SELEX 기술은 무작위로 합성된 올리고뉴클레오 타이드 복합체로부터 표적물질과 친화력을 가지는 소 수의 개체를 in vitro 상에서 선별하는 과정이다. 앱타 머 발굴을 위한 SELEX는 1990년 Larry Gold에 의 해 고안되었고, 동일한 방법으로 저분자 화합물로부 터 고분자 단백질에 이르기까지 다양한 표적물질에 친화력을 가지고 결합할 수 있는 앱타머를 발굴할 수 있음이 발표되었다. SELEX 방법에서 이용되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 복합체(library)는 >1015 의 다양한 염기서열을 포함하고 양 말단에는 PCR (polymerase chain reaction)을 위한 primer 서열을 가지는데 이들은 solid-phage phosphoramidite chemistry를 통해 만들 수 있다. 만들어진 앱타머 library에는 표적물질과 강한 결합력을 가진 소수의 개 체들이 존재할 것으로 기대된다. 표적물질과 결합한 개체들은 결합하지 않은 개체들과 구별되어 증폭되고, 경우에 따라 RNA로 만들어져 5~15회 반복 과정을 거쳐 선별된다[그림 1]. SELEX의 전반적인 속도는
“목적물질에 결합하고 있는 앱타머를 얼마나 효율적 으로 정교하게 선별해낼 수 있는가?”하는 앱타머 선별 방법에 따라 좌우된다. 즉, 반복된 실험과정을 효과적 으로 단축하면서 친밀도가 높은 앱타머를 선별하는 것은 SELEX 기술의 발전을 주도할 수 있을 것이다.
앱타머 선별 기술
Traditional methods: Filtration과 affinity column method 1990년 nitrocellulose filtration에 의한 SELEX 방 법이 소개된 이후 다양한 앱타머 선별방법이 소개되 고 있지만, 현재에도 가장 광범위하게 응용되고 있는 것 또한“filtration method”와“column method”이다.
Nitrocellulose membrane을 이용한 SELEX 방법은 표적물질과 친화력이 있는 개체들은 복합체를 형성하 여 필터를 통과하지 못한 채 남아있게 되지만, 결합하 지 않은 개체들은 필터를 통과하게 되고 복합체들로 부터 분리되어 다음 SELEX 과정에는 참여하지 못하 도록 배제하는 방법이다. 이와 더불어 affinity column method는 표적물질이 다양한 방법으로 column상에 고정되도록 한 뒤, 랜덤 핵산 library를 흘려보내는 방법으로 친화력이 없는 개체들이 표적물 질로부터 분리되고, 결합된 개체들은 column으로부 터 분리되어 다음 단계의 SELEX 과정에 참여하게 된다. 이러한 SELEX 방법들을 이용해서 다양한 표 적물질을 대상으로 선별된 앱타머들이 보고되고 있다.
특히, 펩타이드 또는 환경호르몬과 같은 저분자 물질 의 경우 앱타머 선별 시 affinity column은 아주 유용 한 방법으로 이용되고 있다. 하지만 이들 전통적인 SELEX 방법들의 공통점은 낮은 분별능으로 인해 오 랫동안 반복된 SELEX 과정을 겪어야 한다는 것이 안지영, 김소연
동국대학교 의생명공학과 [email protected], [email protected]
그림 1. SELEX 모식도(Scheme taken from Dukehealth1.org http://www.molgen.mpg.de/~in-vitro/technology.html).
특·별·기·획(Ⅰ)
다. 이것은 앱타머 선별을 위한 시간이 오래 걸림을 의미할뿐더러 많은 양의 시약 소모와 실험자의 반복 된 노력이 요함을 알 수 있다.
Capillary electrophoresis (CE)-SELEX
Filtration이나 column을 이용한 앱타머 선별 방법 이 랜덤 핵산 library로부터 표적물질과의 높은 특이 성을 가진 앱타머를 골라내는데 매우 비효율적임에 따라 선별의 효율성을 증대시킨 새로운 방법들이 소 개되고 있다. CE-SELEX는 액체상에서 앱타머-표적 물질 결합체를 capillary electrophoresis를 이용해서 분리해내는 방법으로, 결합체와 비결합체와의 이동속 도 차이를 이용하여 2-4 round의 SELEX 실험으로 앱타머가 선별될 수 있음이 보고되었다. 그 예로 IgE 단백질에 대한 앱타머가 CE-SELEX 방법을 이용해 서 4 rounds에서 선별되었는데 이를 위해 40.2cm의 poly-coated CE를 사용하였으며, 단백질과 결합하지 않은 앱타머 library는 결합체보다 빠르게 이동함에 따라 시간차이를 두고 단백질-앱타머 결합체를 따로 분리하고 증폭하여, 다음 단계의 SELEX에 이용하 였다.
Bead를 이용한 앱타머 선별
일반적으로 filtration, 혹은 column을 이용한 SELEX 과정에서 앱타머 선별에 따른 효율이 낮은 것은 랜덤 핵산 library로부터 표적물질과 앱타머 결
합체를 효과적으로 분리해내지 못하기 때문이다. 또 한 affinity column의 경우 filtration 방법 보다는 affinity 측면에서 진보된 형태이긴 하나, SELEX 과 정 특성 상 반복 실험 단계마다 일정하게 column을 준비하고, 유지하는 것은 쉬운 일이 아니다. 더불어 표 적물질에 강하게 결합하고 있는 앱타머의 경우, 실험 자의 입장에서는 이러한 강한 결합력을 가진 앱타머 를 선별해내고자 하나 column으로부터 분리해내는 것이 어려울 수 있다. 따라서 이런 한계점을 극복하고 손쉬운 선별방법으로 Stoltenburg et al은 표적물질 (단백질)을 magnetic bead에 고정하는“FluMag- SELEX”를 고안하여 SELEX에 응용하였다. 물론, magnetic bead를 SELEX 과정에 도입한 것은
그림 2. Schematic of the conventional SELEX process.
그림 3. CE-SELEX process.
그림 4. FluMag-SELEX.
FluMag-SELEX 방법 이전에 Bruno et al에 의해 2002년 보고되었는데, 그들은 biotoxin을 magnetic bead에 conjugation시켜 DNA 앱타머를 효율적으로 선별해낼 수 있었다. 그러나 FluMag-SELEX는 표 적물질에 결합된 앱타머를 랜덤 핵산 library로부터 분리하기 위해 자석을 이용하여 손쉽게 분리할 수 있 을 뿐만 아니라, 5’-modified primer를 이용하여 PCR 로 증폭된 DNA 앱타머가 SELEX 단계 중 몇 round 에서 선별되고 있는지 fluorescent activity를 측정하 면서 모니터링 할 수 있도록 고안되었다.
이와 유사한 방법으로 Jeffrey와 Nicolas는 목적단 백질이 고정되어있는 single microbead를 이용해서 타겟에 대한 ssDNA 앱타머를 손쉽게 선별할 수 있는 easy-to-execute approach을 제시하였다. 그들은 과 감하게 target의 양을 감소시키기 위해 single bead를 SELEX에 이용하였고, 때문에 보다 강력하고 선택적 결합력을 지닌 소수의 앱타머를 선별할 수 있었음을 강조하였다. 이들은 Botulinum Nerotoxin의 heavy chain peptide를 Tentagel/Agarose에 고정한뒤 single bead를 취하고, 이와 단일가닥 DNA library를 반응시켜 fluorescence stereomicroscope로 wash 단 계에서 앱타머와 결합한 microbead가 소실되지 않도 록 모니터링하고, 선별하여 2 cycle 뒤 8개의 앱타머 염기서열을 분석하였다. 선별된 앱타머 중에는 neurotoxin과 리간드 사이의 binding을 저해하는 앱 타머가 있어, 치료제로서 응용 가능함을 밝혔다.
Cell-SELEX
Cell SELEX는 정제된 단백질을 대상으로 하는 SELEX 방법과 달리 살아있는 세포 전체를 대상으로 SELEX를 수행함으로써 세포 표면에 존재하는 단백 질이나 구조에 가장 결합력이 높은 앱타머를 선별하 는 방법을 말한다. 현재 대부분의 세포 표면 수용체에 대한 앱타머 개발은 대장균 등에서 과발현을 통해 정 제된 단백질을 이용하여 이루어지고 있다. 그러나 치 료제로서, 혹은 in vivo 진단마커로서 앱타머를 이용 하기 위해서는 post-translational modification 등이 이루어진 상태인 생체 내 단백질의 원형을 인지할 수 있어야 한다. 그러나 단순히 cell-SELEX를 수행할 경우 세포 표면에 위치한 수용체 및 표면 단백질들의 종류가 너무 복잡, 다양하여 원하는 표적 수용체 단백 질에 결합하는 앱타머를 골라내기 어렵다. Cerchia et al은 RET receptor tyrosine kinase에 결합하는 앱타 머를 선별하기 위해 먼저 RET receptor를 세포 표면 에 과발현 되도록 유도하고 이들만 취하여 SELEX를 수행하였다. 이러한 방법은 glycosylation 등이 정상적 으로 이루어진 표적 단백질에 대한 앱타머를 얻을 수 있기 때문에 향후 많은 분야에 응용이 가능하다. 실제 로 최근에는 cell-SELEX를 Tumor의 진단으로 혹은 치료제로 사용하기 위해 형광물질을 접목시켜 생체진
그림 5. A schematic of the
“single microbead” SELEXapproach. 그림 6. Cell-SELEX 방법.
특·별·기·획(Ⅰ)
단으로 사용하거나 drug delivery를 위해 nanoparticle을 사용한 예가 있다. 과거 암 진단으로는 세포의 모양새 나 조직변화에 의해 판단하였으나 Tang et al은 Burkitt’s lymphoma cells만은 선택적으로 강하게 결합 하는 앱타머를 Cell-SELEX법으로 개발하여 암 진단 으로 사용하였다. 또한 이들은 앱타머와 nanoparticle, control-release polymer system을 접목시켜 암세포만 은 선택적으로 치료할 수 있는 발판을 마련하였다.
SELEX-on-a Chip
지금까지 살펴본 모든 경우에서 SELEX 기술의 궁 극적인 목적은 표적물질과 높은 결합력을 가지면서 선택결합을 하는 앱타머를 발굴해내는 것이다. 하지 만 정제된 단백질의 경우 세포 내에서와는 다른 환경 때문에 쉽게 변성되기도 하고 따라서 활성을 잃기도 한다. 이러한 까닭에 반복된 SELEX 실험에서 매회 안정된 환경을 유지시켜야 함은 물론 신속한 손놀림 또한 필요로 한다. 따라서 많은 SELEX 연구자들은 보다 안정된 표적물질의 고정화에 초점을 맞추면서 더불어 SELEX 실험의 반복성을 줄일 수 있도록 노 력하고 있다. Sol-gel은 단백질과 같은 biomolecules을 고정화하고 외부환경에 쉽게 변성되지 않도록 단백질 성질을 유지시켜주는데 효과적인 물질임이 보고되었 으며, 또한 이들은 일정한 나노 크기의 구조물을 형성 함에 따라 내부에 고정된 단백질과 외부에서 유입되 는 물질과의 접촉을 용이하게 할 수 있다. 이런 성질 을 이용하여 Kim et al은 sol-gel을 기반으로 한 단백 질 칩을 개발하여 protein-protein interaction 혹은 antigen-antibody interaction이 가능함을 밝혔다.
Sol-gel matix에 고정된 단백질은 수개월 동안 안정 하게 보존될뿐더러 활성을 잃지 않기 때문에 SELEX 실험자들의 오랜 고민을 해결해 줄 수 있는 해결책이 될 수 있다. 또한 이것을 chip에 응용할 경우 매우 적 은 양의 단백질, DNA/RNA library를 사용하면서 높 은 결합력을 가진 앱타머를 선별해 낼 수 있는 tool로 상용화가 가능하다. 동국대학교 나노바이오진단연구
실에서는 microfluidic system 기반의 SELEX-chip 을 개발하고 단백질 고정을 위해 sol-gel 기술을 접목 하여 chip으로부터 실제 SELEX가 가능함을 선보였 다. 또한 이들에 의해 개발된 SELEX-chip에는 서로 다른 단백질을 고정할 수 있기 때문에 한 번에 여러 개의 다른 단백질에 대한 SELEX가 가능하였다.
Automated SELEX
SELEX 방법은 in vitro 상에서 각 단계마다 PCR 에 의한 증폭과정, 증폭된 DNA를 정제하는 과정, 단 일 가닥 DNA를 만들기 위한 asymmetric PCR과정, 경우에 따라 RNA를 만들기 위한 in vitro transcription 등의 복합적인 실험들이 한데 어우러져 표적물질에 높은 선택 결합력을 지닌 소수 개체의 앱 타머를 선별하는 과정이다. 일반적으로 10 cycles 이 상의 반복실험을 통해 앱타머를 선별하게 되는데 최 근에는 SELEX의 복잡한 과정들을 자동화 시스템과 접목시켜 한계점을 극복하고자 하는 시도들이 나타나 고 있다. 1998년 Cox and Ellington이 Biomek 2000 pipetting robot (Beckman Coulter)을 개발하고 처음 으로 SELEX 공정을 자동화하였다. 그들은 biotinylated lysozyme을 streptavidin이 코팅된 bead 에 고정시킨 뒤 그들의 자동화 설비를 이용하여 수 회 반복된 SELEX 방법을 자동화하였고 앱타머를 선별 하는데 성공하였다. 하지만 그들의 자동화 공정은 단 순히 pipetting을 자동화한 것으로 전 SELEX 공정
그림 7. Sol-gel microfluidic chip 기반 SELEX.
을 자동화한 것은 아니었다. 이후 자동화 공정은 점차 발전하여, 최근에는 microfluidic system을 응용한 SELEX prototype이 소개되었다. Hybarger et al은 microfluidic, microline-based assembly라고 하는 소 형 SELEX tool을 개발하고 이 시스템 내에서“start to finish”SELEX(DNA pool →in vitro transcription→
selection →RT-PCR →DNA amplicon)가 가능하도 록 하였다. 만약 이와 같은 시스템이 cloning, sequencing 기술과 연계된다면 앱타머 서열분석에서
구조분석까지 전자동화가 가능할 것으 로 기대된다.
맺음말
SELEX 방법은 nitrocellulose filter binding assay가 1990년 사용된 이래로 현재까지 약 20년 동안 지속적으로 발전 하고 있다. 이런 방법들의 최종 목적은 표적물질과 강한 친화력을 가진 앱타머 를 짧은 시간 내에 정교하게 선별하는 것이다. 이것은 표적 물질의 고정화 방법에 따라 좌우 되는데 최근 보고된 sol-gel microfluidic SELEX는 저분자 유기화합물질에서 고분자 생체물질의 고정화 에 이르기까지 안정한 상태로 표적물질을 고정할 수 있을 뿐만 아니라 microchip으로 응용 가능하였다. 특 히 이들은 자동화 시스템에서 소형 모듈로서 만들어 질 수 있으므로 상용화가 가능한 장점을 가지고 있기 때문에 향후 다양한 분야에서 응용이 이루어질 것으 로 예상된다.
이 장에서는 분자인식물질로 앱타머를 사용하는 전 계효과 트랜지스터(field effect transistor: 이하 FET) 센서 및 이를 이용한 단백질이나 미생물 검출센서에 대해 다루도록 하겠다.
원래 FET는 소스전극과 드레인 전극, 그리고 제 3 의 전극인 게이트 전극으로 구성되며 소스와 드레인 사이에 형성된 채널에 흐르는 전류의 양이 제 3의 전 극인 게이트에 의해 조절되는 장치를 뜻한다. 그런데 이 때 제 3의 전극인 게이트에 전압을 걸어주는 대신,
게이트에서 생기는 화학반응에 의해서도 채널의 전류 를 조절할 수 있다. 즉, 게이트에서 생기는 화학반응에 의해 채널의 전류가 변화할 수 있다. 이와 같은 형태의 FET를 chemical field effect transistor, ChemFET 라고 부르며 화학센서 또는 바이오센서로 주로 이용 된다. 이와 같은 ChemFET는 가스분자나 용액 중의 이온 등을 검출하는데 사용되며 특히 이온을 검출하 는데 사용되는 센서를 ISFET(ion-sensitive field effect transistor), 효소를 인식물질로 사용하여 화학
그림 8. Operational diagram of the microfluidic SELEX prototype device.
FET multiplexing
이 정 오
한국화학연구원 융합바이오기술연구센터 [email protected]
