Anti-inflammatory and antimicrobial effects of Jeju rosemary essential oil against skin flora

http://dx.doi.org/10.12925/jkocs.2018.35.3.744

제주산 로즈마리 에센셜 오일의 항염 및 피부 상재균에 대한 항균 활성

김소희

․이미란

․김창수

․김정미

․부희정

1제주대학교 생명과학기술혁신센터

2국제아로마테라피임상연구제주센터

3유씨엘 주식회사(UCL Co., Ltd.)

(2018년 8월 3일 접수: 2018년 9월 14일 수정: 2018년 9월 20일 채택)

Anti-inflammatory and antimicrobial effects of Jeju rosemary essential oil against skin flora

So-Hee Kim¹․Mi-Ran Yi¹․Chang-Soo Kim¹․Jung-Mi Kim³․Hee-Jung Bu^2✝

1

Biotechnology Regional Innovation Center, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea

2

International Aromatherapy Clinical Jeju Center, Ayeon-ro, Jeju-si 198, Jeju 63147, Republic of Korea

3

67-ro Eoeum10-gil, Aewol-eup, Jejusi, Jeju Special Self-Governing Province (Received August 3, 2018; Revised September 14, 2018; Accepted September 20, 2018)

요 약 : 본 연구는 제주산 자생 로즈마리 에센셜 오일의 항염 및 피부상재균에 대한 항균 활성을 확 인하기 위한 것이다. 로즈마리 에센셜 오일은 물 증류법으로 추출하였다. 로즈마리 에센셜 오일의 항염 효능을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO와 PGE2의 생성을 농도 의존적 으로 억제하는 것을 확인하였다. Western blot 실험을 통해 이들을 생합성하는 효소인 iNOS, COX-2 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 전염증성 cytokine인 TNF-⍺와 IL-6의 생성 억제 효능을 확인하였다. 항생제 내성균주 각 2종을 포함한

S. epidermidis

P. acnes

주제어 : 항염, 항균, 로즈마리, 에센셜 오일, 피부 상재균

Abstract : The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory effect and the antimicrobial activity to skin flora of essential oil from rosemary that naturally grown in Jeju.

rosemary essential oil was extracted by water distillation essential oil extraction method. In order to



✝

Corresponding author

(E-mail: [email protected])

confirm the anti-inflammatory activity of rosemary essential oil, it was confirmed that the production of NO and PGE2 induced by LPS in RAW 264.7 cells was inhibited in a concentration-dependent manner. Western blot analysis showed that the expression of iNOS and COX-2, which are biosynthetic enzymes, decreased in a concentration-dependent manner. In addition, production of TNF-⍺ and IL-6 the pro-inflammatory cytokines were inhibited.

Antimicrobial activities of three

S. epidermidis

P. acnes

Keywords : Anti-inflammation, Antimicrobial, Rosemary, Essential oil, Skin floras

1. 서 론

생활수준의 향상과 함께 의료기술의 발달 및 복지정책의 개선 등 전반적인 사회 환경이 나아 지면서 소득수준 향상, 평균수명의 증가로 아름다 움, 젊음, 개성 표현 등 감성적 가치를 중요시 하 는 욕구 역시 커지고 있다. 뷰티 케어에 대한 소 비자들의 관심은 환경이나 외적 스트레스 등에 의해 가속화되는 문제성 피부 트러블에 대한 케 어 제품에 대한 관심도를 증가시키고, 그에 따라 여러 가지 피부 트러블을 유발하는 유해성분을 배제한 안전한 천연 원료 및 제품에 대한 연구들 이 진행되고 있다. 이미 생필품으로써 남녀노소 매일같이 바르게 되는 화장품에는 계면활성제, 방 부제, 인공향료 등이 일반적으로 피부에 염증이 나, 뾰루지, 부종 등을 유발할 수 있는 주원인으 로 알려지면서, 피부 자극에 대한 완화 및 피부 질병예방을 위한 항균 및 항염 소재에 대한 관심 도 증가하고 있다. 피부는 인체의 기관 중 가장 큰 면적을 차지하고 있는 것으로 외부의 오염 물 질에 가장 먼저 노출될 뿐만 아니라 내부에 쌓여 있는 독소를 배출할 수 있는 기관이기도 하다.

오염된 환경이나 스트레스에 의해 쌓인 인체의 독소들이 몸의 대사가 원활하지 못해 제대로 배 출되지 못하게 되거나 각종 환경오염, 자외선, 약 품, 정신적 스트레스 등 외부 환경 등에 의해 컨 디션이 저조 할 때 자극을 받게 되면 각종 세균 의 공격을 받게 되어 피부 트러블은 심해지게 되 고 그로 인해 여드름, 아토피 등의 염증성 피부 질환이 발생하게 된다. 사람의 피부는 항상 외부 에 노출되어 있으며, 세균의 발육에 적합한 환경

을 가지고 있기 때문에 태생기에는 무균적이었던 피부도 오염을 받아 각종 세균이 존재하게 된다.

이들 정상피부에 존재하는 미생물의 집단을 피부 세균총 이라하고 상재균과 비상재균으로 분리된 다. 피부 상재균 중 일부는 피부면역 작용을 하 지만, 체내로부터 배출된 피지성분, 땀 성분 및 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알콜, 단백질 등 은 피부상재균 들에 의해 독성이 강한 물질로 분 해되어 이들에 의해 피부 염증이 유발된다. 여드 름의 정확한 발생원인은 확실히 밝혀지고 있지 않지만, 여러 원인이 복합적으로 작용하는 것으로 판단되어지며, 피부 상재균 중 모낭 내에 상주하 는 균인

propionibaceruim acnes

P. acnes

[5]. 한편 cyclooxygenase-2 (COX-2)는 염증 반응, 면역 반응 등에 관여를 하는 PGE2를 생성 하여 지속적인 염증 반응을 일으킨다[6,7]. 피지 분비가 왕성해지면 피지선이 발달한 이마, 코 주 위, 목, 앞가슴 등에 여드름이 돋고, 발달한 피지 선에 여드름 균이 침투하면 염증과 함께 모공 깊 숙이 고름주머니가 만들어지게 되고 이차적인 감 염으로 염증성 피부질환이 일어날 수 있다. 따라 서 피부 상재균에 대한 항균 효과가 있으면서 피 부의 염증을 막아주는 효과가 우수하고 부작용이 없으며 친환경적인 소재의 개발 및 그 물질을 함 유하는 화장료의 개발이 중요하다. 에센셜 오일 은 특히 방부, 살균, 항균 효과가 뛰어나 고대에 서부터 예방의학과 피부문제 및 일반적인 질병에 대한 치료의 목적뿐만 아니라 미용의 영역에서도 많이 사용되어 왔으며, 그 효능이 종류나 재배 지역, 또는 수확시기에 따라 다양해 그 특성에 따른 많은 연구들이 진행되고 있다. 로즈마리 (

Rosemarinus officinalis

에센셜 오일은 채집 시기나 재배 장소에 따라 화 학적 조성 성분이 다르고 그 효능에 있어 큰 차

이를 나타낸다. 특히나, 로즈마리는

comphor-borneol, 1,8-cineole, verbenone으로 세 가지 주요한 케모타입을 가지고 있어 정확한 화학적 성분 규명과 함께 그 효능을 파악하고 활 용하는 것이 중요하다[9,10]. 로즈마리에 대한 기 존의 연구는 항균, 항산화, 항암, 발모 등에서 많 이 진행되어 왔고[11,12,13,14,15], 특히나 제주 산 로즈마리에 대해서는 성분분석과 항산화 연구 가 되어 있다[16]. 하지만 에센셜 오일의 대식세 포에 대한 항염 효능 연구가 되어있지 않고, 피 부 상재균에 연구가 미흡한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 염증 매개물질인 NO, IL-6, TNF- α, COX-2, iNOS, PGE2의 생성 억제 및 피부

질환을 일으키는 대표적인 피부 상재균인 포도상 구균(

Staphylococcus epidermidis)

P.

acnes

2. 실 험

2.1. 시약 및 기기

에센셜 오일 성분 분석은 Gas chromatography- Mass selective detector(GC-MS) (Agilent 7890A)를 사용하였다. 균 배양 배지로 trypticase soy broth (TSB)는 Difco (USA), reinforced clostridial medium (RCM)은 oxoid(United kingdom, USA), 고체배지 제조에 사용된 agar powder는 대정화금(korea)의 제품을 사용하였다.

항균 실험에 사용한 incubating jar, CO2 가스 팩은 oxoid (United kingdom, USA), paper disc 는 ADVANTEC (japan)의 제품을 사용하였고, 흡광도의 측정에는 epoch spectrophotometer (BioTek, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 대 식세포 RAW 264.7 cell은 American Type Cell Culture (ATCC)로부터 구입하였고, 세포 배양에 사용된 배지의 penicillin, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)은 (Gibco, Inc., USA)에서 구 입해서 사용하였다. LPS (lipopolysaccharide), MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide와 단백질 정량 시 약 RIPA buffer, PBS, sulfanilamide, naphylethylenediamine, phosphoric acid, sodium nitrite (NaNO2), BSA, Bradford는 (Sigma- Aldrich Co., USA)에서 구입하여 사용하였다.

DMSO는 대정화금(korea)의 제품을 사용하였다.

PGE2, TNF-α, IL-6의 측정은 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (R&D, BD systems INC, Minneapolis, MN, USA)를 사용 하였다. 전기영동에 사용된 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus Gel, Mini Gel Tank와 transfer에 사용된 iBlot2 Transfer Stacks (nitrocellulose, mini), iBlot Gel Transfer Device 및 anti-body 처리에 사용한 ibind, ibind card는 (Invitrogen, thermo Fisher Scientific)에서 구입하여 사용하였다. 1차

항체는 NOS2 C-11 (Santa Cruz), purified mouse anti-COX-2 (BD Bioscience), β-actin antibody clone AC-74 (Sigma)를 사용하였고, 2차 항체는 goat mouse IgG HRP (Santa Cruz) 를 사용하였다. ECL은 Miracle star western blot detection system (iNtRON)을 사용하였다.

단백질 발현은 Chemidoc (Fusion solo, VILBER LOURMAT, Germany)을 이용하여 확인하였다.

2.2. 시료 추출

본 실험에서 사용한 로즈마리는 2016년 11월 에 제주대학교 인근에서 자생으로 자란 꽃과 잎 가지 부분을 채집하여 잘게 자른 후 수증기 증류 정유 추출 장치를 사용하여 수증기 증류 추출법 으로 6시간 동안 추출하였고 총 추출 수율은 0.7%였다. 추출된 에센셜 오일은 1회 사용 분량 을 갈색병에 분주하여 냉동실에 보관하며 사용하 였다.

2.3. 실험 방법

2.3.1. 기체 크로마토그래피-질량분석 (GC-MS)

로즈마리 에센셜 오일의 성분 분석은 Gas chromatography-Mass selective detector (GC-MS)를 이용하여 분석하였다. GC Column 은 HP-5MS (0.25 μm × 30 mm × 0.32 mm)를 사용하였고 Carrier gas는 He을 사용하여 유속 1 mL/min으로 하였다. 검출기 온도는 27 0℃, 온도 프로그램은 40℃에서 3분간 유지한 후, 250℃까지 3 ℃/min으로 승온시켜 250℃에 서 3분간 유지하였다. 분석된 각 피크를 W9N08.L(Wiley)와 비교하였고 일치도 95% 이 상의 성분만 선택하여 구성성분으로 결정하였다.

2.3.2. 세포주 및 세포배양

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 cell을 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2

incubator 조건에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양하였다.

2.3.3. 세포독성평가(MTT assay)와 Nitric oxide (NO) 생성 저해능 측정

96 well plate에 RAW 264.7 cell을 2.0×10⁵ cells/mL로 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 18시간 동안 배양하였다. 배양시킨 cell에 각각의 농도로 희석한 샘플을 처리한 후 1시간 동안 배 양시킨 뒤, 0.1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시 간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid)을 이용하여 세포 배양 액 내에 존재하는 NO^2-의 형태로 측정하였다.

세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μ L를 혼합하여 96 well plate에서 5분 동안 반응 시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성 된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 이용 하여 검정 곡선을 작성하여 비교하였다. 검정 곡 선의 r² 값은 0.99 이상이었다. MTT(3-(4,5- d i m e t h y l - t h i a z o l - 2 - y l ) - 2 , 5 - d i p h e n y l tetrazolium bromide) assay는 96 well plate에 RAW 264.7 cell을 2.0×10⁵ cells/mL로 분주하 고 37℃, 5% CO2 조건하에서 18시간 동안 배양 하였다. 배양시킨 cell에 각각의 농도로 희석한 농도의 샘플을 처리한 후 1시간 동안 배양시킨 뒤, 0.1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양 하였다. 24시간 배양 후 배양액에 500 μg/mL 농도로 MTT를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 상층액을 제거하였다. 여기에 DMSO를 가하여 살아있는 세포와 반응하여 생긴 formazan 침전물을 용해시킨 다음 이를 96 well plate에 옮긴 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였 다.

2.3.4. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 cell을 6 well plate에 5.0×10⁵ cells/mL로 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator 조건하에 18시간 동안 배양하였다. 다음날 sample을 농도별로 처리하고 1시간 동안 배양한 후에 LPS (0.1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 얻은 배양 배지의 상층액 내에 존재하는 PGE2를 측정하기 위해 Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit를 이 용하여 정량하였으며, standard에 대한 표준 곡선 의 r² 값은 0.99 이상이었다.

2.3.5. iNOS 및 COX-2 발현 억제 효능 평가 (Western Blot)

RAW 264.7 cell을 6 well plate에 5.0×10⁵ cells/mL로 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator 조건하에 18시간 동안 배양하였다. 다음날 sample을 농도별로 처리하고 1시간 동안 배양한 후에 LPS (0.1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 제거하고 PBS로 세 척하여 lysis buffer (1 × RIPA)로 단백질을 lysis시키고 원심분리(15000 rpm, 4℃, 20 min) 하여 얻은 단백질의 상층액을 실험에 사용하였다.

단백질 정량은 bovine serum albumin (BSA)를 표준으로 bradford 시약을 사용하여 표준 검정 곡선을 작성하여 정량하였다. 정량한 단백질을 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus Gel에 전기영동한 후 이를 iBlot2 Transfer Stacks을 이용해 membrane 에 transfer 하였다. 단백질이 transfer 된 membrane을 iBind와 iBind card를 이용하여 1차 항체 반응에 각각 NOS2 C-11, purified mouse anti-COX-2, β-actin antibody clone AC-74 를 사용하였고, 2차 항체는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 것으로 사용하여 반응 시켰 다. 단백질은 Miracle star western blot detection system 용액을 사용하여 ECL 기질과 반응 시킨 후, Chemidoc을 이용하여 각각의 단 백질 발현 정도를 분석하였다.

2.3.6. 염증성 사이토카인(TNF-⍺, IL-6) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 cell을 6 well plate에 5.0×10⁵ cells/mL로 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator 조건하에 18시간 동안 배양하였다. 다음날 sample을 농도별로 처리하고 1시간 동안 배양한 후에 LPS (0.1 μg/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 얻은 배양 배지의 상층액 내에 존재하는 TNF-α, IL-6를 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit를 이용하여 정량하였으며, standard에 대한 표준곡선의 r² 값은 0.99 이상이었다.

2.3.7. 사용 균주 및 배지와 균주 배양

Staphylococcus epidermidis

S. epidermidis

Propionibacterium acnes

P. acnes

S.

epidermidis

P.

acnes

S. epidermidis

P.

acnes

2.3.8. 항균활성 측정(Paper disc diffusion method)

항균활성을 측정하기 위하여 paper disc diffusion method를 사용하였다. Spectrophoto- meter를 사용하여 600 nm에서 optical density (O.D)값을 측정하고 희석하여 0.2로 맞춰 45℃

로 식힌 멸균된 고체배지(agar powder 0.8%)에 100배 희석한 후 petri dish에 미리 굳혀둔 고체 배지(agar powder 1.5%) 위에 6 mL 가하여 굳 힌다. 여기에 시료를 10 μL (100%) 가한 8 mm paper disc를 올리고 배양한다. 배양 후 생 성된 생육저해환의 지름(mm, disc포함)을 측정하 여 항균활성을 비교 분석하였다.

2.3.9. 미생물 최소저해농도(MIC) & 미생물 최소사멸농도(MBC)

미생물 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 다음과 같이 측정하였다.

96 well plate에 시료 농도를 0, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10%로 100 μL 가한 후 O.D 값을 0.2 로 맞춘 균 배양액을 100배 희석하고 well 당 100 μL씩 가하여 배양하고 세균의 증식 여부를

육안으로 확인한다. 미생물 최소사멸농도

(minimum bactericidal concentration, MBC)는 다음과 같이 측정한다. MIC 법에 따라 확인된 MIC 농도 이상의 well의 배지를 루프를 이용하 여 고체배지에 획선 도말하여 배양한 후 균의 생 육 여부를 확인한다. 균이 전혀 자라지 않은 농 도를 MBC 값으로 한다.

2.4. 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 군의 차이는 분산분석, 사후검정은 다중범위 검정(Duncan's multiple range test)으로 실시하였 고, 모든 통계자료는 SPSS 14 program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였다.

실증분석은 유의확률 ^*

p

p

시하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 성분 분석

기체 크로마토그래피-질량분석(GC-MS)를 이 용하여 로즈마리 에센셜 오일(RE

)

모노터펜류는 α-pinene을 주성분으로 하여 camphene, dl-Limonene, beta-pinene, myrcene, ortho-cymene, gamma-terpinene 등의 성분이, 알코올류에는 linalool, borneol, 4-terpineol, α -Terpineol, Geraniol 등의 화합물이 비교적 높은 함량으로 분석되었다. 이러한 결과는 로즈마리 에 센셜 오일 성분을 분석한 전 등[15]의 연구와 비 교하였을 때 터펜류의 성분 함량은 비교적 낮고, 알코올 성분 함량이 전체적으로 높아짐을 확인할 수 있었고, 기존 로즈마리 에센셜 오일의 성분 중 verbenone 함량이 눈에 띄게 높게 분석됨을 확인할 수 있었는데, 이는 ISO (International Standardization Organization, 2009) 기준 함량 보다도 5배 이상 높은 수치로, 우 등[19]의 연구 한 각 나라별 로즈마리 에센셜 오일들보다도 월 등히 높은 수치임을 확인할 수 있었다. 이러한 성분 함량의 차이는 같은 제주 지역이라 하여도 채집 시기와 재배 장소에 따라 다르게 나타날 수 있음을 확인할 수 있었다. 전 등[15]의 연구와 같 은 제주도 표선 지역의 로즈마리 에센셜 오일의 성분을 수입 정유와 비교 분석한 우 등[19], 연 구에서도 특히나 α-pinene 함량에 큰 차이를 보 이고 있는 것으로 보아 채집 시기나 추출방법 등 에서도 성분의 함량에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

로즈마리 verbenone 케모타입은 가장 완만한 무자극성 에센스로 고품질의 피부 관리제품들에 활용되고 있고[9], 본 연구에서 분석한 로즈마리 에센셜 오일의 경우 verbenone 케모타입과 유사 한 성분 함량을 보이고 있어 안전한 피부 관련 제품에 활용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었 다.

Table 1. Chemical composition (%) of rosemary essential oil

Retention

(min)Time Constituents Area Identification

(%)

8.139 tricyclene 0.12

8.374 alpha-thujene 0.06 8.626 alpha-pinene 24.59

9.141 camphene 3.32

9.387 butylbenzene 0.69 10.257 beta-pinene 1.67

10.966 myrcene 1.09

11.452 l-phellandrene 0.26 11.990 alpha-terpinene 0.56 12.357 cymene, ortho 1.19 12.522 dl-Limonene 3.54 12.723 1,8-cineole 15.73 13.020 trans-Ocimene 0.01 13.879 gamma-terpinene 1.12 15.212 alpha-terpinolene 0.95

15.893 Linalool 2.20

16.031 filifolone 0.2

17.815 camphor 2.41

18.691 pinocarvone 0.26

18.840 borneol 4.95

19.200 pinocamphone 0.65 19.355 4-terpineol 1.43 20.035 α-Terpineol 3.52

20.333 myrtenol 0.70

21.002 verbenone 12.70

21.340 trans-carveol 0.10 21.821 citronellol 0.29

22.444 carvone 0.09

23.034 Geraniol 5.07

23.692 citral 0.28

24.281 bornyl acetate 1.03

32 eugenol 0.03

33 methyl eugenol 0.32 34 caryophyllene 0.60

35 humulene 0.08

Total 91.81

3.2. 세포 독성과 NO 생성 억제 효과

Nitric Oxide (NO)는 염증 유발에 중요한 역 할을 하며 통증, 부종 등의 염증 반응을 촉진시

Fig. 1. The effects of

Rosemarinus officinalis

㎍/mL) for 24 h in the presence of the

Rosemarinus officinalis

essential oil. Cell viability was determined using the MTT assay. Values are mean ± SEM of triplicate experiments. The results were expressed as the average of triplicate. ^*

p

p

키는 것으로 알려져 있다. 이러한 NO는 여러 가 지 외부 자극으로 대식세포가 활성화되어 생성되 는데 이때 과도하게 생성된 NO는 염증성 질환을 유도한다[20,21,22]. 따라서 본 연구에서는 로즈 마리 에션셜 오일 추출물의 항염증 효과를 확인 하기 위하여 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성량과 세포독성을 확인하였다. 에센셜 오일의 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.04%로 하였으며 NO의 양은 Griess 시약 을 사용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2- 의 형태로 측정하였다. 측정한 결과, 로즈마리 에 션셜 오일 추출물은 LPS에 의해 유도된 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며 IC50 값은 0.0186±0.00%이다. 이는 정 등[23]의 연구에서 보고된 Sandalwood Essential Oil의 NO IC50 값 0.0395% 보다 좋은 항염 효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다. 같은 처리 조건으로 세포독성 효 과를 확인하기 위해 MTT assay를 동시에 측정 하였고 그 결과 세포 독성 없이 NO 생성을 억 제하는 것을 확인하였다(Fig. 1).

3.3. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 효과 염증반응 시 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의 해 생성되는 PGE2도 염증 관련 질병을 유발하는 것으로 보고되어 있다[24]. NO 생성을 농도 의 존적으로 억제시킨 로즈마리 에센셜 오일에 대하 여 PGE2 생성 억제 활성을 sandwich ELISA kit 로 측정하였다. LPS가 처리된 RAW 264.7 세포 에 로즈마리 에센셜 오일을 농도 0.01, 0.02, 0.04%로 처리한 실험 결과 각각 85.0±6.0, 89.0±6.0, 90.1±2.9% PGE2의 생성 억제 효능 을 보였으며, 이러한 결과들은 로즈마리 에센셜 오일이 염증 매개인자인 NO와 PGE2의 생성 조 절을 통해 항염증 효과를 나타낼 것으로 사료된 다(Fig. 2).

3.4. iNOS 및 COX-2 발현 억제 효과

NO와 PGE2는 대표적인 염증반응 유도 인자로 TNF-⍺, IL-6와 같은 염증성 cytokine의 자극이 있을 때 생성된다. NO는 iuducible NOS (iNOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되며, PGE2는 COX-2에 의해 생성된다. 이들의 생성

Fig. 2. Inhibitory effects of the

Rosemarinus officinalis

Rosemarinus officinalis

essential oil. Supernatants were collected, and the PGE2 concentration in the supernatants was determined by ELISA. ^*

p

p

에 관여하는 효소인 iNOS와 COX-2의 조절은 항염증 반응에 관여할 수 있음을 시사한다 [20,21,22]. 따라서 본 연구에서는 로즈마리 에 센셜 오일에서 LPS 자극에 의해 유도된 NO와 PGE2의 생성에 대한 억제효과가 이들을 생합성 하는 효소인 iNOS와 COX-2의 세포 내 발현 조절에 의한 것인지를 알아보기 위해 단백질 수 준에서의 발현량을 western blot을 통해 확인하 였다. 실험 결과 iNOS는 농도 0.01, 0.02, 0.04%에서 각각 43.0, 76.7, 95.7% 발현량이 감 소하였고, COX-2도 농도 0.01, 0.02, 0.04%에 서 각각 17.7, 23.0, 55.1% 발현량이 감소하였다.

위의 실험 결과로 보아 로즈마리 에센셜 오일이 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 조절함으로써 염증매개물질 생성 억제에 영향을 준 것으로 사 료된다[20,21,22](Fig. 3).

3.5. 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6) 생성 억제 효과

많은 염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있는 TNF-⍺와 IL-6는 대식세포에서 분비되는 전 염 증성 cytokine으로 이 염증 매개인자들이 과도하

게 분비되면 인체 내 면역체계 균형이 무너지면 서 다양한 염증 반응을 일으킨다[23,24]. 여기서 TNF-α는 염증 반응을 유도하는 LPS 처리에 의 하여 대식세포에서 분비되는 주요 cytokine으로 생체 내 만성염증과 관련되어 있으며 염증반응의 개시, 전개에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하 는 대표적인 cytokine이다[23]. IL-6는 조직 손상 에 대한 반응에서 중요한 역할을 하는 cytokine 이며 TNF-α와 마찬가지로 과도하게 생성되면 발열 및 부종과 같은 염증 반응을 일으킨다[24].

본 연구에서는 로즈마리 에센셜 오일이 이러한 초기 염증 반응 진행에 중요하게 작용하는 염증 매개인자들의 생성을 억제함으로써 항염 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 ELISA kit를 이용하 여 실험을 진행하였다. TNF-α의 경우 농도 0.01, 0.02, 0.04%에서 실험을 진행한 결과 0.01%에서는 생성 억제 효과를 나타내지 않았지 만 0.02, 0.04%에서는 세포 독성 없이 생성 억제 효과를 나타내었으며 IC50 값은 0.0109± 0.00%

이며, 이는 인동꽃 에센셜 오일의 항염 활성에 대해서 보고된 전 등[25] TNF-α의 IC50 값 0.0240±16.4%보다 좋은 활성을 보였다.

Fig. 3. Inhibitory effects of Essential Oil from

Rosemarinus officinalis

Rosemarinus officinalis

p

p

(A) (B)

Fig. 4. Inhibitory effects of the

Rosemarinus officinalis

Rosemarinus officinalis

essential oil. Supernatants were collected, and the (A) TNF-α (B) IL-6 concentration in the supernatants was determined by ELISA. ^*

p

p

CCARM 3709

CCARM 3710

CCARM 3711

CCARM 0081

CCARM 9009

CCARM 9010

S. epidermidis P. acnes

Fig. 5. Antimicrobial activities of

Rosemarinus officinalis

IL-6의 경우 농도 0.01, 0.02, 0.04%에서 세포독 성 없이 농도의존적으로 생성을 억제하였으며, IC50 값은 0.0109±0.00% 이며 이 또한 인동꽃 에센셜 오일의 항염 활성에 대해서 보고된 전 등 [25] IL-6의 IC50 값 0.0247±5.1%보다 좋은 활 성을 보였다(Fig. 4).

3.6. 항균활성(Paper disc diffusion method)

S. epidermidis, P. acnes

S. epidermidis

P. acnes

S. epidermidis

P. acnes

P. acnes

P.

acnes

3.7. 미생물 최소저해농도(MIC) & 미생물 최소 사멸농도(MBC)

Paper disc diffusion 법으로 로즈마리 에센셜 오일의 항균활성을 확인한

S. epidermidis

P.

acnes

S. epidermidis

P. acnes

<0.125, 0.125, 0.5%로 나타났다. 이는 기존 연 구된 Fu 등[29]의 연구에서 여드름균에 대한 MIC, MBC 값이 0.56 mg/mL 보다는 낮은 항 균 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이는 기존 연구에서 사용된 로즈마리 에센셜 오일의 성분에 모노터펜 함량이 전체적으로 훨씬 많은 것으로 보아 모노터펜 성분 함량의 차이에서 오는 것으 로 여겨지며 모노터펜류 성분이 항균 활성에 더 효과적이라는 예측할 수 있었다. 기존 실험보다 여드름균주에 대한 항균력은 낮게 확인되었으나, 본 연구에 사용된 로즈마리 에센셜 오일은 여드 름균과 포도상구균에서 paper disc diffusion 법 에서와 같이 일반균주뿐만 아니라 항생제 내성균 주의 생육을 저해하고 사멸시키는 것으로 나타나 기존 항생제의 양을 줄이고 천연항균제로서 화장 품 원료에 활용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다(Table 2, 3).

Table 2. Antibacterial activity of

Rosemarinus officinalis

S. epidermidis

strains

S. epidermidis

CCARM3709 CCARM3710 CCARM3711

DISC(mm) 13 13.5 12

MIC(%) 0.125 0.25 0.25

MBC(%) 0.25 1.25 0.5

Drug-resistance patterns of skin pathogens(MIC;

ug/mL) Susceptible Erythromycin (> 32), Clindamycin (> 16),

Chloramphenicol (64) Tetracycline (> 32)

Table 3. Antibacterial activity of

Rosemarinus officinalis

P. acnes

strains

S. epidermidis

CCARM0081 CCARM9009 CCARM9010

DISC(mm) 24 15 14

MIC(%) <0.125 0.125 0.125

MBC(%) <0.125 0.125 0.5

Drug-resistance patterns of skin pathogens(MIC;

ug/mL) Susceptible Clindamycin (64) Clindamycin (64)

4. 결 론

본 연구는 로즈마리 에센셜 오일의 항염 및 피 부상재균에 대한 항균 활성을 알아보기 위하여 수증기 증류 정유 추출 장치를 사용하여 물 증류 법으로 확보한 에센셜 오일로 항염 및 피부상재 균에 대한 항균 활성을 확인 하였고, 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극한 후 iNOS/NO, COX-2/PGE2 및 전염증성 cytokine 을 유도하여 염증 억제 효과를 알아보았다. 항염 활성 분석을 위하여 NO/iNOS, PGE2/COX-2, 및 염증성 cytokine(TNF-α, IL-6)의 생성 억제 효능을 분석한 결과, NO, PGE2의 생성 억제 양 상과 iNOS, COX-2의 단백질 발현 억제 양상이 비슷하게 나타난 것으로 확인되어 iNOS, COX-2 단백질 효소에 의한 영향임을 확인하였 고, 염증성 cytokine중에서 IL-6의 생성을 강하 게 억제함으로써 전제적인 항염 활성에 영향을 끼치는 것으로 사료된다. 항균 활성 또한

S.

epidermidis

mm의 저해환이 관찰되었고, MIC가 각각 0.125, 0.25, 0.25%, MBC가 0.25, 1.25, 0.5%로, 여드

름균인

P. acnes

CCARM9009, CCARM9010은 disc법에서 각각 24, 15, 14 mm의 저해환이 관찰되었고, MIC가 각각 0.125, 0.125, 0.125% MBC가 0.125, 1.25, 0.5%로 나타났다. 이상의 결과들을 통해 로즈마 리 에센셜 오일이 항염 및 피부상재균에 대한 항 균 활성 효과가 있음을 확인하였고, 본 연구에서 는 적절한 채집시기와 장소를 일정하게 유지하여 성분함량의 표준화를 시킨다면 로즈마리 에센셜 오일이 항균 및 항염 효능을 갖는 화장품 및 피 부 미용 소재로써 다양하게 활용할 수 있을 것이 라 사료된다.

감사의 글

본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥 원의 “지역특화산업육성사업(P0000072)”으로 수 행된 연구결과 입니다.

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