Analysis of Nucleic Acid Components by Gas Chromatography

Journal of the Pharmaceutical Society of Korea 18. 85-96 (1974)

Gas-cliromatograph

^

tiS J

53

n * • a m *

(Received March 19, 1974)

M a n K i P ark a n d N a m H o B a ik: A n aly sis o f N ucleic A cid C om ponents by G as C h ro m a to g ra p h y

1869후 Miescher에 하여 **Nuclein** 이 라고 슬 ig 된 J고 1940후 chromatography외 중 m , 이 fljffl될 때까지는 거의 언 월 텔 , « 텔흠 이"" 두IJffl되었 다 . 1947후 -

〶 Vischer와 ChargafE에 ^ 하여 해 chromatograph2* 가 되기 했으며 K 찰 각 증 chromatography가 널리 결 ; 한 으로 후IJffl되어 왔 다 .

f터했S ' E S 은 column chromatography®^, ion exchange chromatography,"^* 떻 ® chro­

matography/) 텔 볼 ? 름 이 f W 되어 왔다 .

이 후S S t t f e S 이 며 또한 얹빨의 텔f i 했:9*이 나 nucleoside, nuclotide 둥 모 _ 두 S t t 이 평한 들이 어서 gas chromatography(GC) 에 별로 l6ffl울 못 하 였 으 나 , f t S

타의 및 GC블의 의 할평에 f t 하여 점차 많이 fIJffl 되고 있 다 . 에 불 빠 을 G C S 에 별형한 것은 1962년 Miles페로 알려져 있다. Nucleoside를 acetylft, methyl- acetone 떻 텔 ®로 두을 시도한바, adenosine, uridine록께에는 융헬에 했으나 guanos- ine과 cytidine홉는 ；융헬되지 않았다. MacGee그?퍼는 purine 또는 pyrimidine텔훌를 m ethyr

f t 하여 하였다. trimethyl silylating reagent(TM Sft훼)의 별 이 하여 TMS- f t 에 f t 한 e 빨 J® 상의 G C ft 가 시 작되 었다. 1965년 Hancock는 T M S ft에 ^ 하 여 nucleoside,내 adenosine룹황®14>를 GC& 에 Jgffi했으며, 1966면 Hashizume는 m icleotide/5>

의 엔 및 인 a » m m 세 i 해 하 였 다 . 그러나 cytidyiic ad d 데 가 ^ 하이 잘 안되며 cytidine의 덜 S14 이 나쁘고 pseudouridine외 토 4 이 안되 여 층 ft그 에 따라 은 의 M o I ^ K 가 한다는 것이 단점으로 나타났다 . Gehrke2o-22»는 M 켰융수 purine과 pyrimidine^ * ® 의 텔* 했융을 주로 설시했으며 R N A , D N A 의 가수 분해 물질을 BSA, BSTFA등으로 T M S ft하여, 내부 표준 물질로 phenanthrene을 사 용 , 상' 대 몰 감도i t (R M R ： relative molar response) 로 좋은 토 g ^ 옮 를 얻고 있다. 그러 나 역.

시 cytosine의 peak가 두개로 같라지고 있는 것은 ® '^울 못하고 있다.

From the Department of Pharmaceutical Analysis, College of Pharmacy, Seoul National University,.

Seoul, Korea.

— 8 5 —

* 콜가 있던 하3^을 에서는 이 두개의 peak에 f i 하여 연구 발표2®를 했으나 아직 출관중 '에 있다. 특히' f t S 1 5 # / H 로써 barbituric acid를 ■분피하여 phenanthrene에 비 하여 몇 가

지 이점을 얻게 된다- Phenanthrene의 순품 경제가 곤란한데 버하여 barbituric acid는 •닭 정제가 간단하며 phenanthrfene은 T M S와 S ig f f i이 많기 '때문에' 했®의 용과 TM S외 . S i g 정 도를 할 수가 없으나 barbituric acid는 직접 떨을 함으로 S f i 에 관한 I t ® 헬

이 될 수 있고 gas chromatogram상에서는 수H i호®에 나타난다는 ；ftS£을 갖고 있다. ]고 i i 과 같이 뿔의 융을 GC^ 에 ■K하여 융헬 융W 및 , ^ 은 몇 년 사이에 급진적인 S

• 평을 거몹하고 있으며 미량 성분의 분석에도 많이 응용될 것으로 예상된다.

T M S 룹 31텔 황 했 융 외 G C S 은 짧 또 융 에 ~ 0 H , - N H a , - N H * 등의 강 한 g f t K 를 가 지 고 있거 나 조 때 문 에 그 대 로 외 는 거의 주 학 t g 하 였 으 나 최 근 에 는 T M S 에 ^ 하 여 g t t 도 감 소 하 고 S S t t 도 i t J n 하 는 유 도 체 로 되어 S 빨 m ：；?*의 G C ' ^ 을 용 이 하 게 l i f f l 할 수 있게 되 었 다 .

일 반 적 으 로 一 0 H , - N H a , - N H , - S H a 를 가 진 # 1 ® , 즉 S ," " * a l c o h o l , p h e n o l , steroid,2^* am ino acid, peptide,으®> nucleic acid, carboxylic acid,®®* 등이 T M S ffcW 렸 몇 에 f t 하여 e th e r ft 또 는 e s te rft하여 #JHl 쫓 균 한 (300° 정 도 로 해 융 는 없 옴 ) f t 슴 * 이 쪼 없 된 다 . 이 T M S ^ I g t i 는 JII7K요 ® 를 받 으 면 휴 통 하 게 본 래 외 f t 슴 i i ；로 되 돌 아 가 는 특정

■도 가 지 고 었 다 . ■

이 유도체가 S i K i 으로 J i f J 된다는 사설은 1952년 경부터 알려져 었으나^"-^« 이 ：5 &이

■G.C.에 Jgffl되 기 한 것은 1958년경 에야 phen이성 f t ■슘t ；의 에 서 되 었고 그 후 -헬 , amino acid, steroid, carboxylic acid등에 이 되 었다.

T M S ftffl만 하 여 도' 그 a 헬가 점차 많아지고 그 가 점점 높아지고 있는 실정이다.

.보통은 trimethyl silyl chroride (TMSC) 와 hexamethyldisilazane (HM DS) 이 많이 i호 되 었으나 차차 N, 0-bis(trimethylsilyl)acetamide (BSA) 또는 N, 0-bis(trimethylsilyI)trifluor-

•oacetamide (BSTFA) 등이 많이 사용되고 었는 설정이 다. 에는 GCfe 시 약용으로 TMS 를 적 당한 용매에 미 리 넣어서 m is 되는 것도 있고 TMS-HT와 같이 TM SC와 . HM DS

■의 흔합물을 pyridine의 행 상 데 로 하는 것도 있다.

m m 없요외 T M S ft« 로 i t s S i g t t 이 좋은 BSA나 BSTFA를 주로 사용하고 있으며 특 수한 경우에는 TM SC등을 섞어 쓰는 경우도 있다. {수은 S 빨외 s a j ^ 융을 건조하

■여 쌓 상태로 하고 pyridine 챙®에 녹인 후 T M S ftffl를 50~100m ole 초과량을 넣 고 ^^|§상 에 서 150°C 약 1시 간 정 도 면 떨 i K i 으 로 S f ? 된 다 .

« 콜 가 사 용 한 경 우 는 다 음 과 같 다 .

Procedure for GLC determination of base components, Dried sample (nucleic acid liydroly sates); 100 m cg~ lm g, pyridine or acetonitrile; 50/^, Silylating reagent (BSA or

86 # • e ： GLC 로 텔 S 많융의 Vol. 18. No. 2

m

#

June. 1974 m ¥ ^ U 87

B S T F A ); 50/고/. T he m ix ture in a test tube was sealed an d heated on a o il b a th (150°) for 45 m in . * 100 m olar excess of B S A to total bases.

S ® 토 은 거외 알려져 있 는 상 태 로 u ra c il인 경 우 2 , 4- di- O - T M S u ra c il베 로 알 려 져 있 고 g u a n in e 언 경 우 2, 9-di-N-6-0-TMS g u a n in e ,크크* ad en in e은 6 , 9 - d i- N - T M S ad e n in e 등 의 유 도 체 가 생 성 된 다 . G C f t 에서 이 러 한 촬 ?® 들 은 뿐 一 peak로써 으 로 나 타 나 게 된 다 . 즉 다 옴 과 같이 할 수 가 있 다 .

— 0 H — - N H ,

= N H

— S H —

trim eth yl silila tin g reagent solvent, heat

O —TMS

—N H —TM S

= N —TMS

■ —S—TMS

#

^ m - m m 겠 요 의 T M S해 떨 텔 는 이 ■많이 함 으 로 류 ® 이 하 다 . K K의 'TxMS K떨t s는 column 온 도 가 120°~220°정 도 이 며 nucleoside의 T M S황 * i t는 220°~

.240°, nucleotide는 240°~260°로 column온 도 를 해 주 면 거 의 구이 가 농 하 다 . 물 론 column 의 a « , 충 진 제 외 * « , 활 텔 의 a s 등에 따 라 쏟 가 생 기 게 된 다 .

출몽의 경우는 초로 boron silicate glass column 3 m m ^ x lm 를 거피하였으며 특히 미 량 성 분을 할 때 는 glass column이 더 걸fij할 것으로 생 각된다. 충진 제 로써 는 silicon oil 또는 silicon grease로 methyl silicon봉 (SE-30, OV-1), apiezon grease을 쏘는

■■W도 있다.

출별는 초로 0V-1, 0V-17을 사 용하 였다. » 1 1 도 f t E 에는 균질 bead로 된 •닭^ fp황이 사용되고 었으나 a iM 인 관계상 아직도 규조토를 적당히 처리하여 균질하게 된 것을 사용 하고 있는 실정 이 다. 풀콜는 초로 gas chrom. Q (80~100 mesh) 나 chromosorb W or G (80~100mesh) 를 뾰 ffl하였다. Gas chromatograph장처에 ^i± i몰도 여러가지 형 대 로 헬 {선하고 있으나 g 빨 켰 ;9•을 T M S룔 흠 ® 로 ：S■첸 , 흐tti할 타는 초로 F .I.D . (flame ionization

•dectector) 가 사용되고 있으며, — 황과는 달라서 가끔 F .I.D .에 부 착 되 는 백색 외 sic>2를 소제하여 야 한다는 이 있다. F .I.D .로써 많 p s il 는 각 에 대하여 -|tJ3Xl(r**mcle2®>로 렸통되고 있다. 휴;가 해 로 T.C.D.(thermal conductivity detector), H .W .D .(h o t wire detector) 톨 사용한 ■해도 있다. 어느 쪽이나 이 나 타 나 고 있으나

F .I.D .쪽이 높은 텔롭로 알려져 있다.

JiU i과 같은 여러 f i f r 수에서 3 iE ««i만 다르게 하면 I묶if R t H 의 볼 로 f t 슴쌓의 ra® 이 학 하게 된다 .

— 으로 column의 f i 별가 높으면 에 리 한 peak가 나타나나 ：9•황는 조 S ：해 지 며 , column

88 # • S ： GLC 로 했®농텔흘^ ; 9^의 Vol. 18, No. 2

낮으면 텔는 헤지 나 peak가 넓게 둔한 상태로 나타난다. 심한 경우에는 peak가 나타 나지 않는 경우도 있다. 특히 T .M .S .R 월I f 를 G .L .C .에 는 머 리 column을 T.M.S..

로 2~31H f f i A하여 에버처리를 하여 조g t t f t 시킨 후 하는 것이 좋다.

T able 1— Relative retention time of TMS derivatives of nucleic acid (liquid phase, DC 430).

Column temperature Flow rate (ml/min)

150 60

180 60

230 50

250 50

Uracil 0.08 0.12

Thymine 0.11 0.15

Cytosine 0.20 0.21

5-Methyl cytosine 0.22 0.26

Orotic acid 0.64 0.63

Purine 0.18 0.25

Hypoxanthine 0.84

Adenine 1.00 (a) 1.00 (b) 1.00 (c) 1.00 (d)

Theophylline 1.19 1.36

3-Methyl eanthine 1.56

Xanthine 2.02 1.70

Guanine 2.86 2.16

Uric acid 3.30 2.36

Deoxyuridine 5.21 5.43

Thymidine 5.65 5.97

Deoxyadenosine 9.88 9.66

Deoxy guanosine 17.48 16.51

Nebularine 5.21 5.54

Uridine 7.06 7.07

Cytidine 18.6

Inosine 10.32 9.99*

Adenosine 10.86 10.8&

Xanthosine 14.99 13.79'

Guanosine 18.24 16.83-

y-UMP 19.22

3^-AMP 28.25

3^-GMP 42.35

UMP 23.24

IMP 33.45-

AMP 37.03

GMP 49.74

dUMP 19.87

dAMP 35.51

THP 21.07

Column ： 596 DC 430, Celite545, 60—80 mesh

min, (c) 1.03 min, (d) 0.48 min

#

#

June, 1974 * 투 솔 ! ^ 89

T . H a s h izu m e 페 는 silicon D C 430과 apiezon 을 하여 없 황 J®;9■의 T .M . S . ^ 평 텔 의 ^ J측타r의을 조 사 한 에 가 있 다 . Table I, T able I I , 의 T . H a s h izu m e 의 경 우 는 항 온 에 서 각 3£ 햇 에 대 하 여 짧 K 을 * / 1 극한데 버 하 여 Gerke^>는 류 S T 에서 g 빨 켰 ;3^외 T . M . S .름 * 텔 를 왔 ? 큼 로 출 ^ 하 고 있 다 . (T able I I I , F ig . I)

Table II- Relative retention time of TMS derivatives of nucleic acid component (liquid phase, apiezon L).

Column temperature (®C) 180 230 240

Flow rate (ml/min) 80 69 78

Uracil 0.07

Thymine 0.10

Cytosine 0.18

5-Methyl cytosine 0.20

Orotic acid 0.43

Purine 0.23

Hypoxanthine 0.74

Adenine 1.00 (a) 1.00 (b) 1.00 (c)

Theophyine 1.52

Xanthine 1.60

Guanine 2.69 2.04

Uric acid 2.47

Deoxyuridine 4.23

Thymidine 4.85

Deoxyadenosine 10.50

Deoxyguanosine 16.85

Nebularine 3.80 3.71

Uridine 4.73 4.6

Cytidine 15. 54 13.2

Inosine 7.08 6.7

Adenosine 8.62 8.6

Xanthosine 9.12 8.3

■Guanosine 13.15 12.1

y-UMP 9.74

3^-AMP 17.24

3^-GMP 24.39

UMP 13.01

IMP 19. 56

AMP 23.7

GMP 26.81

TMP 13.27

Retention time of adenine: (a) 10.4 min, (b) 1.3 min, (c) 0.82 min Column: 5% apiezon L, Celite 545, 60-80 mesh

90 # • ^ ：GLC 로 없 량a s ® ：융의 5•하 VoK 18, No. 2

#

F ig. 1- Chromatographic conditions: 7.5° (사l)/m in temp, program from 90° /ig to 200® with a delay of 4 min; Flash temp. 260°

Attenuation, 10x S. Column: lm x4 in m I.D. Pyrex, 10% SE-30 on Supelcoport (100—

200 mesh). Silylation conditions ： 10 each in reaction vial; 100 BSTFA; 100 jwl acetonitrile; at 150® for 15 min; 4 mcl (ca. 200ng of each base) were injected.

T able I I I —Relative molar using a FID*.

response of the TMS derivative of purine and pyrimidine bases

Compound Retention temperature RMR*> S.D."

Uracil 120 0.67 0.010

Thymine 130 0.68 0.012

Purine 140 0. 38

Cytosine 148；161 0.54

5-MethyI cytosine 152；165 0.45

Hypoxanthine 176 0.58

Adenine 185 0.60 0.004

Xanthine 202 0.71

Guanine 211 0.72 0. 006

Phenanthrene, IS. 172 1.00

Chromatographic condition; Boronsilicate column 1 m x 4mm 496 SE-30, Chromosorb G 60-80 mesht Column temperature: 95°—►(6.7°/min) increase

Carrier gas: N2 gas 80 ml/ml/min Injection temperature; 80°

Detector temperature: 25® (FID)

ss봤 켰 융 의 을 '조 ® 하 는 데 는 토 인 와 $ 클 6상인 외머 가 있 을 수 있 다 . 인 의 미 로 는 앞에서 기 술 한 바 와 같이 가 가 장 S 황 한 요 인 이 며 또 한 어

떤 융 인 가 를 알아내 야 만 한 다 . G C 에 서 는 주 로 과 하여 이 나

로써 하는 것이 많았으나 최근에는 G C와 fife 연결되 어 직접 ffSEi하 는 ：f 3 m 이 점차 많아지고 있다. G C와 IR 37* 또는 GC와 Mass38), G C-N M R37)등은

외 T .M .S .R 떨11의 S i g 를 'ft토하는데 팬 f iK i인 위력을 I I 불하고 있다. 특히 GC-Mass같 은 경우는 gas chromatogram상 ^ 술 가 안되 었을 경우에도 아주 짧은 확 Pel에 정 점 부 근 만 - 을 * s w t e 한 것이 휴 i M 라 하겠다.

그러나 균 * 으 로 SSIS을 못할 경우에는 I B t 한 f i 했을 알 수 ^ 없는 것 이 다. G C & 이 법r 달하기 이전의 방범' 또는 병용하고 있는 으로써는 황켰융을 텔 * 나 nucleoside- 또는 nucleotide등와 fg ：g■꾸로 하여 균떻:S'W 이 나 기 타 PPC., TLC, ion exchanger, electrop-

horesis로 융g|한 참 이 나 바 대 또는 를 f W 하 는

등을 하여 달f i S f F 을 하고 있다. 이 어느 것이나 GC& 에 i t 하면 f i f F 이 활 하 고 ,，

융 ® 후 giJg로 균* S f F 을 하여 야 하나 , GC출은 토 * 조작을 따로 함이 없이 직접 자 농 하 다는 점에서 결혜하다.

그러 나 을 JtRK:9'®P하는 S f F ：& & 에 따라서 융과. A , 즉 fij® 도 달라질 수 있 다 는 - 점이 다. ® 텔* ® 가 s a w 으로 iif 5 •된다고삼* 보고되 어 있고 또 가 장 많 이 ' 쏘이고 있으나, ® 1 ： 켰융 취급시는 오히 려 enzyme« ) 을 사용하는 이 에는 ■많이^

fijffl 되고 있다. 초j® 융만을 취급시에는 아직도 될 텔 * 빨 이 번용되고 다•

풀 콜 는 sample Im g ( S - R N A ) 에 70% H C IO4-Iml을 J u 하 고 렷 R 7 jC ® _ h 에 서 1R#H 월시 킨 ® 8M 의 K O H 참 됐 으 로 냉 각히;면서 수 I n 시 커 고 텔 하 여 상 등 액 을 io n e x c h a n ­ ger (form ate type, 1 0 0 ~ 2 0 0 m esh, dowex 1X2) 에 황 # 시 키 고 증 류 수 로 수 세 한 후 I M H C O O H 로 용 출 시 켜 내 었 다 . 용 출 된 을 rotary evaporator로 건 조 한 후 s ily la tin g a g e n t (B S A ) 로 T .M .S .K | » 텔 를 만 들 어 G C 에 i S A 했 다 . •

G C f e 에 서 는 ^ 4 | t # ! t 로 하 는 이 대 부 분 이 며 그 중 에 서 도 * 1;으 로 y p f i：

하 는 f t 이 가 장 간 편 한 으 로 f ijffl된 된 다 . 그 러 나 G C f e 에 서 는 일 정 한 별{수을 유 지 시 키 . 거 나 1회 의 K후4 S IA이 거의 조Tilts하 므 로 후 fe ® 에 대 한 f f l f t f i로 f t » 을 하 게 된 다 .

G erke나 T . H ash izu m e 는 표 준 물 질 로 p h e nanthren e을 해 왔 으 나 t t l i l 한 바 와 같 ' 이 뿔 ;g 는 H . Y u k i가 시 도 하 는 barbituric acid를 1렸 하 여 왔 다 . ftMCB# 몰 텔 J g t t 는 다 옴 과 같이 구 한 "놓.

A rea b Area b R M R b/ I . S = ^ ^ ^ . ° /M - W . M ^le s_B _

A rea t.s A rea i ，s

June, 1974

m .

G ram s i.s /M .W ' i-s M ole R M R ; relative m olar response

Area b； area chrom atographic peak for the base

92 # • S ： G L C 로 했 황 텔 $ ^ 융 외 하 Vol. 18, No. 2

#

Area i-s； area chromatographic peak for internal standard M .W .; molecular weight

즉 f t 해 ® ? 에 대한 기지물질로 미러 R M R 을 구해둔다면 그 다움부터는 f t 해®

.과 R M R 로 부터 를 » t i j 할 수가 있다. 또한 렸 추 의 오차도 막을 수가 있다.

J U i 과 같은 에 의한 S 빨 의 T M S릉* i i 와 I쳐315별 과 외 R M R 을 본다면 Fig. 2, Table IV 와 같다,

lO^C/min

Fig. 2. —Analysis of the purine and pyrimidine base in the yeast s-RNA.

Column: Boronsilicate glassS m m x Im 3% OV-I, Gaschrom Q, 80—*100 mesh Oven ： 80"—26CT (lOVm in)

Injection; 250°—300®

Detector ： FID Carrier gas 40—60 ml/min

#

Table IV- RMR of the TMS-Derivatives of purine and pyrimidine base.

Compound Retention temperature RMR

Uracil 106°C (120) 0.575 (0.67)

Thymine 116"C (130) 0.493 (0.68)

Cytosine 128®C (148) 0.346 (0.54)

Adenine l e r c (185) 0.310 (0.60)

Guanine 222°C (211) 0.342 (0.72)

Barbituric acid 135X ( - ) 1.00 ( — )

Phenanthrene - (172) — (1.00)

햇빨의 ：5II7K；9■월 ; 을 T M S ^ 황f출로 만들어 G C 에 f t A 황 숨 1 ；의 출가 많이 날 때 는 곤란한 경우가 있다. 즉 텔K 를 낮추면 ® 1 ；켰융이 검출되지 않고 를 높이 면

chartlE에 scale out이 되어 설지 H•블이 차tg 할 때가 있다. 이런 경우는 우선 S

# June, 1974 m m m ⁹³

m

향인 결 ® ® « t t t B 을 f O T 하 던 가 아 니 면 현 ® K 층 가 큰 씀 « 를 몇 번 에 의 하 여 t S a 켰 융 의 'ift* 를 으 로 높일 수 가 있 다 .

또 한 G C J L 에 서 도 t f ® 에 의 하 여 ■린tB 하 다 . (F ig . 3, T able V )

F ig. 3~0ff-chart chromatographic peak.

Table V —The relative values of ^ and K.

#

^ K ^ K iS K

0.100 1.001 0.450 1.070 0. 680 1.481

0.145 1.002 0.455 1.073 0.685 1.503

0.170 1.003 0.460 1.076 0.690 1.528

0.185 1.004 0.465 1.079 0.695 1.553

0.205 1.005 0.470 1.082 0.700 1.581

0.215 1.006 0.475 1.086 0.705 1.609

0. 225 1.007 0.480 1.090 0.710 1.640

0.240 1.008 0.485 1.093 0.715 1.673

0.245 1.009 0.490 1.097 0.720 1.708

0.255 1.010 0.495 1.101 0.725 1.745

0.265 1.011 0.500 1.106 0.730 1.786

0.270 1.012 0.505 1.110 0.735 1.828

0.280 1.013 0.510 1.115 0.740 1.875

0.285 1.014 0.515 1.120 0.745 1.924

0.290 1.015 0.520 1.125 0.750 1.^78

0.295 1.016 0.525 1.130 0.755 2.035

0.300 1.017 0.530 1.135 0.760 2.098

0.305 1.018 0.535 1.141 0.765 2.166

0.310 1.019 0.540 1.147 0.770 2.239

0.315 1.020 0.545 1.153 0.775 0.320

-0.320 1.021 0.550 1.159 1.173 2.408

0.325 1.022 a 555 1.166 1 ■ 0.785 2.504

-■0.330 1.023 0. 560 0.780 0.790 2.610

94 S ： GLC 로 없 ^ 텔£ 밝S •의 하 Vol. 18. No. 2

0 .335 1.024 0 .565 1.180 0 .795 2 .722

0.340 1.025 0 .570 1.187 0 .800 2 .857

0.345 1.027 0 .575 1.195 0 .805 3.001

0.350 1.028 0 .580 1.203 0.810 3.162

0 .355 1.029 0 .585 , 1.212 0.815 3.342

0 .360 1.031 0 .590 1.221 0. 820 3 .546

0 .365 1.032 0 .595 1.230 0.825 3.776

0 .370 1.034 0 .600 1.240 0 .830 4 .038

0 .375 1.036 0 .605 1.250 0 .835 4 .339

0 .380 1.037 0.610 1.261 0 .840 4 .685

0 .385 1.039 0.615 1.272 0 .845 5 .088

0 .390 1.041 0 .620 1.284 0 .850 5 .559

0 .395 1.043 0 .625 1.296 0. 855 6.116

0.400 1.045 0 .630 1.309 0 .860 6.779

0 .405 1.047 0 .635 1.322 0 .865 7 .578

0.410 1.049 0 .640 1.337 0 .870 8 .552

0.415 1.051 0.645 1.351 0 .875 9.754

0 .420 1.054 0 .650 1.367 0 .880 11.26

0 .425 1.056 0.655 1.384 0 .885 13.17

0 .430 1.059 V 0.660 1.401 0 .890 15.65

0 .435 1.061 0 .665 1.419 0 .895 18.93

0 .440 1.064 0 .670 1.439 0 .900 23.38

0.445 1.067 0 .675 1.459

K=Sf/Sr 2 X , . y ,

? = '

Sr

K = m = ^ %

S f

S r

： 보이 지 않 는 부 분 까 지 •슘한 완 전 한 모 양 의 H 월 .

기 록 지 에 만 남 은 부 분 외 면 적 . 즉 그 림 에 서 사 선 을 친 부 분 의 E ® . 무 게 로 써 f ' i S 하여 f t » 한 다 . )

； 황 으 로 부터 기 록 지 의 상단의 절 단 된 융 까 지 의 거 리 . 기 록 지 외 폭 .

t t » 의 * ) ¥ 는 X , 와 및 <5,로 부터 ^를 I+ ® 하 고 가f i 로 부터 Table V 에서 면 에서 5 / 를 구 하 게 된 다 .

Xc Y r .

(모 든 온 -

#

m

m

울 m

G C ffi의 a ® 에 따 라 거의 슘 t H G C 켰에 의 하 여 이 하 ^

게 되 었 으 며 , s ；9 ■구 f t 슘 # ; 이 나 ^ 쌓 , 의 JH7JC융 ® 에 외 하여 ~ 0 H , - N H a , N H , ~ S H a 를 갖 는 f i 융 ? t ；H 로 만 된 다면 T .M .S .룹 뽑 i f 에 의 하여 거 의 다 가 G C

#

June, 1974 황 루 솔 95

s 으 로 가 능 하 다 는 것 을 암시해 주 고 었 다 .

타 처 리 기 술 뿐 만 이 아니 라 « S S 의 됐 a 로 G C - M ass, G C - IR , G C - N M R 름 의 원 숨 에 의 하 여 펠 J P t / S 없 이 도 G C 로써 혈 j g 의 i t 토 •■ ft® 이 과 ® 해 졌 으 며 더 욱 전 자 계 산 기 의 연 결 로 g f f i 로 I S ® 단계에 있 다 . 물 론 황 ; 에 있 어 서 는 pyro-gas chrom atography*® »=o>도 g ：f

^ 를 하 고 있 으 나 , 역시 JiyJc융 ® 에 의 하 여 T M S K « t i 로 하여 G L C 를 하 는 편 이 좋 을 것 으 로 사 료 된 다 .

앞 으 로 는 g 빨 수 중외 에 W 호 가 집 중 될 것 으 로 추 측 되 며 , 이 러 한 경 우 는 ：5n7jC 도 ® 이 나 a lk a li등의 강력 한 ; 보 다 는 E n zy m e 을 체 ffl하여 하 는 편 이 좋 은 롱 를 가 져 을 것 으 로 사 료 된 다 .

m s G C S 에 의한 텔 ®는 g 빨의 텔a ,®융에 있어서는 3xl0-i"m ole이 라고 하 나 른 m

#§의 된K 에 비하면 상당히 높은 편이나 AvogadrolHl 버하면 아직도 요원한 것 같 다 .

H. S. Loring, in ''The Nucleic Acids'', Ed. by Chargaff & Davidson, Vol. I, Academic P r e s s , 1955, p-199

2. E.

3. K.

4. J. ： 5. F.

6. S. ： 7. W.

8. G.

9. R.

10. H.

11. J. ： 12. J. ： 13. R.

14. R.

15. T.

16. Y.

17. T.

18. T.

19. T.

20. W.

21. w . 22. D.

23. H.

L. Hancock, D. L. Coleman, Anal. Biochem., 10, 36 (1965) L. Hancock, J. Gas Chromatog,, 4, 363 (1966)

Hashhume, Y. Sasaki, Anal. Biochem,, 15, 199 (1966) Sasaki. T. Hashizume, Anal. Biochem., 16. 1 (1966) Hashizume, Y. Sasaki, Anal. Biochem., 15. 346 (1966) Hashizume, Y. Sasaki. Anal. Biochem., 21. 316 (1967)

Hashizume, Y. Sasaki, Protein Nucleic Acid Enzyme, 13, 735 (1968) Gehrke and D. Ruyle, J . Ckromatog., 38, 473 (1968)

Gehrke and D. B. Lakings, J . Chromatog., 61 54 (1971) B. Lakings and C. W. Gehrke, J , Chromatog. 62. 347 (1971)

Yuki, et al.. Analytical part. The 94th Annual meeting of the Pharmaceutical S ociety o f Japan, 1974

96 # • S ： GLC 로 텔* 많 5 *의 중하 Vol. 18, No. 2 C. C. Sweeley, R. Bentley, M. Makita, and W. W Welles, J , Amer. Chem. Soc., 85, 2497 (1963)

D. F., Zinkel M. B. Lathrop and L. C., Zank J . Gas Chromatog., 6, 158 (1968) S. H. Langer, P. Pantages and I. Wender, Chem. Ind., 1958, 1664)

T. Luukkainen, W. J. A. Vanden Heuval, E. 0. A. Haahti, E. C. Horning, Biochem. Biophys.

Acta., 52, 599 (1961)

A. K. Ruhlmann and W. Giesecke, Angew, Chem. 73 113 (1961) I. Tomida, Protein Nucleic Acid Enzyme, 12, 1069 (1967) R. C. Mehrota B. C., Plant, J . Indian Chem. Soc,항 40, 623 (1963) J, L. Speier, J . Am. Chem. See,, 74, 1003 (1952)

C. A. Burkhard, J. V. Schmits and R. E. Bwinett, J . Am. Chem. Soc., 75, 5957 (1953) M. M. Sprung and L. S. Nelson, J . Org. Chem., 20* 1750 (1955)

M. M. Sprung. J . Org. Chem., 23. 58 (1958)

T. Nishimura and I. Iwai. Chem. Pharm, B ull., 12, 352 (1964)

C. W. Gerke, D. L Stalling, and C.D. Ruyle, Biochem. Biophys, Res. Comm., 28. 869 (1967) W. Funasaka, Modern Gas Chromatography'^ Vol. Ill, 1971, p. 219, Hirokawa Publishing Company, Tokyo.

J. A. Mccloskey, A. M. Lawson, K. Tsuboyama. P. M. Krueger, and R. N. Stillwell, J . Amer.

Qiem. Soc,, 90. 4182 (1968)

E. Chargaff, E. Vischer, R. Doniger, C. Green, and F. Misani, J . Biol. Chem., 177, 405 (1949)

J. D. Smith, and R. Markham, Biochem. J ., 46, 509 (1950) G. R. Wyatt, Biochem. J ,, 48, 584 (1951)

J. Marmur, and P. Doty. J , Mol. Biol., 5, 109 (1962)

W, Guschlbauer, £ . G. Richard, K. Buerling, A. Adams and J. R. Fresco, Biochemistry, 4, 964, (1965)

A. Marshak and H. J. Vogel, BioL Chem., 189, 597 (1951) R. H. Hall. J . Biolog, Chem., 237, 2283. (1962)

B. Rudenko. J , Chromatog, Scien., 10, 230 (1972) A. Rudenko, Zh. Analit, Khim. 23, 341 (1968)

A. Rudenko, A. A. Noravyan and V. F. Kucherov, Zh. Analit, Khim,, 23. 114 (1968) 288 (1969)

54 (1964) Turner, Analy. Biochem.황 28,

Perry, J , Gas Chromatog,^ 2,

#