A study on the effect comparative of acanthopanax stem bark (ASB) and acanthopanax root bark (ARB) on the monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis rats

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五加皮樹皮와 根皮의 MIA 유도 골관절염 흰쥐에 미치는 영향 비교

심우형^#, 서부일^*

대구한의대학교 한의과대학 본초학교실

Woo-Hyung Sim

^#

, Bu-Il Seo

^*

Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University

ABSTRACT

Objectives : This study was designed to compare the effects of acanthopanax stem bark (ASB) and acanthopanax root bark (ARB) on the monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis rats.

Methods : The antioxidant activities were evaluated through radical scavenging assays using 2,2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radicals and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals. Also, we examined total poly phenol and flavonoids contents. Osteoarthritis was caused by injection MIA(50 ㎕ with 80

㎎/㎖) into the knee joint cavity of rats. Rats were divided by 4 groups (normal group, control group, ASB treated group, ARB treated group, each n=6). The changes in the levels of reactive oxygen species (ROS), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum were analyzed after experiment. Also, the anti-oxidant, inflammatory protein levels were investigated western blot analysis. Knee joint tissue, histopathological observation hematoxylin & eosin staining and safranin-O staining were measured.

Results : In the present study, ARB treated group showed superior inhibitory effects on the inflammatory parameters than the ASB treated group. ARB aqueous extract was effective in antioxidant measurements. The administration of ARB showed a significant reduction of changes in relative hind paw weight distribution. Morever, it decreased ROS, ALT and AST levels in serum, compared with those of the control rats. The ARB administration inhibited the biomarkers of inflammatory in tissues.

Conclusions : ASB aqueous extract and ARB aqueous extract have a great effect on osteoarthritis, and ARB aqueous extract has excellent effect on osteoarthritis through antioxidant and anti-inflammation.

1)

Key words : acanthopanax stem bark (ASB), acanthopanax root bark (ARB), osteoarthritis, monosodium iodoacetat (MIA), antioxidant, anti-inflammatory.

Ⅰ. 서 론

골관절염 (osteoarthritis)은 연골의 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)의 손상과 연골세포의 소멸 (death of chondrocyte)을 특징으로 하는 퇴행성 질환의 한

종류이다. 골관절염 (osteoarthritis)의 연골 손상 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, IL-1 (interleukin-1)이나 TNF (tumor necrosis factor) 등의 염증 cytokine에 의해 세포외 기질파괴가 촉진되어, 관절 연골의 손상 및 연골세포의 소멸을 야기하여 발생하는 것으로 알려져 있다¹⁾. 현대 사회의 노인

*Corresponding author : Bu-Il Seo. Department of Korean Medicine, Daegu Haany University.

·Tel : +82-53-819-1876 ·E-mail : [email protected]

#First author : Woo-Hyung Sim. Department of Korean Medicine, Daegu Haany University.

·Tel : +82-53-819-1876 ·E-mail : [email protected]

·Received : 25 June 2018 ·Revised : 01 August 2018 ·Accepted : 25 September 2018

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인구의 비율 증가에 맞춰, 대표적 노인 질환이라 볼 수 있는 골관절염의 발병 빈도 역시 가파르게 증가하고 있어, 이에 대 한 적절한 대책이 필요하다²⁾.

한의학에서는 관절염을 痹病 중 하나로 간주하고 있다. 風寒濕의 三氣가 침범하여 氣血의 흐름을 방해하고 經絡의 운행을 막아서 肢體不利해지고, 종창, 마비, 관절제한 등의 증상이 있어, 祛風濕, 强筋骨, 活血祛瘀의 치법을 사용한다³⁾.

五加皮는 ≪神農本草經≫⁴⁾에 처음 수록되었는데 “五加皮味辛溫主心腹疝氣腹痛益氣療躄小兒不能行疽創陰蝕一名豺漆”

이라 그 효능을 설명하고 있다. 補肝腎, 强筋骨, 祛風濕하는 효능으로 風濕痺痛, 小兒行遲, 筋骨痿軟, 體虛乏力, 脚氣등의 증상을 치료하는데 효과가 있다고 알려져 있다.

五加皮의 기원 식물은 ≪대한약전≫에선 두릅나무과 (Araliaceae)에 속한 오갈피나무 Acanthopanax sessiliflorum Seeman 또는 기타 동속식물의 뿌리껍질 및 줄기껍질이라 하 였으며, ≪中華人民共和國藥典≫에는 같은 과 식물인 세주오가 (細柱五加) A. gracilistylus W.W.Smith의 뿌리껍질이라고 하였다.

중국약전⁵⁾은 오직 細柱五加만 五加皮의 기본종으로 인정하 지만, 대한약전에서는 동속식물 모두를 五加皮로 인정하고 있다.

또한 약용부위에 있어서도 중국약전은 뿌리껍질만을 이용하 는데 반해, 대한약전에서는 줄기껍질 (樹皮)과 뿌리껍질 (根皮) 모두를 인정한다^6,7,8).

이에 저자는 五加皮樹皮와 根皮 추출물의 골관절염 치료 효과를 실험적으로 규명하기 위하여, 五加皮樹皮와 根皮의 항산화능을 측정하였고, 흰쥐를 MIA (Monosodium iodoacetate)로 골관절염을 유발시켜 뒷다리 체중부하 검사, 관절조직 내 항산화 관련 인자, 염증 cytokine 및 매개인자 측정, 무릎관절 조직의 cytokine 유전자 발현 분석과 연골 조 직의 병리·조직학적 변화 등을 관찰해 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험재료

1) 동물

대한바이오 (Chungcheongbuk-do, Korea)에서 공급받은 7주령의 수컷 Sprague-Dawley rat (200∼250 g)을 사용하 였고, 실험 당일까지 고형 사료 (Samyang corporation, Seoul, Korea), 물을 충분하게 공급하였으며, 온도 (22 ± 2℃)와 습도 (55 ± 5%)가 잘 유지된 사육실에서 12시간 간격의 light- dark cycle 환경을 유지하면서 1주간 적응시킨 후 실험을 시작 하였다. 또한 동물실험의 과학적, 윤리적 타당성 검토 및 효율 적인 관리를 위해 대구한의대학교 동물실험 윤리 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee : IACUC)에서 승인 (승인번호: DHU2017-069)을 받았다.

2) 시약

본 실험에 사용된 monosodium iodoacetate (MIA), dithiothreitol (DTT), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)

는 Sigma Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA)에서 구 입하였다. Nuclear factor-kappa Bp65 (NF-κBp65), nuclear factor erythroid 2 (Nrf2), catalase, glutathione peroxidase (GPx), cyclooxygenase2 (COX2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-6 (IL-6), NADPH oxidase 4 (NOX4), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), p47^phox, Histone, β-actin, 2차 항체를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, Protease inhibitor mixture, Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)의 경우 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서 구입하였다. 또한, Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였으며, enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection Reagents와 nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단 백질 정량을 측정하기 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.

3) 실험기기

본 실험에 사용된 기기는 전자체중계 (CAS, Korea), AE-6530 mPAGE (ATTO Corporation, Tokyo, Japan), Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd, Seoul, Korea), DWT-1800T (Daewoongbio, Hwaseong-si, Korea), vortex mixer, 동결건조기 (Labconco, Kansas, USA), Deep-freezer (Sanyo Co. Japan), Infinite m200 pro 흡 광도 측정기 (Tecan, Männedorf, Switzerland), Incapacitance Meter Tester 600 (IITC Life Science Inc. Woodland Hills, USA), BX-51 편광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan), 냉장 초고속 원심분리기 (Labogene, Seoul, Korea) 등을 사용 하였다.

2. 실험방법

1) 시료 추출

본 실험에 사용된 五加皮의 樹皮와 根皮는 글로벌허브 (영 천, 한국산)에서 구입한 것을 생약규격집에 맞춰서 관능검사 하여 약전규격에 적합한 것만을 정선하여 사용하였다. 각각 약재 200 g 분량에 물 2,000 ㎖를 가하여 열탕 추출기에서 2 시간 가열하여 추출액을 얻었다. 그 추출액을 감압 증류장치 로 농축하여, 그것을 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조한 분말 五加皮樹皮 (ASB 6.1 g, 3.05%), 五加皮根皮 (ARB 13.2 g, 6.6%)을 얻었으며 실험에 사용하기 직전까지 냉동보관 (-80℃)하였다.

2) DPPH free radical 소거 활성 측정

항산화 활성을 측정하는 방법으로 Blosis에 의한 DPPH free radical 소거법을 사용하였다⁹⁾. 시료 중에 포함된 항산화 물 질의 양을 측정하는데 사용되는 대표적인 실험법이다. 일정농 도를 가진 시료 100 ㎕와 60 μM, 그리고 DPPH 용액 100 ㎕를 넣고 혼합한 후, 실온에서 30분동안 반응 시켰다. 이 반응액을 UV spectrophotometer (Infinite M200 pro, Tecan,

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Männedorf, Switzerland)를 사용해서 540 ㎚에서 흡광도를 사용하여 측정하여 산출하였다. 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 양을 IC₅₀값으로 하여 나타내었다.

3) ABTS free radical 소거 활성 측정

五加皮의 항산화 효능을 평가하기 위하여 ABTS free radical 소거활성을 측정하였다¹⁰⁾. 7 mM ABTS와 2.45 mM Potassium persulfate를 증류수에 녹인 뒤 12시간동안 차광 하여 반응시킨 후, 이 반응액을 415 ㎚에서 ethanol을 이용 하여 흡광도를 0.70 ± 0.02로 보정하였다. ABTS 용액 95 ㎕ 에 시료 5 ㎕를 첨가하고 15분 동안 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

4) Total polyphenol 함량 측정

총 페놀 함량 측정은 Folin-Denis법에 의해 측정하였다.

시료 20 ㎕에 증류수 1.58 ㎖, Folin-Ciocalteu's phenol reagent 100 ㎕를 혼합하여 실온에서 1분간 반응시킨 후 300 ㎕ 의 20% Na2CO3를 첨가하였다. 20℃에서 2시간 후 이 반응액을 UV spectrophotometer (Infinite M200 pro, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용해 765 ㎚에서 흡 광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 표준 검량선을 구하고, 시료의 총 페놀 함량을 산출하였다¹¹⁾.

5) Total flavonoid 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 Lister 등의 방법에 의해 구하였다¹²⁾. 1 ㎖의 diethylene glycol과 시료추출물 100 ㎕ 및 1 N NaOH 10 ㎕를 잘 혼합시켜서 37℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물 질로는 naringin을 사용하였으며, 표준 검량선을 구하여 시 료의 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

6) 약물투여와 군 분리

실험군은 아무런 처치를 하지 않은 정상군 (Nor), MIA로 골관절염 유발후 증류수를 투여한 대조군 (Con), MIA로 골관 절염 유발 후 五加皮樹皮 200 ㎎/㎏ 투여군 (acanthopanax stem bark extract： ASB), MIA로 골관절염 유발 후 五加皮根皮 200 ㎎/㎏ 투여군 (acanthopanax stem bark extract;

ARB)으로 총 4군으로 각각 8마리씩 군 분리하였다. 대조군은 증류수를 경구투여 하였고 약물 투여군들은 MIA 골관절염 유 발 1주일 후 2주간 약물을 경구투여를 하여 진행하였다.

① 정상군 (Nor) : 골관절염을 유발시키지 않은 정상군

② 대조군 (Con) : MIA로 골관절염 유발 후 증류수를 투여한 대조군

③ 五加皮樹皮 투여군 (ASB) : MIA로 골관절염 유발 후 五加皮樹皮 200 ㎎/㎏ 투여군

④ 五加皮根皮 투여군 (ARB) : MIA로 골관절염 유발 후 五加皮根皮 200 ㎎/㎏ 투여군

7) MIA에 의한 골관절염 유발

골관절염 유발을 위하여 실험동물의 오른쪽 무릎 주변을 깨끗이 제모한 뒤, 골관절염 유발물질인 monosodium iodoacetate를 0.3 ㎖ insulin 주사기 (BD 31 G Ultra-Fine

Ⅱ, USA)를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 내에 각 50 ㎕ (80

㎎/㎖)씩 투여하였다. MIA를 희석할 때에는 0.9% saline을 사용하였다.

8) 체중과 식이섭취량 측정

실험동물의 체중은 전자체중계로 2일 간격으로 동일 시간 동일 조건에서 측정하였고, 식이섭취량은 2일 마다 실험동물 에게 제공된 사료에서 2일간 섭취하고 남은 사료량을 측정 후 각 실험군의 하루 사료섭취량을 산출하였다.

9) 뒷다리 체중 부하 측정

시험물질은 1일 1회 오전 투여하고 측정은 오후에 하는 것을 원칙으로 하였다. 측정일은 MIA 주사 전날, 주사 후 7일, 14일 과 21일에 각각 시행 하였다. Incapacitance tester (Ser No.

01/45/25, Linton instrument Co., UK)를 이용하여 왼쪽, 오른쪽 뒷다리 부하 무게를 각각 측정하였다. MIA에 의해 Rat에게 골관절염이 유발되면, Rat은 MIA를 투여하지 않은 다리에 의지하여 tester의 holder 안에 서게 하였다. Rat의 배가 기기의 센서에 닿지 않게 한 상태에서 오른쪽, 왼쪽 각 각의 뒷다리무게 (g)를 측정하여 나타냈다. 실험결과는 관절 염이 유발된 뒷다리 (오른쪽)의 체중 부하량에 대한 정상 뒷다리 (왼쪽)의 체중 부하량을 계산하여 체중 부하 비율을 계산하였 으며, 정상군의 체중 부하 비율에 각 군의 체중 부하 비율을 계산하여 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

∫체중 부하 비율  관절염이 유발된 뒷다리의 체중 부하량 정상뒷다리의 체중 부하량

∬상대적 체중 부하  정상군의 평균 체중 부하 비율 각 군의 체중 부하 비율

× 

10) 혈청 내 산화적 스트레스 바이오마커 측정

복대정맥에서 채혈한 혈액을 4,000 rpm 10분간 원심 분리 하여 혈청을 얻었고 Reactive Oxygen Species (ROS)를 측정 하기 위해서 25 mM DCF-DA를 혼합한 뒤, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 5분마다 emission wavelength of 530

㎚와 excitation wavelength of 485 ㎚를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다. 혈청에서 ROS를 측정하기 위 하여 Kooy et al¹³⁾ 방법을 시행하였다.

11) 혈청 내 간 손상 지표 분석

복대정맥으로부터 채혈한 혈액을 4,000 rpm 10분간 원심 분리하여 혈청을 얻었고 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) assay kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japan) 프로토콜에 따라 측정했다.

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12) Western blot 분석

관절조직의 세포질을 얻기 위해서 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM MgCl2, 5 mM Tris–HCl (pH 7.5), 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, protease inhibitor cocktail, 0.1 M DTT를 첨가시킨 buffer A를 넣은 후 tissue grinder (Bio Spec Product, USA)를 사용해 분쇄한 뒤 10% NP-40 용액을 첨가 하였다. 이후 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후, 12,000 rpm으로 2분간 원심분리시켜 세포질을 포함한 상태인 상층 액을 분리하였다. 또한 관절조직의 핵을 얻기 위해 10% NP- 40를 더한 buffer A에 2회 헹구고, 100 ㎕ 용량의 buffer C (50 mM KCl, 50 mM HEPES, 0.3 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol)를 넣어 재 부유 시킨 후 vortex을 10분마다 3번 실시하였다. 이후 4℃

에서 12,000 rpm으로 10분동안 원심 분리시킨 후 핵을 포함 하는 상층액을 얻어내 –80℃에서 각각 냉동 보관했다. 관절조직 세포질의 COX2, TNF-α, iNOS, IL-6, GPx, catalase, NOX4, p47^phox, β-actin 그리고 핵의 NF-κBp65, Nrf2, Histone 단백질의 발현 측정을 위해 10 ㎍ 단백질을 8∼15% SDS- polyacrylamide gel을 이용해서 전기연동한 뒤, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비한 membrane에다 각 물질을 1차 antibody를 처리하고 4℃에서 overnight 시킨 후 PBS-T를 이용해 6분마다 5회 세척하고, 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용해 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T를 이용해 6분마다 5회 세척하였다. 그 후 ECL 용액을 GE Healthcare에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc에 감광시켜 단백질이 발현되는 것을 확인한 뒤, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용해 정량하였다.

13) 조직학적 분석

실험 종료 후 슬관절 부위를 절단해 10% EDTA가 포함된 10% 포르말린(formalin) 용액에 넣어 관절을 탈회 (decalcification)시킨다. Radiographic technique을 이용해 탈회 유무를 확인 후 parafin wax에 관절을 넣고 고정한 뒤 coronal section을 실시하였다. 탈회 과정을 거치고 난 뒤 파라 핀으로 고정된 조직을 7 ㎛의 크기로 자른 뒤, Hematoxylin and eosin (H&E)와 Safranin-O 염색을 실시해 조직의 상 태를 관찰하였다. 염증 반응의 발생 유무와 활막 세포의 증식 및 염증 세포의 조직 침윤 여부는 H&E 염색 결과에서 확인하 였다.

14) 통계분석

모든 실험은 평균과 표준편차로 표시하였다. 통계분석은 SPSS (Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA) 방법을 사용 하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시 후 least-significant differences (LSD) test를 통해 사후검증을 실시해 군 간의 유의성을 측정하였다. 유의수준 p-value < 0.05 에서 검증하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 항산화 활성

1) DPPH free radical 소거능 및 ABTS free radical 소거능 측정

五加皮의 樹皮와 根皮 항산화 활성 측정을 위해 DPPH free radical 소거능 측정법과 ABTS free radical 소거능 측정법을 이용하여 측정하였고, 대조군으로는 항산화 효과가 있다고 많이 알려진 L-ascorbic acid를 사용하였다.

DPPH free radical을 측정한 결과 대조군인 L-ascorbic acid는 IC50 = 0.90 ± 0.08 ㎍/㎖로 나타났으며, 반면에 ASB는 IC50 = 44.51 ± 10.56 ㎍/㎖로 나타나났고 ARB는 IC50 = 26.01 ± 6.01 ㎍/㎖로 나타났다.

ABTS free radical 소거능을 측정 결과 대조군인 L-ascorbic acid는 IC50 = 2.64 ± 0.09 ㎍/㎖로 나타났으며 ASB의 ABTS free radical 소거능 IC50 값은 33.98 ± 0.57 ㎍/㎖로 나타났고, ARB의 ABTS free radical 소거능 IC50 값은 35.89 ± 0.74 ㎍/㎖로 나타났다 (Table 1).

Sample Radical scavenging activity (IC50) DPPH free radical ABTS free radical L-ascorbic acid 0.90 ± 0.08 ㎍/㎖ 2.64 ± 0.09 ㎍/㎖

ASB 44.51 ± 10.56 ㎍/㎖ 33.98 ± 0.57 ㎍/㎖

ARB 26.01 ± 6.01 ㎍/㎖ 35.89 ± 0.74 ㎍/㎖

ASB： Acanthopanax stem bark extract ARB： Acanthopanax root bark extract Table 1. Anti-oxidant Effects of ASB and ARB

2) 총 페놀 및 플라보노이드 함량 측정

五加皮의 樹皮와 根皮의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 총 페놀 함량 측정에는 standard 곡선은 gallic acid를 이용하였으며 ASB의 총 페놀 함량은 104.47 ± 0.0

㎎/g로 나타나났고 ARB는 95.42 ± 0.0 ㎎/g으로 나타났다.

총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, standard 곡선은 naringin을 이용하였으며 총 플라보이드 함량은 ASB는 13.78 ± 6.58 ㎎/g 으로 나타났고, ARB는 16.80 ± 8.31 ㎎/g으로 나타 났다 (Table 2).

Sample Total polyphenol Total flavonoid ASB 104.47 ± 0.0 ㎎/g 13.78 ± 6.58 ㎎/g ARB 95.42 ± 0.0 ㎎/g 16.80 ± 8.31 ㎎/g ASB： Acanthopanax stem bark extract

ARB： Acanthopanax root bark extract

Table 2. Total Polyphenol and Total Flavonoid Contents of ASB and ARB

2. 체중 및 식이섭취량

MIA 유발 후 2주 후 모든 군에서 체중이 증가하였으며 대 조군과 비교하였을 때 ASB투여군 (41.0 ± 10.7 g (p< 0.01)) 은 유의성 있는 감소함을 나타냈으며 식이섭취량 또한 각 군 간의 유의성은 없었다 (Table 3).

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Group Body weight

Food intake (g/day)

Initial (g) Final (g) Gain (g)

Nor 316.4 ± 10.6 365.8 ± 11.7* 49.4 ± 2.6 24.2 ± 1.5

Con 297.0 ± 5.5 351.9 ± 14.3 54.9 ± 14.0 23.9 ± 0.1

ASB 290.4 ± 9.1 331.4 ± 13.5* 41.0 ± 10.7** 23.3 ± 0.9

ARB 294.6 ± 7.9 331.6 ± 5.1* 37.0 ± 8.1 23.6 ± 0.7

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group.

Significance: *p < 0.05, **p < 0.01 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test Nor：normal rats

Con：MIA-induced osteoarthritis rats

ASB：MIA-induced osteoarthritis rats treated with acanthopanax stem bark extract 200 ㎎/㎏ body weight ARB：MIA-induced osteoarthritis rats treated with acanthopanax root bark extract 200 ㎎/㎏ body weight Table 3. Body Weight and Food Intake

3. 뒷다리 체중 부하의 변화

뒷다리 체중 부하 무게는 실험기간 중 1주일 간격으로 총 4회 측정하였다. 정상군의 뒷다리 체중부하 비율을 100으로 했을 때, 각 군의 상대적인 뒷다리 체중 부하의 변화를 측정한 결과, 약물 투여 1주일 후에는 정상군 (95.43 ± 14.07 (p< 0.001))에 비 해서 대조군 (243.69 ± 77.58)은 유의성 있는 증가를 나타냈다. ASB 투여군 (156.92 ± 24.50 (p< 0.01))과 ARB 투여군 (160.92 ± 75.67 (p< 0.01))로 나타나 대조군에 비해 각각 유의성 있는 감소를 나타냈다.

약물 투여 2주일 후에는 정상군 (110.77 ± 12.61 (p< 0.01))에 비해 대조군 (171.19 ± 43.28)은 유의성 있는 증가를 나타 냈다. ASB 투여군 (140.60 ± 49.97)은 감소하는 경향을 나타냈으며 ARB 투여군 (118.07 ± 28.87 (p< 0.01))은 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Table 4).

Group 0 weeks 1 weeks 2 weeks 3 weeks

Nor 105.95 ± 16.12 88.37*** ± 9.03 95.43*** ± 14.07 110.77** ± 12.61

Con 101.68 ± 16.93 237.15 ± 121.36 243.69 ± 77.58 171.19 ± 43.28

ASB 108.25 ± 12.94 220.18 ± 98.76 156.92** ± 24.50 140.60 ± 49.97

ARB 100.86 ± 19.74 219.98 ± 53.52 160.92** ± 75.67 118.07** ± 28.87

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group.

Significance: *p < 0.01, **p < 0.001 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test Nor：normal rats

Con：MIA-induced osteoarthritis rats

ASB：MIA-induced osteoarthritis rats treated with acanthopanax stem bark extract 200 ㎎/㎏ body weight ARB：MIA-induced osteoarthritis rats treated with acanthopanax root bark extract 200 ㎎/㎏ body weight Table 4. The Changes in Relative Hind Paw Weight Distribution in MIA-induced Osteoarthritis Rats

4. 혈청 내 산화적 스트레스 바이오마커 변화

채취한 혈액에서 혈청을 분리 후 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS를 측정한 결과, 정상군 (14440.0 ± 1692.8 fluorescence/min/㎖ (p< 0.001))에 비해 대조군 (39744.0

± 14419.3 fluorescence/min/㎖)은 유의성 있는 증가를 나 타냈으며 ASB 투여군 (24830.8 ± 2364.12 fluorescence/

min/㎖ (p< 0.01))과 ARB 투여군 (21714.0 ± 6524.7 fluorescence/min/㎖ (p< 0.001)) 모두 대조군에 비해 유의 적 감소를 나타냈다 (Fig. 1).

5. 혈청 내 간 손상 지표 분석

1) ALT 측정

채취한 혈액에서 혈청을 분리 후 간 손상 지표인 ALT를 측정한 결과, 정상군 (9.69 ± 0.56 IU/L)에 비하여 대조군 (9.86 ± 0.53 IU/L)은 증가하는 경향을 나타냈으며 ASB 투 여군 (5.70 ± 0.64 IU/L (p< 0.01))과 ARB 투여군 (4.73

± 0.42 IU/L (p< 0.01)) 모두 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 2).

2) AST

채취한 혈액에서 혈청을 분리 후 간 손상 지표인 AST를 측 정한 결과, 정상군 (85.55 ± 1.66 IU/L)에 비하여 대조군 (89.12 ± 4.31 IU/L)은 증가하는 경향을 나타냈으며 ASB 투여군 (63.37 ± 2.16 IU/L (p< 0.001))과 ARB 투여군 (53.49 ± 3.57 IU/L (p< 0.001)) 모두 대조군에 비해 유의 성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 3).

(6)

Fig. 1. Oxidative stress biomarker (ROS) in serum.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：**p < 0.01, ***p < 0.001 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test

Nor：normal rats Con：MIA-induced osteoarthritis rats

ASB：MIA-induced osteoarthritis rats treated with acanthopanax stem bark extract 200 ㎎/㎏ body weight

ARB：MIA-induced osteoarthritis rats treated with acanthopanax root bark extract 200 ㎎/㎏ body weight

Fig. 2. Alanine transaminase (ALT) in serum.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：**p < 0.01 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test

Fig. 3. Aspartate transaminase (AST) in serum.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：***p < 0.001 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test

6. 관절조직내 항산화 단백질 분석

1) Nrf2

관절 조직에서 western blot을 실시하여 Nrf2 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.18)과 비교하였을 때 대조군 (0.83 ± 0.04)에서 단백질 발현이 감소하였다. 대조군에 비 하여 ASB 투여군 (0.92 ± 0.09)과 ARB 투여군 (0.99 ± 0.12)은 증가하는 경향을 나타냈다(Fig. 4).

Fig. 4. Western blot analysis of nuclear factor erythroid 2 (Nrf2) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group There is no significant difference in the experimental groups Nor：normal rats Con：MIA-induced osteoarthritis rats

2) GPx

관절 조직에서 western blot을 실시하여 GPx 단백질을 분 석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.11) 비교하였을 때 대조군 (0.82

± 0.07)은 단백질 발현이 감소 하였다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (0.88 ± 0.20)과 ARB 투여군 (0.91 ± 0.06) 모두 유의성은 없었으나 대조군에 비해 증가하는 경향을 나타냈다 (Fig. 5).

Fig. 5. Western blot analysis of glutathione peroxidase (GPx) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group There is no significant difference in the experimental groups Con：MIA-induced osteoarthritis rats

(7)

3) Catalase

관절 조직에서 western blot을 실시하여 catalase 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.19)과 비교하였을 때 대조군 (0.95 ± 0.07)은 단백질 발현이 감소 하였다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.91 ± 0.24 (p< 0.01))과 ARB 투여군 (1.92

± 0.27 (p< 0.01))은 대조군에 비해 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다 (Fig. 6).

Fig. 6. Western blot analysis of catalase expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：**p < 0.01 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test

7. 관절조직내 염증 cytokine 및 매개 인자 분석

1) NF-κBp65

관절 조직에서 western blot을 실시하여 NF-κBp65 단백 질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.26 (p< 0.01))과 비교 하였을 때 대조군 (2.00 ± 0.27)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.22 ± 0.23 (p< 0.05))은 유의성 있는 감소를 나타냈으며 ARB 투여군 (0.95 ± 0.09 (p< 0.01)) 또한 유의성 있는 단백질을 감소를 나타냈다 (Fig. 7).

2) p-IκBα

관절 조직에서 western blot을 실시하여 p-IκBα 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.18 (p< 0.05))과 비교하였을 때 대조군 (1.50 ± 0.18)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.06 ± 0.23)은 감소 하는 경향을 나타냈으며 ARB 투여군 (0.83 ± 0.14 (p< 0.01)) 은 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 8).

3) COX2

관절 조직에서 western blot을 실시하여 COX2 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.05 (p< 0.01))과 비교하였을 때 대조군 (2.04 ± 0.28)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.88 ± 0.24)은 유 의성은 없었으나 감소하는 경향을 나타냈고 ARB 투여군 (1.30

± 0.18 (p< 0.05))은 단백질 발현이 유의성 있는 감소를 나타 냈다 (Fig. 9).

4) iNOS

관절 조직에서 western blot을 실시하여 iNOS 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.20 (p< 0.01))과 비교하였을 때 대조군 (3.65 ± 0.71)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (3.69 ± 0.75)은 유 의성은 없었으나 감소하는 경향을 나타냈으며 ARB 투여군 (1.90 ± 0.44 (p< 0.05))은 단백질 발현이 유의성은 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 10).

Fig. 7. Western blot analysis of Nuclear factor-kappa Bp65 (NF-kBp65) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：*p < 0.05, **p < 0.01 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test

Fig. 8. Western blot analysis of p-IκBα expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

(8)

Fig. 9. Western blot analysis of cyclooxygenase2 (COX2) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

Fig. 10. Western blot analysis of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

5) TNF-α

관절 조직에서 western blot을 실시하여 TNF-α 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.14 (p< 0.01))과 비교하였을 때 대조군 (2.10 ± 0.43)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.25 ± 0.12 (p<

0.05))과 ARB 투여군 (1.16 ± 0.12 (p< 0.05))은 유의성 있는 단백질 발현 감소를 나타냈다 (Fig. 11).

6) IL-6

관절 조직에서 western blot을 실시하여 IL-6 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.13 (p< 0.05))과 비교하였을 때 대조군 (1.62 ± 0.18)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.51 ± 0.20)과

ARB 투여군 (1.35 ± 0.17)은 유의성은 없었으나 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 12).

Fig. 11. Western blot analysis of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

Fig. 12. Western blot analysis of interleukin-16 (IL-6) expression;

expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：*p < 0.05 vs. MIA-induced osteoarthritis rat by student LSD test.

8. 관절조직내 NADPH 매개 인자 분석

1) NOX4

관절 조직에서 western blot을 실시하여 NOX4 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.09 (p< 0.01))과 비교하였을 때 대조군 (2.91 ± 0.72)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (2.75 ± 0.38)과 ARB 투여군 (2.19 ± 0.29)은 유의성은 없었으나 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 13).

(9)

Fig. 13. Western blot analysis of NADPH oxidase 4 (NOX4) expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：**p < 0.01 vs. MIA-induced osteoarthritis rat by student LSD test

2) p47^phox

관절 조직에서 western blot을 실시하여 p47^phox 단백질을 분석한 결과, 정상군 (1.00 ± 0.05 (p< 0.001))과 비교하였을 때 대조군 (2.86 ± 0.28)은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 (1.85 ± 0.34 (p<

0.01))과 ARB 투여군 (1.39 ± 0.21 (p< 0.001))은 단백질 발현이 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 14).

Fig. 14. Western blot analysis of p47phox expression; expression levels in the MIA-induced osteoarthritis rats.

All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group Significance：**p < 0.01, ***p < 0.001 vs. MIA-induced osteoarthritis rats by student LSD test

9. 조직학적 분석

1) H&E 염색

무릎 관절 내 H&E 염색을 실시한 후 관찰한 결과, 정상군은 활막 조직과 연골 조직이 정상적인 반면 대조군은 골관절염 유발로 인해 활막 조직과 연골 조직의 심각한 손상이 나타났다.

대조군과 비교하여 ASB 투여군과 ARB 투여군a은 활막 조직과 연골 조직의 손상이 효과적으로 억제되었다 (Fig. 15).

Fig. 15. The histological analysis of the knee joint tissues after treatment of ASB and ARB in MIA-induced osteoarthritis rat (Hematoxylin and eosin staining, ✕ 200).

In the Normal, synovial tissue and cartilage were well developed.

In the Control, most of articular cartilage and synovial tissue were destructed. In the ASB and ARB, articular cartilage and synovial tissue were preserved, compared with Control.

(A) Nor：normal rats (B) Con：MIA-induced osteoarthritis rats (C) ASB：MIA-induced osteoarthritis rats injected with acanthopanax

stem bark extract 200 mg/kg body weight

(D) ARB：MIA-induced osteoarthritis rats injected with acanthopanax root bark extract 200 mg/kg body weight.

2) Safranin-O 염색

Safranin-O 염색 후 관찰한 결과, 정상군은 관절 조직 및 proteoglycan은 정상적인 반면 대조군은 골관절염 유발로 인해 관절 조직의 심각한 손상이 나타났다. 반면 ASB 투여군과 ARB 투여군은 대조군에 비해 관절 조직과 proteoglycan의 소실도 억제됨을 관찰할 수 있었다 (Fig. 16).

Fig. 16. The histological analysis of the knee joint tissues after treatment of ASB and ARB in MIA-induced osteoarthritis rat (Safranin-O staining, ✕ 200).

In the Normal, there are much of proteoglycan around the cartilage.

In the Control, most of proteoglycan was broken down, so red color was disappeared. In the ASB and ARM red color was around the cartilage, so we knew proteoglycan was well preserved compared with Control.

(A) Nor：normal rats (B) Con：MIA-induced osteoarthritis rats (C) ASB：MIA-induced osteoarthritis rats injected with acanthopanax

stem bark extract 200 mg/kg body weight

(D) ARB：MIA-induced osteoarthritis rats injected with acanthopanax root bark extract 200 mg/kg body weight.

(10)

Ⅳ. 고 찰

골관절염은 연령, 유전, 외상, 비만 등 다양한 발생 원인이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직 정확한 원인이 밝혀지지 않아 많은 환자들이 연골 기능저하로 인한 관절의 기능제한과 종창, 통증을 호소한다^14,15,16).

골관절염으로 인해 요양기관을 방문하여 치료를 받은 환자 수는 2012년 3,276,590명에서 점점 증가하여 2016년 3,679,900명까지 매년 증가하는 추세를 보이고 있다. 또한 2016년 기준으로 남성환자가 1,160,173명, 여성환자가 2,519,727명으로 여성환자의 비율이 훨씬 더 높으며, 여성환 자가 차지하는 비율이 점점 증가하고 있다. 즉, 남성보다 여 성의 발병 비율이 3배 이상 높으며, 나이가 증가할수록 골관 절염 유병율이 크게 증가한다고 볼 수 있다¹⁷⁾.

일반적인 골관절염 치료는 크게 약물치료와 비약물치료로 나뉜다. 약물치료는 소염진통제, NSAIDs (비스테로이드성 항염증제) 등을 사용하나 장기 복용 시 심혈관계, 위장계에 부작용에 대한 우려가 있다. 비약물치료는 수술요법 (인공관절 치환술)이 주를 이루나, 염증 또는 재수술에 대한 위험부담이 있어 많은 환자들이 한방치료를 선호하는 편이다¹⁸⁾.

골관절염의 한의학적 병증은 鶴膝風, 痺症, 脚氣, 歷節風 등의 범주로 볼 수 있다. 이에 대한 通治法으로는 祛風濕, 淸血熱, 化濕痰 작용을 통하여 氣血을 조화시키고, 經脈을 소통 시키는 방법을 이용한다. 급성기에는 刺針法, 蜂毒療法, 附缸療法 등을 병행하며, 만성기에는 刺針法, 灸法, 藥針療法 등을 응용한다^19,20).

본 실험에 사용된 MIA는 관절 내에 주입할 때, 관절 내 연골 세포에서 진행되는 해당과정의 활성을 억제하여, 연골의 대사 과정을 억제시켜, 연골의 변형을 유발하여 골관절염을 발생시 킨다. MIA는 실험용 쥐를 대상으로 골관절염을 유발한 실험 에서 연골의 손상, 관절의 통증 및 기능장애 등의 양상이 나타 났으며, 이는 사람에게 발생하는 골관절염과 유사한 병태를 보였다. 따라서 MIA는 관절의 퇴행성 변화를 유발하는 대표 적인 물질 중 하나라 볼 수 있다21,22,23,24,25).

五加皮의 기원 식물은 ≪대한약전≫에선 두릅나무과 (Araliaceae)에 속하는 오갈피나무 Acanthopanax sessiliflorum Seeman 또는 기타 동속식물의 뿌리껍질 및 줄기껍질이라 하 였고, ≪中華人民共和國藥典≫에는 같은 과 식물인 세주오가 (細柱五加) A. gracilistylus W.W.Smith의 뿌리껍질이라고 하였다. 오가피의 주요 유효성분으로는 acanthoside B, D 등이 알려져 있다. 약리 작용으로는 진통, 해열작용, 항염증 작용 등이 인정되고, 특히 인체 스트레스에 대한 저항성을 증가시 킨다는 연구가 있다²⁶⁾. 실제로 오가피의 taiwanin C 성분의 항염증 효능이 보고되었으며, pimaric acid는 항균 및 항염증 작용이 있는 것으로 보고되었다²⁷⁾. 오가피의 性味는 溫, 無毒辛苦하며, 오가피는 補肝腎, 强筋骨, 祛風濕하는 효능으로 風濕痺痛, 小兒行遲, 筋骨痿軟, 體虛乏力, 脚氣 등의 증상을 치료 하는데 효과가 있다고 알려져 있다⁸⁾. 그 중 祛風濕하는 효능 으로 風濕痺痛을 치료하는데 탁월한 효과가 있다고 알려져 관 절염 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다²⁸⁾.

오가피에 관한 기존 연구로는, 인 등²⁸⁾이 오가피의 화학성 분과 약리효능에 대하여 연구하였고, 임 등²⁹⁾이 염증 유도를 한

rat을 대상으로 면역반응에 대한 효과를 연구하였다. 또한 김 등³⁰⁾은 류미토이드 관절염 치료제로서 오가피의 효과를 연구 하였다.

또한 한약으로 MIA로 유도된 관절염을 치료하려는 연구도 다양하게 시도 되었는데, 한약재로는 김 등³¹⁾이 연구한 牛膝 복합추출물의 골관절염에 대한 효과 연구가 있고, 탕제로는 양 등³²⁾이 연구한 當歸四逆湯의 골관절염 치료효과, 그리고 이 등³³⁾이 연구한 勝濕湯의 골관절염 치료 효과 등의 연구결과가 보고되었다.

이렇듯 오가피에 대한 다양한 연구와 관절염 치료에 대한 다양한 연구가 있었지만, 오가피의 根皮와 樹皮를 분류해 그 추출물이 관절염에 대한 효과를 얼마나 나타내는지에 대해 측 정한 연구는 없었다.

이에 저자는 오가피의 골관절염에 대한 효과를 입증하고, 이와 더불어 기존에 많이 사용되던 根皮뿐 아니라 樹皮를 사 용해도 뛰어난 효과가 있는지 알아보기 위해 본 실험을 진행 하였다. 저자는 실험을 통해 항산화 활성, 뒷다리 체중부하 검사, 체중변화, 산화적 스트레스 검사, 간독성 검사, 혈청 내 염증 cytokine 및 매개인자 측정, 관절조직 내 항산화 단백질 분석, 관절조직 내 NADPH 분석, 연골의 병리조직학적 변화를 관찰해 이를 검증하고자 하였다.

우선 항산화 활성도를 측정하기 위해 DPPH free radical 소거능 및 ABTS free radical 소거능을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 방향족 아민류, 방향족 화합물 같은 물질에 의해 환원되어 탈색이 되는 원리로 측정하며, 이는 항산화 활 성의 정도를 평가할 수 있다. 항산화 활성도가 높을수록 지방질 산화를 억제하고, 활성 라디칼 때문에 생기는 인체의 노화를 지연시키는 작용을 한다. ABTS 소거활성 측정은 DPPH 소거 활성 측정과 유사한 방법으로, 이미 생성된 자유 라디칼의 제 거된 정도를 흡광도 값으로 산출하여 측정한다^34,35).DPPH free radical 측정 결과 대조군인 L-ascorbic acid에 비해 ASB와 ARB 의 DPPH free radical 소거능이 높은 것으로 나타났다.

ABTS free radical 소거능 또한, 대조군인 L-ascorbic acid 보다 ASB와 ARB의 ABTS free radical 소거능 값이 높은 것 으로 나타났다 (Table 1). 따라서, ASB와 ARB 모두 항산화 활성 효과가 있을 것으로 생각된다.

총 페놀 함량 측정에는 ASB의 총 페놀 함량은 104.47 ± 0.0 ㎎/g로 나타났고 ARB는 95.42 ± 0.0 ㎎/g으로 나타났다.

총 플라보노이드 측정 결과 ASB는 13.78 ± 6.58 ㎎/g 으로 나타났고, ARB는 16.80 ± 8.31 ㎎/g으로 총 플라보노이드 함량을 나타냈다 (Table 2).

체중 변화를 살펴본 결과, MIA 유발 후 모든 군에서 체중이 증가하였으며, 대조군과 비교하였을 때 ASB 투여군은 유의성 있는 감소함을 나타냈으며 식이섭취량 또한 각 군 간의 유의 성은 없었다 (Table 3).

관절 손상의 정도를 파악하기 위해 뒷다리 체중부하 검사시, 정상군에 비해 대조군은 유의성 있는 증가를 나타냈다. ASB 투여군은 감소하는 경향을 나타내었으며 ARB 투여군은 대조 군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Table 4). 이는 ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 골관절염으로 인한 뒷다리 통증이 완화된 것으로 볼 수 있다.

ROS가 생성되게 되면, 산화적 스트레스가 발생한다. 최근

(11)

연구결과에 따르면 산화적 스트레스가 세포손상을 야기하고, 이는 염증의 주요 원인이 된다고 알려져 있다^36,37).또한 증가된 ROS로 인해 산화적 스트레스에 민감한 세포 내부의 신호 기 전을 활성시켜 염증에 관련된 단백질과 cytokine을 통해 직접 적인 세포 손상을 유발한다³⁸⁾.채취한 혈액에서 혈청을 분리 후 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS를 측정한 결과, 정상군에 비해 대조군은 유의성 있는 증가를 나타냈으며 ASB 투여군 과 ARB 투여군 모두 대조군에 비해 유의적 감소를 나타냈다 (Fig. 1). 이는 ASB 투여군과 ARB 투여군에서 염증으로 인한 세포 손상이 감소한 것으로 볼 수 있다.

그리고 ASB와 ARB의 간독성 위험을 알아보기 위해 ALT와 AST 수치를 측정하였다. ALT와 AST는 간세포내의 미토콘 드리아에 있으며, 간세포가 파괴될 때 혈액으로 유출되는 효 소이다. ALT와 AST는 간 손상이 있을 때 증가되는 효소라고 널리 알려져 있다³⁹⁾.채취한 혈액에서 혈청을 분리 후 간 손상 지표인 ALT를 측정한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 증가 하는 경향을 나타냈으며 ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 대 조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 2). 또한 채 취한 혈액에서 혈청을 분리 후 간 손상 지표인 AST를 측정한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 증가하는 경향을 나타냈으며 ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 3). 이는 ASB 투여군과 ARB 투여군 모두, 간 독성이 없는 안전한 약물임을 알 수 있다.

또한, 관절 조직 내 항산화 단백질 분석을 위해 Nrf2 등의 항산화 단백질 수치를 분석하였다. Nrf2 등의 항산화 단백질은 평소에 세포질 내에 존재하면서, 항산화 약물이나 산화적 자 극이 세포 내로 들어올 때, 인산화되어 핵내로 이동한다. 핵 으로 이동한 Nrf2는 phase II enzyme의 전사적 발현을 유도 하여 세포를 산화적 스트레스로 부터 보호한다^40,41).관절 조직 내 항산화 단백질을 분석한 결과, Nrf2 단백질의 경우, 정상 군과 비교하였을 때 대조군에서 단백질 발현이 감소하였다.

대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 증가하는 경 향을 나타냈다 (Fig. 4). 그리고 GPx 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 감소하였다.

대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 유의성은 없었으나 대조군에 비해 증가하는 경향을 나타냈다 (Fig. 5).

Catalase 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대 조군은 단백질 발현이 감소하였다. 대조군에 비하여 ASB 투 여군과 ARB 투여군은 대조군에 비해 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다 (Fig. 6). 이러한 항산화 단백질의 증가는 ASB 투여군과 ARB 투여군이 산화적 스트레스를 조절하여, 관절연골의 손상을 줄이는데 기여함을 알 수 있다.

관절조직내 염증 cytokine 및 매개 인자는 여러 종류가 있다.

이러한 인자들은 염증에 직간접적으로 영향을 미치며, ASB와 ARB 또한 여러 매개 인자를 측정하여 염증에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. NF-κBp65단백질 같은 인자들은 iNOS와 COX2와 같은 염증 효소들을 조절하고, TNF-α나 IL-6와 같은 염증성 사이토카인 또한 효율적으로 조절한다. 또한 COX2는 PEF를 활성시켜 염증반응을 일으키게 된다⁴²⁾. NF-κBp65 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단 백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군은 유의성 있는 감소를 나타냈으며 ARB 투여군

또한 유의성 있는 단백질의 감소를 나타냈다(Fig. 7). p-IκBα 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단 백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군은 감소하는 경향을 나타냈으며 ARB 투여군은 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 8). COX2 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군은 유의 성은 없었으나 감소하는 경향을 나타냈고 ARB 투여군은 단 백질 발현이 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 9).

iNOS는 NO가 과잉 생성됨으로 인해 유도되며, 세포내 염 증과 관련된 단백질로 작용한다⁴³⁾.iNOS 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군은 유의성은 없었으나 감소하는 경향을 나타냈으며 ARB 투여군은 단백질 발현이 유의성은 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 10).

TNF-α는 패혈성 쇼크, 세포독성 및 염증과 관련이 있다.

또한 류마티스 관절염, 박테리아 패혈증과 크론병에 영향을 끼치는 원인 중 하나로 알려져 있다. TNF-α는 독소의 주요 매개인 LPS를 포함한 다양한 인자의 자극을 받아 단핵백혈구와 대식세포 등이 반응하여 분비된다⁴⁴⁾.TNF-α 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 유의성 있는 단백질 발현 감소를 나타냈다 (Fig. 11).

IL-6는 T세포의 분화를 자극하고, 세포성장, 생존 및 분화에 있어 주요 조절자의 역할을 한다. IL-6는 면역반응, 염증 및 종양 형성과 같은 다양한 생물학적 반응과 관계되어 있다⁴⁵⁾. IL-6 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 유의성은 없었으나 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 12). 이렇듯 ASB 투여군과 ARB 투여 군에서, 다양한 종류의 관절조직 내 염증매개체가 감소하는 경향을 보였고, 이는 ASB와 ARB 모두 염증물질 감소에 효과가 있음을 알 수 있다.

그리고 관절조직내 NADPH 인자를 분석해 보았다. NOX는 여러가지 자극에 반응하여 ROS를 발생시키는 효소이다^46,47). p47^phox는 NOX1, NOX2 내에서 발현되어, 활성화 될 경우 ROS 생성이 증가되게 된다.^48,49,50)NOX4 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 유의성은 없었으나 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 13). p47^phox 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 단 백질 발현이 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 14). 따라서 ARB와 ASB는 NOX4 단백질, p47^phox 단백질을 감소시켜 ROS의 발생을 억제시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

또한, 연골 조직의 변화 관찰을 위해 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 통해 조직학적 변화를 관찰하였다. 무릎 관절 내 H&E 염색을 실시한 후 관찰한 결과, 정상군은 활막 조직과 연골 조직이 정상적인 반면 대조군은 골관절염 유발로 인해 활막 조직과 연골 조직의 심각한 손상이 나타났다. 대조군과 비교 하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 활막 조직과 연골 조직의

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손상이 효과적으로 억제되었다 (Fig. 15). Safranin-O 염색 후 관찰한 결과, 정상군은 관절 조직 및 proteoglycan은 정상적인 반면 대조군은 골관절염 유발로 인해 관절 조직의 심각한 손 상이 나타났다. 반면 ASB 투여군과 ARB 투여군은 대조군에 비해 관절 조직과 proteoglycan의 소실도 억제됨을 관찰할 수 있었다 (Fig. 16). 따라서 ASB와 ARB 모두 관절 및 연골 조직의 손상을 억제하는데 효과가 있음을 알 수 있었다.

Ⅴ. 결 론

1. 항산화활성 효과 실험 결과를 보면, DPPH free radical 소거능 측정 결과 대조군인 L-ascorbic acid 보다 ASB 와 ARB에서 유의한 증가를 보였다. 또한 ABTS free radical 소거능 측정 결과 역시, 대조군인 L-ascorbic acid 보다 ASB와 ARB에서 유의한 증가를 보였다. 그 리고 ASB와 ARB의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량은 증가한 것으로 나타났다.

2. 뒷다리 체중부하 검사 실험 결과를 보면, 약물 투여 후 뒷다리 체중부하를 검사한 결과, 정상군에 비해 대조군은 유의성 있는 증가를 나타냈다. ASB 투여군은 감소하는 경향을 나타내었으며, ARB 투여군은 대조군에 비해 유 의성 있는 감소를 나타냈다.

3. 혈청 내 산화적스트레스 바이오마커 (ROS) 변화를 보면, 채취한 혈액에서 ROS를 측정한 결과, 정상군에 비해 대조군은 유의성 있는 증가를 나타냈으며, ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 대조군에 비해 유의적 감소를 나타냈다.

4. 혈청 내 간 손상 지표 분석 결과를 보면, 간 손상 지표인 ALT를 측정한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 증가하는 경향을 나타냈으며, ASB 투여군과 ARB 투여군은 모두 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다. 또한 AST 를 측정한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 증가하는 경 향을 나타냈으며, ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 대 조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다.

5. 관절 조직 내 항산화 단백질 분석 결과를 보면, 관절 조 직에서 Nrf2 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군에서 단백질 발현이 감소하였다. 대조군에 비 하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 증가하는 경향을 나 타냈다. 또한, 관절 조직에서 GPx 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 감소 하였다. 그리고 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군 모두 유의성은 없었으나 대조군에 비해 증가하는 경향을 나타냈다. Catalase 단백질을 분석한 결과, 정 상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 감소하 였다. 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 대조군에 비해 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타 냈다.

6. 관절조직 내 염증 cytokine 및 매개 인자 분석 결과를 보면, 관절 조직에서 NF-κBp65 단백질, p-IκBα 단백질, COX2 단백질, iNOS 단백질, TNF-α 단백질, IL-6 단 백질 등을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 대체적으로 유의성 있는 증가 경향을 보였으며, ASB투 여군과 ARB투여군은 대체적으로 감소하는 경향을 나타 내었다.

7. 관절조직 내 NADPH 매개 인자 분석 결과를 보면, 관절 조직에서 NOX4 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교 하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군 및 ARB 투여 군은 유의성은 없었으나 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타냈다. 관절 조직에서 p47^phox 단백질을 분석한 결과, 정상군과 비교하였을 때 대조군은 단백질 발현이 유의성 있는 증가를 나타냈다. 대조군에 비하여 ASB 투여군과 ARB 투여군은 단백질 발현이 유의성 있는 감소를 나타 냈다.

8. 조직학적 분석 결과를 보면, 무릎 관절 내 H&E 염색을 실시한 후 관찰한 결과, 대조군과 비교하여 ASB 투여 군과 ARB 투여군은 활막 조직과 연골 조직의 손상이 효과적으로 억제되었다. Safranin-O 염색 후 관찰한 결과, ASB 투여군과 ARB 투여군은 대조군에 비해 관절 조직과 proteoglycan의 소실도 억제됨을 관찰할 수 있 었다.

이상의 결과로 보아, 五加皮樹皮추출물 (ASB)과 根皮추출물 (ARB)이 MIA가 유도된 골관절염을 가진 흰쥐에서 항산화, 항염증 및 골관절염 진행을 억제하는 효과가 있다고 생각된다.

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