Cultural characteristics and antioxidant activity of wild-type collections of Hericium erinaceus

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J. Mushrooms 2018 March, 16(1):9-15 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2018.16.1.9 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853

*Corresponding author E-mail : [email protected] Tel : +82-31-670-5420 Received February 14, 2018 Revised March 15, 2018 Accepted March 26, 2018

노루궁뎅이버섯 야생 수집균주의 배양적 특성과 항산화 활성

박순애¹ · 김선주² · 김하람² · 강희완^1,2,3,*

1한경대학교 미래융합기술대학원

2한경대학교 원예생명과학과

3한경대학교유전공학연구소

Cultural characteristics and antioxidant activity of wild-type collections of Hericium erinaceus

Soon-Ae Park¹, Sun-Joo Kim², Ha-Lim Kim², and Hee-Wan Kang^1,2,3,*

1Graduate School of Future Convergence Technology, Hankyong National University, Anseong 17579, Korea

2Department of Horticultural life science, Hankyong National University, Anseong 17579, Korea

3Institute of Genetic Engineering, Hankyong National University, Anseong 17579, Korea

ABSTRACT: This study aimed to characterize the mycelial morphologies of Hericium erinaceus isolates, including 18 wild-type collections and cultivatable species ‘Noru 1’ and ‘Noru 2’, in Korea. The morphological characteristics were used to classify the species based on aerial or branched mycelia and their brownish or whitish colors when grown on potato dextrose agar. Of the wild-type collections, the isolates KFRI 509, KFRI 1091, KFRI 1093, and KFRI 1623 showed faster mycelial growth than the cultivars ‘Noru 1’ and

‘Noru 2’. Moreover, 60% ethanol extracts of the fruiting body of the mushroom showed the highest phenol content and DPPH and ABTS radical scavenging activity. The DPPH and ABTS radical scavenging activities of KFRI 507, KFRI 508, KFRI 842, and KFRI 1623 were 10–60% higher than those of ‘Noru 1’ and ‘Noru 2’, depending on the extract concentrations. Thus, results suggest that these wild-type collections could be useful for breeding genetic sources or processed food materials with high antioxidant activity.

KEYWORDS: Antioxidant activity, Hericium erinace, Wild-type collections

서 론

노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceus)은 민주름버섯목 (Aphyllophorales), 턱수염버섯과(Hydraceae) 또는 산호침 버섯과(Hericiaecae), 산호침버섯속(Hericium)에 속하는 흰색의 목재부후균이며 가을철 활엽수의 고목이나 생목에

서 발생하며 영명으로 Lion’s man 또는 Monkey’s head mushroom로 명명되고 있다(Ko et al., 2005). 노루궁뎅이 버섯균주는 ITS-rDNA염기서열 수준에서는 안정적 유전 적 특성을 가지고 있으나(Rapid amplified polymorphic DNA (RAPD)를 이용한 PCR 핵산지문 결과 균주간 DNA 다형성이 검출됨으로 유전적 다양성이 큰 것으로 보고되어(Ko 2007; Moon et al., 2014) 균주간의 균학적, 생리적 특성이 다양할 것으로 추정될 수 있다.

노루궁뎅이버섯의 polysaccharide 성분은 면역, 항암, 항염증, 항균활성, 혈당감소, 코레스테롤감소 및 역류성 식도염에 유효한 것으로 알려져 있다. 특히, 치매의 예방 및 개선, 우울증, 기억력 향상 천연물질로는 최초로 노루 궁뎅이버섯에서 발견된 신경세포 증식인자(Nerve growth factor, NGF)합성 촉진물질인 헤리세논과 에리나신이 뇌 를 활성화시키는 효과가 있다는 사실이 밝혀지면서 관심 이 높아지고 있다(Kawagishi et al., 1996; Jo and Shin, 2017; Socol et al., 2016). 노루궁뎅이버섯 품종 ‘노루1’,

‘노루2호’가 육성보급되었으며 인공재배 기술이 개발됨에 따라 많은 농가가 재배에 참여하고 있으며 농가의 중요

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소득원으로 자리 잡고 있다.

생활수준과 소득수준이 향상됨에 따라 삶의 질 향상에 대한 많은 관심이 높아지고 있으며, 특히 노화와 암의 대 처방안으로 천연 항산화 물질 등의 생리활성물질 개발에 관심이 집중되고 있다. 활성산소는 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거 되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하 게 되며, 이러한 산화적 스트레스는 단백질, 세포막 및 DNA 등을 손상시켜 세포의 노화와 변형을 유도함으로써 다양한 인체질병의 원인이 될 수 있다(Jeong et al., 2007;

Jo and Shin, 2017). 항산화 식품이나 인체 내의 항산화 효소활성화로 활성산소의 유리기를 제거하여 산화와 항산 화의 균형을 유지하여 산화적 스트레스로부터 보호될 수 있다(Ji LL. 1993). 노루궁뎅이버섯의 다당체가 동물실험 에서 항산화 및 항비만작용에 유효기능을 하는 것으로 알 려져 있다(Han et al., 2013). 국내에서는 노루궁뎅이버섯 의 자실체를 이용한 열수 추출물의 항산화 기능과 효율을 보고 한 바 있으나(Kim et al., 2013) 대부분 현재 재배종 에 국한돼 다양한 야생 수집종에 대한 항산화활성평가는 미흡한 실정이다.

본 연구는 노루궁뎅이버섯 야생 수집종을 대상으로 배 양적 특성을 조사하고 항산화 효능을 비교분석하여 항산

화활성 우수균주를 선발하여 노루궁뎅이버섯 기능성 육종 소재와 생리 기능성 물질 및 바이오 소재 개발을 위한 기 초자료로 활용하고자 한다.

재료 및 방법

노루궁뎅이버섯균주

노루궁뎅이버섯 재배종 ‘노루1호’, ‘노루2호’는 경기도 버섯연구소에서 분양받았으며 18 야생수집균주 KFRI 349, KFRI507, KFRI508, KFRI509, KFRI582, KFRI842, KFRI843, KFRI844, KFRI1091, KFRI1092, KFRI1093, KFRI1095, KFRI1452, KFRI1453, KFRI1622, KFRI1623, KFRI1950, KFRI1951는 산림청 산림과학원(KFRI)로 부 터 분양받아 사용하였다. 본 연구에 사용된 재배종과 야 생 수집종 노루궁뎅이버섯균주는 Table 1에 기술되었다.

용매추출방법

자실체를 액체 질소에 넣고 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄 후 사용하였다. 자실체 3 g에 Ethanol 60%, Methanol 70% 200 ml 넣고 진탕배양기에서 130 rpm 속도로 25^oC 에서 24시간 추출하였다. 열수 추출은 동일한 자실체양에 증류수 200 ml를 첨가하고 95^oC에서 환류추출법으로 24 Table 1. Characteristics of Hericium erinaceum isolates used in this study

Isolates/ cultivars Collections Origin Mycelial

Growth rate(cm) Colors /Morphplogy

Noru 1 local variety MI¹⁾ 5.72 Brownish/ branched

Noru 2 local variety MI 5.97 Whitish / airial

KFRI 349 Wild type KFRI 9.0 Whitish / airial

KFRI 507 Wild type KFRI 1.15 Brownish/ condensed

KFRI 508 Wild type KFRI 4.68 Brownish/ branched

KFRI 582 Wild type KFRI 5.62 Whitish / branched

KFRI 843 Wild type KFRI 6.18 Whitish/ branched

KFRI 844 Wild type KFRI 1.17 Whitish / no airial

KFRI 1092 Wild type KFRI 4.65 Brownish/ condensed branched

KFRI 1452 Wild type KFRI 2.13 Whitish/ branched

1)Mushroom Istitute (MI), ²⁾Korean forest research Institute (KFRI )

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시간 추출하였다. 각각의 용매 추출물을 감압농축기로 10 배 농축하고 동결건조 하여 결정체를 10 mg/ml농도로 조 정하여 실험에 사용하였다.

균사체 배양 및 추출

Potato Dextrose Agar(PDA)배지에서 성장한 노루궁뎅이 버섯 균사체균사절편(5 mm × 5 mm)을 10개씩 취하여 PDB배지 200 ml에 접종하고 25^oC incubator에서 정치배 양하였다. 배양 20일 후 배양여액과 균사체를 증류수로 세 척 건조 후 액체질소로 마쇄한 균사체분말 2 g을 Ethanol 60% 100 ml에 혼합하고 위와 같은 조건으로 24시간 추출 하였다. 추출물을 1/10로 농축한 후 동결 건조한 결정체를 10 mg/ml로 농도를 조정하여 실험에 이용하였다.

균사체의 형태적 관찰

노루궁뎅이버섯 균주를 PDA 배지에 1차 접종하고 균 사체를 배양시킨 후 균사체절편(5 mm × 5 mm)을 취하여 PDA배지의 중앙에 2차 접종하고 2-4일 간격으로 균사체 직경을 측정하여 균사생장율을 조사하였다. 균사체 배양 적 특성은 균사생장 형태에 따라 기중균사형(Aerial type), 분지형(Blanched type), 응축형(condesed)으로 구분 하고 배지 내에 분비 색소 색에 따라 갈색형 (Brownish)과 무색형 (Whitish)으로 구분하여 특성을 조사하였다.

총 페놀함량

총 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위해 Folin- Ciocalteu’s 방법을 이용하였다(Wang et al, 1994). 노루궁뎅이 버섯 의 자실체 추출물을 1 mg/ml로 용해한 용액 40 µl와 0.2 N Folin-Ciocalteus 시약을 200 µl, Na2CO₃(7.5%) 160µl 을 혼합하여 암실에서 1시간 반응시킨 후 ELISA reader 를 이용해 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid 를 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.30 mg/mL의 농도로 하여 y

= 0.0049x − 0.0324, R² = 0.998의 정량곡선을 기준으로 폴리페놀 총량을 결정하였다.

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능 DPPH 라디칼소거능은 Blois의 방법(Blois, 1958)에 의하 여 DPPH 환원력을 측정하였다. 노루궁뎅이 추출시료 1.0 mL와 0.2 mM DPPH 용액 1.0 mL의 혼합액을 암소에서 30분간 반응시킨 후 Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH라디칼 소거 활 성은 시료 용액의 대조구와 시료 첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 산출하였다.

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 라디칼 소 거능

ABTS 라디칼 소거능 활성 측정은 Re R의 방법(Re R, 1999)을 이용하여 측정하였다. 7 mM ABTS용액과 2,45 mM potassium persulfate 용액을 혼합하고 25^oC 암 소에서 16시간 방치, ABTS 양이온을 형성시켰다. 그 후 Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용, 734 nm에서 흡광도가 0.700이 되도록 5 mM potassium phosphate buffer (pH7.4)를 이용하여 희석하여 사용하였다. 희석된 ABTS 용액 900 µl에 농도별로 희석한 시료 100 µl을 혼합, 5분 간 실온 정치 후 734 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

결과 및 고찰

노루궁뎅이버섯 야생수집균주의 배양적특성

노루궁뎅이버섯 재배종 품종 ‘노루1호’, ‘노루2호’와 야 생균주 18균주의 균사를 PDA에 접종하고 14일 후에 균

DPPH 라디칼 소거능 (%)=

대조구흡광도−시료첨가구 흡광도

× 100 대조구 흡광도

ABTS 라디칼 소거능 (%)=

대조구흡광도-시료첨가구 흡광도

× 100 대조구 흡광도

Fig. 1. Morphological characteristics of Hericium erinaceus isolates on PDA media.

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사 생장율과 균사체의 형태적 특성을 조사하였다. 재배종 품종 ‘노루1호’, ‘노루2호’(5.72 cm, 5.97 cm)보다 KFRI 349, KFRI 509, KFRI 1091, KFRI 1093는 30% 이상 높 은 균사생장율을 보였다. KFRI 507, KFRI 844, KFRI 1950는 균사생장율이 직경 2 cm 이하로 매우 느린 성장 률을 보였다. PDA상에서 균사체의 형태는 크게 부정형으 로 형성되는 분지형과, 균일한 기중균사로 형성되는 기중 균사형으로 나눌 수 있었으며 재배 종 중에는 ‘노루1호’

품종이 분지형으로 갈색색소를 생산하며 KFRI 1622, 842과 유사한 형태적 특성을 보였다(Fig. 1). ‘노루2호’는 는 기중 균사밀도가 전체적으로 균일하게 형성하였으며 배지에 색소를 형성하지 않는 Whitish형으로 KFRI 349, 580, 844, 1453, 1950균주들과 유사한 특성을 보였다. 그 밖의 균주는 짖은 갈색색소를 생산하는 Brownish형 균주 로 분지형(KFRI 1092, 1623)과 균사응축형(KFRI 1095) 으로 분별되었다. 본 연구에서 노루궁뎅이버섯 균주의 종 내에서 다양한 배양적 특성이 관찰되었으며 노루궁뎅이버 섯은 균주간 다양한 특성을 보유하는 것으로 확인할 수 있었다. Ko 등 (2007)은 균주간의 RAPD 분석에서 노루 궁뎅이버섯균주 간 유전적 다양성을 보고한 바 있어 형태 적, 유전적 다양성이 연관될 수 있을 것으로 사료되었다.

항산화 활성 추출조건

페놀화합물은 항산화 물질의 주요성분으로 알려지고 있 다 (Jeong et al., 2009). 따라서, 노루궁뎅이버섯의 총 페 놀성분을 측정함으로써 항산화 활성의 유효성분을 검정 할 수 있다. 추출 용매로 Ethanol 60%, Methanol 70%, 열수를 사용하여 노루궁뎅이 자실체분말로부터 페놀성분 을 추출하였으며 각 용매추출물의 총 페놀 함량을 Galic acid 정량곡선에 준하여 측정하였다. Fig. 2에서 Ethanol 60% 추출물은 3.12 mg GAE/100 g로 페놀함량이 가장 높았으며, 열수 추출물과 Methanol 70% 추출물은 각각 2.89와 2.76 mg GAE/100g로 Ethanol 60% 추출물보다 낮은 페놀함량이 검출되었다. 추출물을 10 mg/ml의 농도 로 조정하고 1/2 연계 희석하여 최저농도를 0.31 mg/ml로

하고 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 조사하였다.

DPPH라디칼 소거능은 Ethonol 60%에 추출물 0.31, 0.62, 1.25, 2.5 mg/ml에서 각각 24.78%, 38.49%, 64.84%, 95.47%로 농도의존적으로 높은 저해율을 보였다. 반면에 추출물 5, 10 mg/ml농도에서는 Methonal 70% 추출물이 각각 109.94%, 138.87%로 Ethonal 60%추출물보다 높은 활성을 보였다. ABTS 라디칼 저해율의 경우 농도 의존적 으로 열수>Ethonol 60%>Methonal 70% 추출물순으로 나타났다. 저농도에서는 열수추출물의 저해율이 높았으나 2.5 mg/ml 이상에서는 열수추출물과 Ethonal 60%추출물 이 유사한 활성으로 나타났다. 이상의 결과로 노루궁뎅이 자실체에서 Ethonol 60%추출물이 페놀함량과 항산화에 서 높은 활성이 높아 유효한 방법인 것으로 사료 되었다.

노루궁뎅이버섯 수집야생균주의 항산화활성

노루궁뎅이버섯 재배종 품종 ‘노루1호’, ‘노루2호’와 18 야생수집균주의 균사체를 Ethanol 60%로 추출하고 정량 하여 동일한 양으로 DPPH 와 ABTS 라디칼 소거능을 조 사하였다. DPPH 라디칼 소거능은 10 mg/ml 일 때 KFRI 507이 126.53%로 가장 높았으며, KFRI 842는 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31mg/ml일 때 각각 116.25, 103.68, 90.07, Fig. 2. Polyphenol content of different extracts from fruiting bodies of Hericium erinaceus.

Fig. 3. DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activity of different extracts from fruiting bodies of Hericium erinaceus.

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72.64%로 저해율이 가장 뛰어났다(Fig. 4). 농도가 10 mg/ml일 때 DPPH 라디칼 소거능이 가장 낮은 것은 저해율 48.68%인 KFRI 1091이며, KFRI 1951은 농도가 1.25, 0.62, 0.31 mg/ml일 때 각각 42.71, 37.15, 38.26%

의 가장 낮은 저해율을 보였다. ABTS 라디칼 소거능의 경우 DPPH 라디칼 소거능과 유사하게 KFRI 842균주에 서 1, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.031 mg/ml에서 각각 99.842, 99.667, 99.667, 97.833 %의 가장 높은 저해율을 보였다.

0.5 mg/ml에서는 99.731%로 KFRI 1092 가 KFRI 842보 다 더 높았고, KFRI 1623은 0.031 mg/ml에서 82.500%

로 가장 뛰어난 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. ABTS 저해율이 가장 낮은 종은 ‘노루1호’로 6구간의 농도에서 각각 75.556, 59.556, 44.778, 29.222, 18.333, 10.722%였 다. Ethanol과 열수추출이 항산화 활성 성분을 분리하는 데 유용한 추출법으로 사용되고 있으며(Kim et al., 2013), 열수추출 다당체는 동물실험에서 항산화효소활성

을 증가시키는 강력한 항산화활성의 역할을 하는 것으로 보고되었다(Han et al., 2013). Ethanol 추출물은 DPPH, superoxide anion-free radical에 90%이상 억제하는 강력 한 환원력이 있다 하였으며 lipid peroxidation을 60%이 상 억제능이 있다 하였다(Jiang et al., 2016). 따라서 항산 화활성은 저분자 페놀성분과 고분자 다당체 등 복합적인 화학성분이 관여할 것으로 사료된다.

결론적으로 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 통한 노루 궁뎅이버섯 야생균주의 항산화 활성을 조사한 결과 KFRI 507, KFRI 508, KFRI 842, KFRI 1623균주가 재배종

‘노루1호’, ‘노루2호’와 비교하여 DPPH라디칼 소거능은 농도 의존적으로 10에서 40% 이상 높았으며 ABTS라디 칼 소거능은 추출물 0.125 mg/ml를 기준으로 ‘노루1호’,

‘노루2호’보다 30%에서 60%이상 높은 활성이 나타났다.

본 연구에서 일반농가에서 재배되고 있는 ‘노루1호’, ‘노 루3호’는 균사생장이 우수하나 수집균주에 비하여 항산화 Fig. 4. DPPH radical scavenging activity of mycerial extracts from different isolates of Hericium erinaceus.

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활성이 약한 것이 결점이 있었다. 야생균주 중에서 KFRI 1623균주는 균사생장율이 우수하고 DPPH와 ABTS 라디 칼 소거능이 뛰어났으며 KFRI 842는 항산화 활성은 우수 하나 균사 생장율이 저조한 것이 약점이라 할 수 있다. 따 라서 항산화 활성이 우수한 KFRI 507, KFRI 508, KFRI 842, KFRI 1623을 항산화 기능이 우수한 노루궁뎅이버섯 의 육종소재 또는 식품가공소재로 이용 가능할 것으로 사 료되었다.

적 요

노루궁뎅이버섯의 국내 야생수집 18 균주와 재배종 ‘노 루1호’, ‘노루2호’ 품종의 PDA배지에서 균사체 배양적 특성은 갈색색소생산, 기중균사형, 분지균사형으로 분류 되었으며 KFRI 509, KFRI 1091, KFRI 1093, KFRI

1623의 균사생장율이 ‘노루1호’, ‘노루2호’보다 20% 이상 높았다. Ethanol 60%추출물이 페놀함량과 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능이 농도 의존적으로 가장 높았다. 노루궁뎅 이버섯 수집 균주의 항산화활성은 KFRI 507, KFRI 508, KFRI 842, KFRI 1623균주가 재배종 ‘노루1호’, ‘노루2호’

와 비교하여 DPPH라디칼 소거능은 농도 의존적으로 10%에서 40% 이상 높았으며 ABTS라디칼 소거능은 추 출물 0.125 mg/ml를 기준으로 ‘노루1호’, ‘노루2호’보다 30%에서 60% 이상 높은 활성을 보였다.

감사의 글

본 연구는 농림수산식품기술기획평가원 (IPET) 고부가 가치식품기술개발사업(과제번호: 116164-2)연구지원에 의 해 수행된 결과입니다.

Fig. 5. ABTS radical scavenging activity of mycerial extracts from different isolates of Hericium erinaceus

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