young Kim

, Yoon Jeong Lee

, Myeong Seob Song

, Hyunah Oh

, Gwi Yeong Jang

, Kyung Mi Kim

, Junsoo Lee

, and Heon Sang Jeong

1

Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University

2

National Institute of Horticultural and Herbal Science and

3

National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration

ABSTRACT This study was performed to investigate the effects of high hydrostatic pressure (HHP) treatment and ultrafiltration on the antioxidant and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activities of protein extracts in germinated black soybeans. Black soybeans were germinated and subjected to HHP, followed by preparation of extracts and fractions with molecular weight. The highest 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) (3.58 mg ascorbic acid equivalents (AAE)/g) and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (2.02 mg Trolox equivalents (TE) /g) radical scavenging activities and ACE inhibitory activities (51.35%) of protein extracts were observed at 150 MPa treatment after germination for 4 days. ABTS and DPPH radical scavenging activities of fractions were higher in PM2 (MW 3∼<10 kDa) with 6.52 mg AAE/g and 2.95 mg TE/g as compared to protein extracts. The strong ACE inhibitory effect (74.37%) of the fraction was observed at PM2 fraction at a concentration of 2 mg/mL. These results suggest that low molecular peptides derived from black soybeans subjected to HHP after germination may mediate physiological activity.

Key words: black soybean, protein extract, germination, high hydrostatic pressure treatment, ultrafiltration

Received 5 June 2018; Accepted 10 July 2018

Corresponding author: Heon Sang Jeong, Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-43-261-2570

서 론

검정콩[

Glycine max

으로 알려졌다(6,7).

콩을 비롯한 종자는 씨눈과 배젖에 있는 각종 효소 및 영 양소 등이 외적 환경 여건이 좋아지면 활성화되어 발아되는 데, 일반적으로 발아가 진행됨에 따라 다양한 성분들이 증가 하고 그에 따라 생리활성이 증가하는 경향이 있는 것으로 알려져 있다(8). 따라서 조, 기장(9), 메밀(10), 들깨(11), 대 두(12) 등으로 다양한 종자에 대한 발아에 따른 유용성분 및 생리활성의 변화에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

고압처리기술은 구조적으로 유연한 식물체 내의 세포 변형, 세포막 손상, 단백질 변성과 같은 변화를 발생시키기 때문에 화학성분 및 유용성분의 용출성 및 용해성을 향상시킬 수 있으며(13,14), 100 MPa 이하의 압력에서는 기질의 변성, 효소구조의 안정화 및 효소와 기질의 결합력 향상 등에 따라 효소반응속도가 달라지므로 고압처리에 의한 가수분해효율 을 증가시키려는 연구가 다양하게 진행되고 있다(15).

이와 같이 발아를 통해 다양한 종자의 유용성분 및 생리활 성을 증대시키는 연구와 가수분해효소의 활성을 증가시키 기 위하여 고압처리공정이 이용되고 있지만, 검정콩 단백질

로부터 저분자의 기능성 펩타이드를 생성하기 위한 발아 및 고압의 병행처리기술의 적용에 대한 연구는 미흡한 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 검정콩을 발아시킨 후 0.1~150 MPa의 압력하에서 24시간 동안 고압처리를 실시하여 발아 일수와 처리 압력에 따른 수용성 단백질 추출물의 항산화 및 ACE 저해활성을 확인하고, ultrafiltration을 이용하여 제조한 분자량에 따른 단백질 분획이 생리활성에 미치는 영 향을 검토하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 발아

본 실험에 사용된 청자 3호는 2015년도에 생산된 콩을 농촌진흥청(Jeonju, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 발 아는 López 등(16)의 방법에 따라 콩을 20°C의 증류수로 수세하고 5배의 증류수를 가수하여 24시간 동안 침지시킨 다음 발아기(WGC 450, Dahan Inc., Seoul, Korea)로 발아 시켰다. 발아온도는 25°C, 습도는 90%를 유지하면서 발아 시켰고, 1일 3회씩 10분간 물주기를 하면서 발아시켰다. 발 아기간은 2, 4, 6일로 하였고, 발아시키지 않은 콩을 대조구 로 하였다. 콩 및 발아 콩은 동결건조기(Freeze dryer, FD 5508, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 건 조시킨 다음 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다.

고압처리

가압은 정수압 압력처리 시스템(WIP-L60-50-200, Ilshin Autoclave Co., Daejeon, Korea)을 이용하였으며, 압력용 기 내부의 온도는 발아조건과 동일한 37°C에서 유지되도록 하였다. 0, 2 및 4일간 발아시킨 팥을 수분과 산소투과성이 적은 알루미늄 호일필름(Newpack, Seoul, Korea)에 10 g 단위로 진공포장한 후 0.1, 50, 100 및 150 MPa의 압력 하에서 24시간 동안 처리하였으며, 압력처리는 효소가 불활 성화되지 않도록 발아팥 시료 제작 직후에 실시하였다. 발아 팥 및 고압처리를 실시한 팥은 동결건조 하고 냉동 보관하여 시료로 사용하였다.

수용성 단백질 추출물 제조

검정콩의 수용성 단백질 추출물은 Vernaza 등(17)의 방 법을 변형하여 제조하였다. 수용성 단백질을 추출하기 전에 처리조건별 시료는 hammer mill을 사용하여 100 mesh로 분쇄하였으며, 25°C의 shaking incubator(JSSB 30-T, JSR, Seoul, Korea)에서 1시간 동안 hexane을 이용하여 3회 진 탕 탈지하여 시료로서 사용하였다. 10 g의 탈지시료에 100 mL의 증류수를 가하고 0.1 N NaOH를 첨가하여 pH를 8로 조정한 뒤 균질기를 이용하여 10분간 균질하였으며, 상온에 서 3시간 동안 수용성 단백질을 진탕추출 하였다. 추출물은 3,000×

g

에서 냉동 보관하면서 생리활성 측정용 시료로 사용하였다.

Ultrafiltration(MWCO) 분획 제조

고압처리 발아콩의 수용성 단백질 추출물은 3, 10 및 30 kDa의 ultrafiltration membrane(Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 분자량에 따라 분리하여 분획물을 제조하 였다. 즉 10 mg/mL 농도의 수용성 단백질 추출물을 30 kDa 의 MWCO membrane 필터를 사용하여 3,000×

g

<10 kDa), PM3(10~<30 kDa), PM4(≥30 kDa)의 분획물 은 동결건조(Freeze dryer, FD5508, Ilshin Lab Co., Ltd.) 하고 -20°C에서 냉동 보관하면서 생리활성 측정용 시료로 사용하였다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능은 ABTS cation decolorization assay 방법(18)에 의하여 측정하였다. 7.4 mM 2,2’-azino- bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS; Sig- ma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 2.6 mM potas- sium persulfate를 하루 동안 암소에서 방치하여 ABTS 양 이온을 형성시킨 후 이용액을 735 nm에서 흡광도 값이 1.4 가 되도록 물 흡광계수(ε＝3.6×10⁴ M^-1cm^-1)를 이용하여 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 1 mL에 추출액 50 μL를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 60분 후에 측정하 였으며, 표준물질로서 L-ascorbic acid(AA, Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. 시료첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이 를 mg ascorbic acid equivalents(AAE)/g으로 표현하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Hwang 등(19)의 방법을 변형하 여 측정하였다. 즉 에탄올 추출물 0.2 mL에 0.2 mM 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH; Sigma-Aldrich Co.) 용액 0.8 mL를 가하여 실온에서 60분간 방치한 후 520 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료첨가구와 비 첨가구의 흡광도 차이를 mg Trolox equivalents(TE)/g으 로 표현하였다.

ACE 저해활성 측정

각각의 추출물에 대한 ACE 저해활성은 Kwon 등(20)의 방법을 변형하여 측정하였다. ACE 저해활성 측정에 사용된 5 mM HHL(Hippuryl-His-Leu) 기질은 0.3 M NaCl이 함유 된 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 8.3)에 용해하 였으며, 0.2 mU ACE 정제효소는 0.1 M potassium phos- phate buffer(pH 7.0)로 용해하여 사용하였다. 추출물 100 μL에 0.2 mU ACE 정제효소액 80 μL와 5 mM HHL 기질 100 μL를 가한 뒤 37°C에서 60분간 방치하였다. 반응을 정지시키기 위하여 1 M HCl 250 μL를 가한 다음 0.45 μm

Ac Cc Bc

Dc Ec

Ab Ca Bb

Eb Db

Aa Ba

Cb Ea Da

0 1 2 3 4 5

Con 0.1MPa 50MPa 100MPa 150MPa

Pressure ABTS radical scavenging activity . (mg AAE/g) .

Day0 Day2 Day4

A

ABc Ac Bc

Cb Db

Ab Bb

Cb Da

Eab

Aa ABa

Ba Da Ca

0 1 2 3

Con 0.1MPa 50MPa 100MPa 150MPa

Pressure DPPH radical scavenging activity . (mg TE/g) .

Day0 Day2 Day4

B

Fig. 1. Effect of soluble protein extracts of black soybean treated by different high hydrostatic pressure treatments (0.1∼150 MPa)

syringe filters로 여과하였으며, HPLC(ACME 9000 sys- tem, Younglin, Anyang, Korea)로 분석하여 ACE 저해율 (%)을 계산하였다. 칼럼은 C-18 column(Mightysil RP-18 GP column, 4.6×250 mm, Kanto Chemical, Tokyo, Ja- pan), mobile phase는 A를 10 mM phosphoric acid(pH 2.5), B를 methanol로 사용하여 A:B의 초기비율을 100:0 으로 시작하여 12분에 40:60, 19분에 0:100, 25분에 100:0 의 비율로 단계적인 gradient system을 사용하였다. Flow rate는 1.0 mL/min의 유속으로 흘려주었고, injection vol- ume은 20 μL, detector는 UV-detector(228 nm)를 사용 하였다.

통계분석

통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고 처리조건 간의 차이 유무를 one-way ANOVA(analysis of variance)로 분석한 후 신뢰구간

P

결과 및 고찰

항산화 활성

발아기간 및 처리 압력에 따른 검정콩 단백질 추출물의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능 변화를 축정한 결과는 Fig.

1과 같이 유의적인 차이를 나타내었다. 고압처리를 하지 않 은 대조구는 발아 전 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능이 각각 0.85 mg AAE/g 및 0.64 mg TE/g이었지만, 발아 4일 차에 는 각각 1.44 mg AAE/g 및 0.81 mg TE/g으로 증가하여 발아 4일 차에서 가장 높게 나타났다. 이는 발아기간이 증가 함에 따라 발아 72시간까지 콩 단백질의 항산화 활성이 증 가한다는 Vernaza 등(17)의 연구와 침지 및 발아에 의해 lunasin과 같은 기능성 펩타이드가 증가함에 따라 BRS 133

품종의 항산화 활성이 증가한다는 Paucar-Menacho 등(21) 의 연구와 유사하였다. 또한, 4일 차 발아콩의 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능에 미치는 고압처리의 효과 는 처리 압력에 따라 다양하게 나타났다. 즉 처리 압력이 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거 능은 각각 1.44~3.58 mg AAE/g 및 0.81~2.02 mg TE/g 의 범위로 150 MPa까지 지속해서 증가하는 경향을 나타내 었다. 일반적으로 단백질 추출물의 항산화 활성은 분자량이 낮은 아미노산 사슬로 구성된 기능성 펩타이드에 영향을 받 는 것으로 알려져 있다(22). 또한, 검정콩의 단백질 특성 및 항염 활성에 미치는 고압처리의 효과에 대한 Kim 등(23)의 연구에서 발아기간 및 처리 압력이 증가함에 따라 150 MPa 까지 단백질 추출수율, 수용성 단백질 함량, 저분자 펩타이 드 함량 및 유리아미노산이 증가한다는 연구 결과로 미루어 볼 때 본 연구에서 항산화 활성이 증가한 것은 발아기간 및 처리 압력이 증가함에 따라 항산화 활성을 나타내는 수용성 단백질, 저분자 펩타이드 함량이 증가함에 따른 결과로 판단 된다.

ACE 저해활성

발아와 고압처리에 따른 검정콩의 ACE 저해활성을 측정 한 결과는 Fig. 2와 같이 모든 처리구에서 추출물 농도 의존 적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 고압처리를 하지 않은 대조구의 ACE 저해활성은 발아에 의해 2일차에 증가하였 지만, 발아 전 39.37%에서 발아 후 42.35%로 증가폭이 크 지 않았다. 하지만 발아 콩의 ACE 저해활성에 미치는 고압 처리의 효과는 150 MPa의 압력에서 처리 시 유의적으로 증가하였다. 즉 고압처리를 하지 않은 대조구는 2 mg/mL의 농도에서 39.37~42.35% 범위의 효소 저해활성을 나타내 었지만, 고압처리 시 150 MPa 처리에서 50.78~51.35%로 증가하였다. ACE는 불활성형의 angiotensin-Ⅰ(decapep- tide)의 C말단에 존재하는 His-Leu를 절단하여 혈관벽 수 축작용을 하는 angiotensin-Ⅱ(octapeptide)를 생성하고

Ac ABc Ac

Bc Cc CDc

Ab Bb Cb EFb Db

Eb

Aa Aa Ca ABa

Da Ca

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Con-day0 Con-day2 Con-day4 150Mpa- Day0

150Mpa- Day2

150Mpa- Day4 Pressure-Germination period

ACE inhibitory activity (%) .

2mg/mL 5mg/mL 10mg/mL

150MPa- 150MPa- 150MPa- Day0 Day2 Day4

Fig. 2. Effect of soluble protein extracts of black soybean treated

Table 1. Yield of fraction (PM1∼PM4) isolated by ultrafiltra-

Sample Molecular weight Yield (%) of MWCO fraction PM1

PM2 PM3 PM4

<3 kDa 3∼<10 kDa 10∼<30 kDa

≥30 kDa

22.06±1.35^b 18.94±2.14^bc 10.91±0.56^c 44.31±5.11^a Values are mean±SD of 3 replicates.

Different small letters indicate a significant difference (P<0.05) among different subfraction of protein extracts.

c

b

a

d

e

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ABTS radical scavenging . activity (mg AAE/g) .

HGBP PM1 PM2 PM3 PM4

A

d d a

b

c

0 1 2 3 4

DPPH radical scavenging . activity (mg TE/g) .

B

HGBP PM1 PM2 PM3 PM4

Fig. 3. Effect of fraction (PM1∼PM4) isolated by ultrafiltration (MWCO) of protein extracts treated by high hydrostatic pressure

HGBP: high hydrostatic pressure and germination treated black soybean protein extracts. Fractions are the same as in Table 1.

혈압을 감소시키는 bradykinin을 불활성화시키는 효소이다 (24). ACE 저해제는 ACE의 작용을 저해함으로써 angio- tensin-Ⅱ의 생성저해, aldosterone 분비 감소, 혈관확장제 인 bradykinin의 증가 등의 과정을 통해 신장혈관을 확장시 켜 sodium의 배설을 촉진함으로써 혈압을 낮추어 줄 수 있 다(25). Kitts와 Weiler(26)는 콩단백질로 알려져 있는 gly- cinin(11S)과 β-conglycinin(7S)은 가수분해가 진행됨에 따라 ACE의 작용을 억제함으로써 항고혈압 활성을 나타낸 다고 하였으며, Li 등(27)은 protease alcalase 또는 pep- sin-pancreatin으로 가수분해한

Phaselus lunatus

Ultrafiltration 분획의 항산화 활성

항산화 활성 및 ACE 저해활성이 가장 높게 나타난 고압 처리 발아콩(4일 차, 150 MPa)의 수용성 단백질 추출물은 3, 10 및 30 kDa의 ultrafiltration membrane을 사용하여 분자량에 따라 분리하여 분획물을 제조하였으며, 분획수율 은 Table 1과 같다. PM1(<3 kDa), PM2(3~<10 kDa) 및 PM3(10~<30 kDa)은 각각 22.06, 18.94 및 10.91%의 수 율을 보였으며, PM1~PM4의 분자량별 분획의 항산화 및 ACE 저해활성을 측정하였다. 고압처리 발아콩으로부터 추 출한 수용성 단백질 추출물의 분자량에 따른 항산화 활성의 변화는 Fig. 3과 같이 유의적인 차이를 나타냈다(

P

Ultrafiltration 분획은 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능이 2.59~6.52 mg AAE/g 및 1.32~2.95 mg TE/g 범위로 다 양하게 분포하였으며, PM2, PM1 PM3 및 PM4 순으로 높 은 라디칼 소거능을 나타내었다. 즉 ultrafiltration 분획을 하기 전 고압처리 발아콩의 수용성 단백질 추출물은 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능이 3.83 mg AAE/g 및 1.92 mg TE/g이었지만, PM2(3~<10 kDa) 분획은 각각 6.52 mg AAE/g 및 2.95 mg TE/g으로 크게 증가하였다. Moure 등 (28)은 대두단백질을 효소로 가수분해시킨 가수분해물 중 에서 분자량 30 kDa 이하의 저분자 펩타이드가 우수한 라디 칼 소거능을 나타낸다고 하였으며, Pihlanto(29)는 우유에

Dc CDc

Ac

Bc

Cc Eb

Db Ab

Bb Cb

Da Ca

ABa Aa Ba

0 20 40 60 80 100

ACE inhibitory activity (%) .

1mg/mL 2mg/mL 5mg/mL

1 mg/mL 5 mg/mL

2 mg/mL

HGBP PM1 PM2 PM3 PM4

Fig. 4. Effect of fraction (PM1∼PM4) isolated by ultrafiltration

Different small letters indicate a significant difference (P<0.05) among concentration of subfraction.

서 유래된 항산화 단백질들의 조성이 친수성 아미노산을 포 함하는 5~11개의 아미노산으로 되어 있을 때 항산화력이 높다는 연구 결과를 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다.

Ultrafiltration 분획의 ACE 저해활성

고압처리 발아콩으로부터 추출한 수용성 단백질 추출물 의 분자량에 따른 ACE 저해활성의 변화는 Fig. 4에서 보는 바와 같이 분자량이 증가함에 따라 10 kDa까지 증가하다가 그 이후에 감소하는 경향을 나타내었으며, 3 kDa 미만과 분획물과 3~<10 kDa 범위의 분획물의 경우 수용성 단백질 추출물에 비해 유의적으로 높게 나타났다(

P

%와 34.37%로 감소하였다. 즉 3~<10 kDa 범위의 분획물 이 1, 2 및 5 mg/mL의 농도에서 각각 52.35, 74.37 및 79.36

%로 가장 효과적으로 ACE의 작용을 억제함으로써 항고혈 압 활성을 나타내었다. 쌀겨단백질로부터 ACE 저해활성을 나타내는 펩타이드의 분리에 대한 Wang 등(30) 연구에 따 르면 ultrafiltration을 이용하여 분자량별 분획물의 ACE 활 성을 측정한 결과, 6 kDa 이상의 분획물은 IC₅₀ 값이 0.6 mg/mL였지만 4~6 kDa의 분획물은 0.48 mg/mL로 유의적 으로 높은 ACE 억제율을 나타내었고, 이는 ACE 저해활성 을 나타내는 펩타이드가 Try-Ser-Lys, Lys-Phe-Tyr- Gly 및 Ala-Cys-Lys-Glu-Pro 등의 3~5개의 아미노산으 로 구성된 올리고펩타이드에 의한 결과라고 보고하였다. 본 연구에서도 3~<10 kDa의 분획물에서 ACE 저해활성이 높 게 나타난 것은 ACE의 작용을 저해함으로써 angiotensin-

Ⅱ의 생성 저해, aldosterone 분비 감소, 혈관확장제인 bra- dykinin의 증가 등의 과정을 통해 신장혈관을 확장시켜 so-

dium의 배설을 촉진함으로써 혈압을 낮추어 주는 저분자 펩타이드에 의한 것으로 판단된다. 최종적으로 ACE 저해활 성을 나타내는 3~<10 kDa의 저분자 펩타이드 함량은 발아 와 고압처리에 의해 증가하였고, 고압처리 발아콩으로부터 항고혈압 활성을 나타내는 펩타이드의 개발이 가능할 것으 로 생각된다.

요 약

본 연구에서는 발아와 고압처리에 따른 수용성 단백질 추출 물의 생리활성을 확인하기 위하여 검정콩을 발아시킨 후 고 압처리하고 분자량별로 분리한 후 생리활성을 검토하였다.

ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능은 발아 4일 차, 150 MPa의 압력까지 증가하였다. ACE 저해활성은 발아에 의한 증가 효과는 나타나지 않았지만, 고압과 병행처리 시 150 MPa 처리에서 50.78~51.35%로 증가하였다. 항산화 활성 및 ACE 저해활성이 가장 높게 나타난 고압처리 발아콩(4일 차, 150 MPa)의 수용성 단백질 추출물의 ultrafiltration 분획물 은 PM1(<3 kDa), PM2(3~<10 kDa) 및 PM3(10~<30 kDa) 이 각각 22.06, 18.94 및 10.91%의 수율을 나타냈다. 분자 량별 분획물의 ABTS와 DPPH 라디칼 소거능 및 ACE 저해 활성은 모두 PM2와 PM1에서 높은 활성을 나타내어 저분자 펩타이드의 생리활성을 확인하였다. 이상의 결과로부터 항 산화 활성과 ACE 저해활성을 나타내는 3~<10 kDa의 저분 자 펩타이드 함량은 발아와 고압처리에 의해 증가하였고, 고압처리 발아콩으로부터 기능성을 나타내는 펩타이드의 개발이 가능할 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구는 농림수산식품부 고부가가치식품기술개발사업(과 제번호: 316052-03)에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립 니다.

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