원 저
Korean Circulation J 2003;33(2):121-129
돼지 관상동맥 스텐트 재협착 모형에서 신생내막 내 세포외기질의 역할
전남대학교 의과대학 전남대학교병원 심장센터,
1전남대학교 의과학연구소
2박옥영 1 ·정명호 1,2 ·김정하 1 ·김 원 1 ·이승현 1 ·홍영준 1 ·김주한 1 박우석 1 ·안영근 1,2 ·박종태 2 ·조정관 1,2 ·박종춘 1,2 ·강정채 1,2
The Role of Extracellular Matrix within the Neointima in A Porcine Coronary Stent Restenosis Model
Ok Young Park, MD
1, Myung Ho Jeong, MD
1,2, Jung Ha Kim, MS
1, Weon Kim, MD
1, Seung Hyun Lee, MD
1, Young Joon Hong, MD
1, Ju Han Kim, MD
1,
Woo Suk Park, MD
1, Young Keun Ahn, MD
1,2, Jong Tae Park, MD
2,
Jeong Gwan Cho, MD
1,2, Jong Chun Park, MD
1,2and Jung Chaee Kang, MD
1,21
The Heart Center of Chonnam National University Hospital,
2
The Chonnam National University Research Institute of Medical Sciences, Gwangju, Korea
ABSTRACT
Background and Objectives：Coronary stent restenosis remains a major limitation to percutaneous coronary intervention. The most important mechanism of coronary stent restenosis is neointimal hyperplasia (NIH). In addition to neointimal cell proliferation, extracellular matrix (ECM) synthesis may be important in the induction of NIH. We sought to observe the degree of this in a porcine model. Subjects and Methods：
Twenty-one coronary stents were placed in 15 pigs, and the pigs were sacrificed at 14 (Group I), 28 (Group II) and 56 (Group III) days following stenting. The twenty-one coronary stents were classified into three groups, followed by histopathological analyses of 7 stented arteries. Each specimen was analyzed by H&E, modified Movat and Masson-Trichrome staining methods. Immunocytochemistry was performed for type I collagen, smooth muscle a-actin and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). A Visus 2000 Visual Image Analysis System was used. Results：There were no differences in the injury scores of the stented porcine coronary arteries between the three groups. The areas of neointima in Groups I, II and III were 0.75±0.32, 1.45±0.78 and 1.62±0.51 mm
2, respectively (Group I vs. II and Group I vs. III；p=0.08, p=0.03). The pathological area stenoses were 18.8±7.4, 34.2±0.2 and 43.1±28.4% in Groups I, II and III, respectively ( Group I vs. II and Group I vs. III；p=0.35, p=0.02). The PCNA indices of neointima were 16.5±14.4, 0.5
±0.74 and 0.83±0.68% in Groups I, II and III, respectively (Group I vs. II and Group I vs. III；p＝0.01).
The collagen content ratios within the neointima were 23.5±4.7, 27.7±5.0 and 36.6±10.5% in Groups I, II and III, respectively (Group I vs. II and Group I vs. III；p=0.52, p=0.01). Proteoglycans were abundant in Groups I and II, and alpha-actin was positive in the neointima cells. Conclusion：The role of cell proli-
논문접수일：2002년 09월 30일 심사완료일：2002년 11월 28일
교신저자：정명호, 501-757 광주광역시 동구 학1동 8번지 전남대학교 의과대학 전남대학교병원 심장센터 전화：(062) 220-6243·전송：(062) 228-7274·E-mail：[email protected]
feration and proteoglycans are important in the early period, but collagen plays a major role in the late period, following coronary stenting, in a porcine model. (Korean Circulation J 2003;33(2):121-129)
KEY WORDS：Coronary disease；Stents；Coronary restenosis.
서 론
관상동맥 질환의 치료 방법의 하나로서 경피적 관상 동맥 중재술(percutaneous coronary intervention：
PCI)은 1977년에 경피적 관상동맥 풍선 확장술에서 시작하여, 1980년대 후반에 스텐트와 항혈소판제가 도 입됨으로써 풍선확장술의 문제점인 혈전 및 내막박리 및 재협착을 줄일 수 있게 되어 치료방법의 하나로서 확립되어 있다.
1)PCI 후 발생하는 재협착은 주로 치료 목적의 혈관 손상 후 신생내막 증식과 수축성 재형성이 주요한 기전이라 생각되고 풍선확장술 후 재협착이 30~
50%에서 발생하였다. 관상동맥 스텐트시술은 협착 부 위를 효과적으로 확장시키고 내막박리 등을 효과적으 로 치료할 수 있었고 만성적인 혈관의 수축성 재형성을 억제함으로써 관상동맥질환의 치료법의 하나로서 비약 적인 발전을 거듭해왔다. 그러나 관상동맥 스텐트시술 후에도 재협착율은 20~30%로서 비교적 높은 편이며, 여전히 해결되어야 할 문제점으로 남아 있다.
2)3)관상동맥 스텐트 시술 후 재협착의 주요한 기전으로 는 신생내막 증식(neointimal hyperplasia)이 가장 중 요한 기전으로 알려져 있으나,
4)5)아직까지 신생내막세 포의 증식의 발생 기전에 대하여 확실한 기전을 밝혀져 있지 않다. 최근에 관상동맥 스텐트 재협착 예방을 위 한 시도로서 본 교실에서도 혈소판 당단백 IIb/IIIa 수 용체 차단제, cilostazol과 같은 항혈소판제, 항산화제, tranilast 등과 같은 새로운 약물 요법, 심도자나 스텐 트를 이용한 헤파린, nitric oxide donor, 혈소판 당단 백 IIb/IIIa 수용체 차단제, paclitaxel 등과 같은 약물의 국소 전달 요법, RAD50 와 같은 유전자 요법 및 Ho- 166 등을 이용한 방사성 동위원소 풍선도자 및 스텐트 등 다양한 시도를 하였으나,
6-9)아직까지 스텐트 재협 착을 억제하는 완벽한 방법은 밝히지 못하였다.
관상동맥 스텐트 재협착의 원인으로 밝혀진 신생내 막의 증식에 대한 연구는 현재까지 신생내막 세포의 증 식에 관한 연구가 주로 이루어졌으나,
4)5)본 연구에서 는 신생내막 세포의 증식뿐만 아니라 세포외기질 축적
과 세포외기질을 통한 세포의 이동에 대한 역할을 규명 하고자 하였다. 즉 돼지 관상동맥 스텐트 재협착 동물 모형을 이용하여 스텐트 시술 후 시간 경과에 따른 돼 지 관상동맥 세포외기질의 분포와 세포 증식률을 관찰 하여 스텐트 재협착에 대한 세포외 기질의 역할을 파악 하고자 하였다.
재료 및 방법
실험 동물
동물 실험은 전남대학교병원 임상연구소 윤리위원회 의 허가를 받아 실시하였으며, 실험용 동물은 순종 돼지 중 25~35 kg의 암퇘지를 실험 3일전에 공급받아 전남 대학교 의과학연구소에서 관찰한 후 실험을 실시하였다.
방 법
돼지를 하루 100 mg의 aspirin과 250 mg의 ticlo - pidine으로 전처치하였으며, 관상동맥 손상 모형은 Jeong과 Schwartz가 개발한 방법을 이용하였다.
10)실 험 돼지를 전날 밤부터 금식시킨 다음 ketamine 12 mg/kg와 xylazine 8 mg/kg을 근육 주사하여 전신 마 취를 유도하였다. 무균 상태 하에서 2% lidocaine으로 목 중앙부에 국소마취를 실시한 돼지의 경동맥을 절개 하여 8 French 동맥 sheath를 삽입하였다. heparin sodium 10,000 Unit를 투여한 후 7 French 또는 8 French의 관상동맥 유도 도자를 C-arm(Phillips사 BV 25 Gold)의 투시 하에 관상동맥 개구부에 위치시 켰다. 실험 중에는 안면 산소마스크를 이용하여 지속적 으로 산소를 공급하였고, 귀의 정맥을 통하여 식염수를 공급하였으며 midazolam을 추가로 정주하여 마취 상 태를 유지하였다.
관상동맥의 손상은 스탠트가 감겨져 있는 풍선 도자로 스텐트 대 혈관의 비율이 1.3：1이 되도록 standard deflator를 이용하여 6내지 8기압의 압력으로 30초간 풍 선을 확장시켜 돼지의 관상동맥에 과확장 손상을 가하였다.
3.0×17 mm MAC stent을 관상동맥의 크기가 직경 3
mm 이상의 혈관 부위에 시술하였다. 스텐트 시술 후 사용한 돼지의 경동맥을 결찰한 후 목의 피부를 봉합하 였고 의과학연구소 동물 사육사에서 회복한 후 관찰하 였다. 스텐트 시술 전후로 관상동맥 조영술은 Phillips 사 C-arm BV 25 Gold를 이용하여 실시하여 CD로 녹화 기록하였다. 15마리의 돼지에 21개의 관상동맥에 21개 의 관상동맥 스텐트 시술 후 14일, 28일, 56일째에 각 각 7례씩 희생시켰고 Ⅰ군, Ⅱ군, Ⅲ군으로 분류하여 관 상동맥 병변에 대한 병리 조직학적 검사를 실시하였다.
조직 병리학적 처치 및 조직 염색
적출한 돼지 심장은 10% 중성 buffered formalin으 로 perfusion fixation하였고 관상 동맥 절편은 스텐트 상하인접부 1 cm 까지 얻어서 스텐트 filament는 혈관 을 2~3 mm 간격으로 절단한 후 현미경 시야에서 혈 관이 변형되거나 손상되지 않도록 제거하였다. 손상된 혈관의 근위부, 중위부 및 하위부로 구분하여 파라핀 포매괴를 만들었다.
각 조직은 Hematoxyline & Eosin(H&E) 염색, Modi - fied Movat 염색과 Masson Trichrome 염색을 하였고 collagen type Ⅰ(1：2000, Sigma Biosciences), 평활 근 α-actin(1：250, Sigma Biosciences), proliferating cell nuclear antigen(PCNA, 1：100, DAKO)에 대한 단클론항체를 이용하여 면역조직화학적 염색을 하였다.
Modified Movat 염색을 위해 파라핀 포매괴의 조직 을 xylene과 alcohol을 사용하여 함수 단계 후 60℃
오븐에서 전가열하였고 매염작용을 하는 bouin 용액에 담근 후 오븐에 45초간 처리하였다. 이후 순차적으로 1% alcian blue와 alkaline alchol, Musto working solution에 처리하였고 각 단계 중간에는 흐르는 물에 수세를 하였고 그 후 Crocein Scarlet/Acid fuchsin에 1분간, 5% phosphotungstic acid에 5분간 담근 후 alcohol을 거쳐 Alcoholic Saffron을 처리하였다.
11)Fig. 1. Diagram shows the calculation method of area of neointima area and pathologic area stenosis (A).
A stented porcine coronary artery at 14 days after stenting (B). Movat pentachrome stain, Magnificati- on ×20 A： adventitia, M： media, NI： neointi-ma, IEL：internal elastic lamina.
Fig. 2. Movat pentachrome stain (collagen stains yellow；proteoglycans, blue-green；elastin, black).
Blue colored proteoglycan is shown as the predo- minant component in the neointima of a stented porcine coronary artery at 14 days after stenting (A).
Yellow colored collagen is shown as the predominant component in the neointima of a stented porcine coronary artery at 56 days after stenting (B). Magni- fication ×200.
A
B A
B
면역조직화학염색은 조직을 탈파라핀 후 0.3% H
2O
2의 methanol용액을 사용하여 조직 내 내재하는 pero - xidase 활성을 억제시키고 10% 정상 염소 혈청에 의 하여 항체의 비특이적 결합을 차단하였다. 조직을 일차 항체와 반응시킨 후 avidin biotin peroxidase tech - nique을 이용하였으며 DAB(3.3′ diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma, St. Louis, MO, USA) 발 색제를 사용하였다.
조직 병리학적 평가
조직 병리 측정 및 관찰은 두 명의 병리학자와 함께 측 정하였고 Visus 2000 Visual Image Analysis System 을 이용하였다. 손상된 혈관의 조직을 근위부, 중위부 및 원위부로 분류하여 스텐트 시술 혈관의 신생내막의 두께, 내강 면적, 신생내막의 면적을 측정하였다. 스텐트 근위부 와 원위부 혈관을 기준 혈관으로 하여 두 혈관의 평균값 을 기준 혈관으로 하였다. 동맥의 경계는 manual 방식으 로 그리며 신생내막의 영역은 혈관의 내탄력층(internal elastic lamina)에서 내경을 빼서 계산하였고 조직병리학 적 백분율 협착은(1-내경면적/ 내탄력층 면적)×100으 로 기존의 확립된 방법을 이용하여 계산하였다(Fig. 1).
9)스텐트 과확장 손상 방법에 의한 혈관 손상의 평가는 혈관벽의 손상지수는 내탄력층이 손상되지 않고 내피 세포만 손상된 경우를 0점, 내탄력층이 손상되고 중막 이 눌린 경우 1점, 내탄력층과 중막이 파괴된 경우를 2 점, 중막과 외탄력층이 파괴된 경우를 3점으로 하였다.
PCNA index는 혈관의 12시, 3시, 6시, 9시 방향의 신 생내막에서 400 배율 하에 관찰되는 세포 중에서 양성 을 보이는 세포 수의 비로 하였다.
10)통계학적 분석
통계적 분석에는 MS Windows
®용 SPSS-PC 11.0 (Statistical package for the social sciences, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA test로
검증하였고 상관관계를 알아보기 위하여 Spearman’ s rho를 이용하였으며 수치는‘평균값±표준편차’의 형 식으로 표시하였다. p 값이 0.05 미만인 경우에 통계학 적으로 유의하다고 판정하였다.
결 과
돼지 관상동맥 재협착 모형을 이용하여 15마리의 돼 지에 21예의 관상동맥 스텐트 시술 후 각각 7예씩을 14일(Ⅰ군), 28일(Ⅱ군), 56일(Ⅲ군)에 희생시켜 관상 동맥의 병리조직학적 검사를 하였다.
Ⅰ군에서는 좌전하행지에 4예, 우관상동맥에 2예, 좌 회선지에 1예의 스텐트를 시술하였고 Ⅱ군은 각각 3예, 3예, 1예의 스텐트를 시술하였으며 Ⅲ군에서는 각각 3 예, 2예, 2예를 시술하였다.
혈관 손상 지수 및 신생내막 영역
관상동맥 혈관 세포 손상 지수는 Ⅰ군 1.16±0.37,
Ⅱ군 1.34±0.50, Ⅲ군 1.29±0.83으로 각 군에서 차 이가 없었다.
내탄력층의 영역은 Ⅰ군 3.99±0.50, Ⅱ군 4.46±
0.94, Ⅲ군 3.45±1.22 mm
2였으며(Ⅰ군 대 Ⅱ군：
p＝0.61, Ⅰ군 대 Ⅲ군：p＝0.51) 신생내막의 영역은
Ⅰ군 0.75±0.32, Ⅱ군 1.45±0.78, Ⅲ군 1.62±0.51 mm
2이었고(Ⅰ군 대 Ⅱ군：p＝0.08, Ⅰ군 대 Ⅲ군：
p＝0.03) 조직 병리학적 협착률은 Ⅰ군 18.8±7.4, Ⅱ 군 34.2±0.2, Ⅲ군 43.1±28.4%이었다(Ⅰ군 대 Ⅱ 군：p＝0.35, Ⅰ군 대 Ⅲ군：p＝0.02, Table 1).
신생내막에서 기질 분포
H & E 염색에 의한 신생내막 기질분포는 전체적으 로 저밀도성인 경우가 12예, 고밀도성인 경우 3예, 스 텐트 주변만 저밀도성인 경우 3예, 저밀도성과 고밀도 성 조직이 혼합된 경우 1예, 신생내막의 형성이 많아지 Table 1. Histopathologic assessment of stented porcine coronary arteries
Group I (14 days) Group II (28 days) Group III (56 days)
IEL area (mm
2)
0003.99±00.50 0004.46±0.94 003.45±01.22Lumen area (mm
2)
0003.24±00.52 0003.01±1.33 001.83±01.49Neointima area (mm
2)
0000.75±00.32 0001.45±0.78 001.62±00.51*Area stenosis (%)
0018.80±07.4 0034.20±0.2 043.10±28.4*PCNA (%)
0016.50±14.4 0000.50±0.7† 000.80±00.7*IEL：internal elastic lamina, PCNA：proliferating cell nuclear antigen. *：p<0.05：group I vs. group III, †：
p<0.05：group I vs. group II
면서 중막에 연접한 신생내막의 조직은 고밀도성이나 혈관 내경 쪽 조직은 저밀도성의 분포를 보이는 경우가 5예였다. 신생내막이 전체적으로 저밀도성인 경우가 Ⅰ 군 5예, Ⅱ군 4예, Ⅲ군 3예였으며 고밀성도인 경우 3 예는 Ⅱ군이었다. 중막에 연접한 신생내막의 조직은 고 밀도성이나 혈관 내경 쪽 조직은 저밀도성의 분포를 보 이는 경우는 Ⅰ군 2예, Ⅲ군 3예였고 스텐트 주변이 저 밀도성인 경우는 Ⅱ군 1예, Ⅲ군 2예였다.
Collagen과 Proteoglycan의 분포
세포외기질은 Modified Movat 염색에서 proteogl - ycan은 청색, collagen은 황색으로 염색되었고 colla - gen과 proteoglycan이 혼합된 부분은 녹색으로 염색 이 되었으며, elastin은 흑색으로 염색되었다. Type Ⅰ collagen은 신생내막에는 초기에는 약하게 양성을 보 이다가 28일 이후 진하게 염색이 되었다(Fig. 2).
신생내막과 중막의 proteoglycan은 스텐트 삽입 초
기에 풍부하였고 주수가 증가하면서 비율이 감소하였 다. 신생내막 내 collagen 비율은 Ⅰ군 23.5±4.7, Ⅱ 군 27.7±5.0, Ⅲ군 36.6±10.5%이었다(Ⅰ군 대 Ⅱ
A
B
A
B
Fig. 5. Immunohistochemical staining for smooth mus- cle a-actin. Positive cells are stained as brown and nuclei of negative cells are stained as blue color. The neointima of a stented porcine coronary artery at 14 days after stenting (A). The the neointima of a sten- ted porcine coronary artery at 28 days after stenting (B). Magnification ×200.
Fig. 4. The content ratio of collagen within the neoin- tima was well correlated with the pathologic area stenosis. Magnification ×200.
Fig. 3. A weak immunostaining with type I collagen in
neointima and adventitia of a stented porcine coro-
nary artery at 14 days after stenting (A). An intense
immunostaining with type I collagen in neointima and
adventitia of a stented porcine coronary artery at 28
days after stenting (B). Magnification ×200.
군：p＝0.52, Ⅰ군 대 Ⅲ군：p＝0.02, Fig. 3). Colla - gen 비율은 조직 병리학적 협착률에 양의 상관관계를 보이며 증가되었다(r＝0.53, p＝0.03, Fig. 4).
신생내막의 세포증식률과 평활근 세포
Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ군에서 관찰된 신생내막 내 세포는 평활근 세포 a-actin 양성을 나타내었다(Fig. 5).
PCNA index에 의한 세포증식률은 Ⅰ군 16.5±14.4,
Ⅱ군 0.5±0.74, Ⅲ군 0.83±0.68%이었고(Ⅰ군 대 Ⅱ 군：p＝0.01, Ⅰ군 대 Ⅲ군：p＝0.01, Table 1), Ⅱ군 과 Ⅲ군 조직의 7례에서는 PCNA 양성 세포를 관찰할 수 없었다(Fig. 6).
고 찰
본 연구에서 돼지 관상동맥 스텐트 재협착 모형을 이용하여 관상동맥 스텐트 재협착에 관여하는 신생내
막 증식의 기전을 알아본 결과, 관상동맥 스텐트 시술 후 2주에는 풍부한 proteoglycan 성분이 세포증식과 함께 신생내막 형성에 관여하였고 스텐트 시술 후 4주 에는 collagen 증가가 스텐트 재협착에 관여함을 알 수 있었다. 따라서 신생내막 내 세포증식뿐만 아니라 세포 외 기질의 증가도 관상동맥 스텐트 재협착에 중요한 역 할을 함을 알 수 있었다. 이러한 연구의 결과는 향후 관상동맥 스텐트 시술 후 재협착 예방을 위한 새로운 접근의 필요성을 제시하는 것으로써, 스텐트 시술 초기 에는 신생내막 세포증식 억제에 대한 시도가 이루어져 야 하고 스텐트 시술 후기에는 세포외기질의 증가 억제 에 대한 시도가 이루어져야 한다고 생각된다.
최근의 연구에 의하면 스텐트 시술 후에 발생하는 혈 관의 손상에 따른 혈전, 염증 반응, 육아조직이 형성과 정을 거친이후 평활근 세포의 증식과 세포외 기질의 축 적에 의한 신생내막 형성, 외막의 반응 등에 의하여 이 루어진다고 밝혀지고 있다.
4)5)스텐트를 시술 받았던 사람의 부검 조직의 연구에서 관상동맥 스텐트 시술 후 급성기에는 먼저 얇은 다층의 혈전(thrombus)이 형성 되고 평활근 세포가 신생내막의 주요 성분이며, 세포외 기질이 점차 증가되고 염증 세포인 T 림프구와 대식세 포가 침착되며 후기에는 완전한 내막의 재형성(reen - dothelialization)이 관찰되었다.
13-15)특히 신생내막 형 성에는 중등도 세포율을 지니면서 proteoglycans과 매 우 정렬된 collagen이 풍부한 세포외기질, 즉 fibrop - roliferative 조직으로 알려진 myxomatous 조직이 관 여한다고 알려져 있다.
18)본 연구에서 신생내막에서 세 포외기질은 전체적으로 저밀도인 경우가 가장 많았고 스텐트 주변만 저밀도인 경우나 저밀도와 고밀도 조직 이 혼합된 경우가 있었으며, 신생내막의 형성이 많아지 면 중막에 연접한 신생내막의 조직은 고밀도성이나 혈관 내경 쪽 조직은 저밀도성의 분포를 보이는 경우가 일부 관찰되었다. 최근의 보고에 의하면 myxomatous tis - sue의 stellate cell은 S100 양성, CD1a 양성, HLA- DR 양성, periocyte marker를 발현하는 mesenchy - mal cell의 한 형태이며 면역 기능에 관여한다고 알려 져 있다.
17)또한 재협착 부위는 proteoglycan과 fibril - lar collagen이 풍부한 영역이 각각 존재하며, 동맥의 탄력성, 투과도, 지질대사, 혈전, 세포 부착, 세포 증식 과 이동에 관련되어 있다고 알려진 proteoglycan은 면 역조직화학적 염색을 하였을 때 versican(chondroitin A
B
Fig. 6. Immunohistochemical staining for PCNA. Posi- tive cells are stained as a brown color. High PCNA index is shown in the neointima of a stented porcine coronary artery at 14 days after stenting (A). Low PCNA index is shown in the neointima of a stented porcine coronary artery at 56 days after stenting (B).
Magnification ×400.
sulfate proteoglycan), biglycan(dermatan sulfate proteoglycan) 등이 염색되었다.
16)18)19)본 연구에서 collagen 비율은 혈관의 병리학적 협착 율과 양의 상관관계를 나타내면서 증가되었고, 신생내 막에서 collagen 분포 비율이 Ⅱ군 27%, Ⅲ군 37%로 써 collagen이 혈관의 가장 풍부한 세포외기질 성분이 며 세포외기질 이동의 주요 물질이 될 수 있다는 타 보 고와 일치된 소견이다.
20)Wesley 등
21)은 동맥경화성 기질의 주된 구성 성분인 collagen type Ⅰ과 상호작용 이 matrix metalloproteinase-9의 생성과 세포내 지 질 축적을 포함한 대식 세포의 기능을 조절하고 유도하 는지 조사하였다. 그 결과 collagen type Ⅰ과 지질 축 적, 단핵구의 확산 사이에 상관관계가 있었으며, 세포 외기질이 동맥경화 죽상종에 특징적인 대식세포의 기 능을 조절한다고 보고하였다. 또한 fibronectin, colla - gen Ⅰ이 대식세포 ApoE 발현과 ApoE 합성을 자극 하였고 혈관 손상 후 세포외기질의 변동이 cytokine과 성장인자를 생산하는 반응을 보였다.
22)토끼 혈관의 중복 손상 모델에서 혈관 손상 후 첫 4 주에 proteoglycan, collagen, elastin의 합성이 증가되 었다.
23)관상동맥 풍선확장술 후 여러 시기의 atherec - tomy 조직에서 fibronectin, tenascin-C, collagen Ⅰ 과 Ⅲ, versican 등을 조사한 결과, 일 개월 이내에 평 활근 이동과 증식이 왕성한 시기에 tenascin-C가 일 시적으로 증가되었다가 감소되었고 임상적 재협착이 가장 왕성한 1~3개월에는 versican이 최고치에 이르 렀으며, 후기에는 versican이 성숙한 세포외기질인 collagen Ⅰ과 Ⅲ으로 대치되었다.
24)또한 추적 관상동 맥 조영술에서 재협착 진행 시기와 versican의 증가 시기가 일치되어 재협착의 세포외기질의 역할을 예측 할 수 있었다. 본 연구의 결과에서도 신생내막과 중막 의 proteoglycan은 스텐트 삽입 초기에 풍부하였고 시 간의 경과에 따라서 비율이 감소하였고 신생내막 내 collagen 비율은 시간이 경과되면서 증가되었다. 이와 같은 세포외기질의 시간에 따른 변화는 신생내막 형성 에 있어 각각의 구성 성분의 생물학적 역할이 다를 수 있음을 암시하였다. Proteoglycan은 수분을 흡수하는 chondroitin sulfate proteoglycan이며 hyaluronan과 상호작용을 하며 이는 myxoid 세포외기질이 부풀어져 혈관 내경을 좁혀서, 관상동맥 스텐트 재협착의 초기 과정에 관여하리라 생각된다.
돼지 관상동맥 모형에서 스텐트 삽입이나 PCI 후 신 생혈관의 주 구성성분이 혈관 평활근 세포이고 신생내 막 형성의 주된 물질이며 세포외기질 요소를 합성할 수 있다는 보고가 있다.
25-27)평활근 세포의 신생내막으로 이동이 동맥경화와 재협착에 중요하며, platelet-deri - ved growth factor, fibroblast growth factor-2, tumor growth factor-b는 평활근 세포이동을 조절하 는 신호이고 세포외기질이 세포이동을 조절한다고 알 려져 있으며, 본 연구에서도 신생내막의 세포외기질과 α-actin 양성 세포를 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 세포증식이 스텐트 시술 후 14일째 신생내막 조직은 16.5%가 PCNA 양성 세포였으나 28 일과 56일째 신생내막 조직은 1% 미만의 세포증식률 을 나타내었다. 동맥 이식편이나 directional coronary atherectomy를 이용하여 얻은 스텐트 내 신생내막의 조직을 이용한 국내 연구에서도 myxoid tissue는 대부 분 매우 낮은 세포증식률을 관찰하였다.
16)특발성 동맥 경화반의 82%와 재협착 병변의 74%에서 PCNA 양성 세포를 발견할 수 없었고 나머지 표본은 대부분 1% 이 하의 세포증식률을 보고하였다.
28)반면, Kearney 등
29)은 7예의 비관상동맥에서 스텐트 재협착 조직 내에서 평활근 세포의 24.6%가 PCNA 양성세포로 높은 세포 증식률을 보고하였고 Strauss 등
30)은 신생내막과 중막 의 세포 증식이 1주경에 최고치 4.8%에 이르며 2주경 에는 감소하였고 collagen, elastin, proteo -glycan 합 성이 4~10배 증가된다고 하였다.
본 연구 결과는 세포증식이 스텐트 시술 후 14일째
신생내막 조직은 16.5%가 PCNA 양성 세포였으나 28
일과 56일째 신생내막 조직은 1% 이하의 세포증식률
을 나타내어 신생내막 형성과정에서 최초 1~2주 이내
에는 세포증식이 왕성하게 일어나지만 스텐트 시술 15
일 이후에는 신생내막 형성과정에서 세포증식률이 전
반적으로 낮아지고 세포 증식이 거의 일어나지 않았음
을 보여주었다. 세포증식은 초기에 왕성하였고 28일경
부터는 매우 낮은 세포증식률을 보였으나 신생내막 형
성은 56일경에도 지속적으로 일어나 이 시기에는 세포
증식보다는 세포외기질이 재협착에 관여할 가능성을 시
사하였다. 즉, 관상동맥 스텐트 시술 후 재협착 예방을
위한 시도로서는 초기에는 세포 증식을 억제 하는 요법,
후기에는 세포외 기질을 억제하는 방법이 효과적일 것
으로 생각되었다.
본 연구의 제한점은 스텐트 시술 후 14일 이전이나 56일 이후의 신생내막과 세포외기질 분포를 정확히 알 수 없었다는 점이며, collagen 이외의 세포외기질의 주 요 성분에 해당하는 versican, biglycan에 대한 돼지 특이적 면역조직화학염색법을 시행하지 못하였다는 점 등이다. 또한 정상 돼지 관상동맥에 과확장 손상을 가 하여 얻은 결과이므로 사람의 관상동맥에 오랜 기간동 안 발생한 죽상동맥경화종 병변에 적용할 수 있는 가에 대한 입증이 더 필요할 것으로 생각되었다.
결 론
돼지 관상동맥 스텐트 재협착 모형에서 관찰한 신생 내막의 proteoglycan은 스텐트 시술 초기에 풍부하였 고 주수가 증가하면서 비율이 감소하였으며 collagen 은 스텐트 시술 후 시간 경과에 따라 증가되었다. 세포 증식은 초기에 왕성하였고 스텐트 시술 4주부터는 매 우 낮은 세포증식률을 보였다. 즉, 관상동맥 스텐트 재 협착에서 초기에는 세포증식이 신생내막 형성에 주로 관여하나, 후기에는 세포외 기질의 증가가 신생내막 형 성과 연관되어 있음을 알 수 있었다.
요 약
배경 및 목적 ：
경피적 관상동맥 중재술은 약물요법에 반응하지 않 는 관상동맥 질환에 대한 치료방법의 하나로서 확립되 어 있으며, 관상동맥 중재술 방법 중 관상동맥 스텐트 시술이 가장 효과적인 방법의 하나로 알려져 있다. 그 러나 스텐트 시술 후에도 재협착률이 20~30%로서 비 교적 높은 편이어서 스텐트 시술 후 재협착이 여전히 해결되어야 할 문제점으로 남아 있다. 이러한 관상동맥 스텐트 재협착의 기전으로는 주로 신생내막 세포의 증 식이 관여한다고 알려져 있다. 이러한 신생내막의 증식 은 신생내막 세포뿐만 아니라 세포외 기질 축적과 세포 외 기질을 통한 세포의 이동이 중요한 기전의 하나일 것으로 생각되어, 본 연구에서는 돼지 관상동맥에 스텐 트 시술 후 시간 경과에 따른 세포외기질의 분포 및 세 포 증식률과 스텐트 재협착의 형성 관계를 알아보았다.
방 법 ：
돼지 관상동맥 스텐트 재협착 모형을 이용하여 21개
의 관상동맥 스텐트를 시술한 후 각각 7예씩 14일(Ⅰ 군), 28일(Ⅱ군), 56일(Ⅲ군)에 희생시켜 병리조직학적 검사를 하였다. 각 조직은 Hematoxylin & Eosin, Mo - dified Movat, Masson Trichrome 염색법 등을 이용 하여 염색하였고 면역조직화학적 염색은 collagen type
Ⅰ, smooth muscle α-actin, proliferating cell nucl - ear antigen(PCNA) 등에 대한 단클론 항체를 이용하 였으며, Visus 2000 Visual Image Analysis system 을 이용하여 분석하였다.
결 과 ：
관상동맥 혈관 세포 손상 지수는 각 군에서 차이가 없었고 신생내막의 영역은 Ⅰ군 0.75±0.32, Ⅱ군 1.45
±0.78, Ⅲ군 1.62±0.51 mm
2이었으며(Ⅰ군 대 Ⅱ 군, Ⅰ군 대 Ⅲ군：각각 p＝0.08, p＝0.03), 조직 병리 학적 협착률은 Ⅰ군 18.8±7.4, Ⅱ군 34.2±0.2, Ⅲ군 43.1±28.4% 이었다(각각 p＝0.35, p＝0.02). 신생내 막 내 collagen 비율은 Ⅰ군 23.5±4.7, Ⅱ군 27.7±
5.0, Ⅲ군 36.6±10.5%이었고(각각 p＝0.52, p＝
0.02). Collagen 비율은 조직 병리학적 협착률에 양의 상관관계를 보이며 증가되었다(r＝0.53, p＝0.03). 신 생내막과 중막의 proteoglycan은 스텐트 삽입 초기에 풍부하였고 주수가 증가하면서 비율이 감소하였으며 신생내막 내 세포들에서 평활근 α-actin 양성을 나타 내었다. PCNA에 의한 세포증식률은 Ⅰ군 16.5±14.4,
Ⅱ군 0.5±0.74, Ⅲ군 0.83±0.68%로서 28일째부터 는 낮아졌으며, Ⅱ군과 Ⅲ군 조직의 7례에서는 PCNA 양성 세포를 관찰할 수 없었다(각각 p＝0.01).
결 론 ：
관상동맥 스텐트 시술 후 2주에는 풍부한 proteog - lycan 성분이 세포증식과 함께 신생내막 형성에 관여 하였고 스텐트 시술 후 1개월 후에는 collagen 증가가 스텐트 재협착에 관여함을 알 수 있었다. 즉, 관상동맥 스텐트 재협착에 있어서 세포증식뿐만 아니라 세포외 기질의 증가도 관상동맥 스텐트 재협착에 중요한 역할 을 함을 알 수 있었다.
중심 단어 ：관상동맥질환；스텐트；재협착.
본 연구는 (CUHRI-U-200245) 전남대학교병원 임상연 구소 연구비의 지원에 의해 이루어졌음.
