접수일：2007년 11월 17일, 승인일：2007년 12월 17일
책임저자：임 채 승 425-707 경기도 안산시 단원구 고잔동 516 고려대학교 의과대학 안산병원 진단검사의학과
TEL: 031) 412-5300, FAX: 031) 412-5314, E-mail: malarim@korea.ac.kr 본 연구는 2007년 Seoul R&BD program의 지원에 의해 수행되었음.
아시아인의 Duffy 항원의 유전자형 분포에 관한 연구
임채승ㆍ김영기ㆍ이갑노
고려대학교 의과대학 진단검사의학교실
= Abstract =
The Duffy Blood Group Genotypes in Asian Populations
Chae Seung Lim, Young Kee Kim, Kap No Lee
Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea
Background: Duffy phenotypes vary widely among different ethnic groups and populations from distinct locations. Several assays for genotyping Duffy blood groups have recently been developed, and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) is the most widely used method for human Duffy blood group typing.
In this study, we employed PCR-RFLP and analyzed the genotypes of Duffy blood groups among five Asian populations including a Korean population.
Methods: Two-hundred-fifty-four peripheral blood samples were collected from different Asian populations. PCR was performed by using primers designed for the amplification of the GATA and FYAB regions of the Duffy gene. The restriction enzymes Sty I and Ban I were used for the digestion of PCR products and the DNA products were separated on agarose or polyacrylamide gels stained with ethidium bromide.
Results: The genotype frequencies of FY*A/FY*B, FY*A/FY*A, FY*B/FY*B, FYnull in the Korean population were 14.2%, 84.9%, 1%, 0% respectively. The frequency of the Duffy genotype of Thai, Chinese and Pilipino populations were similar to that of the Korean population. However, a population from Bangladesh had a high FY*B frequency (43.4%) as compared to the other Asian populations.
Conclusion: Among the five Asian populations analyzed, the Duffy genotype for a Bangladesh population is different from the East Asian populations. This finding may reflect a history of human migration of ancient Asian populations. (Korean J Blood Transfus 2007;18:145-151)
Key words: Duffy, Asian, PCR-RFLP
Table 1. DNA sequences and DHPLC analysis conditions for oligonucleotide primers used for Duffy blood group system
Primer Nucleotide sequence Expected size (bp)
GATA-1up 5’-GTAAAATCTCTACTTGCTGGAAG-3’ 142 bp[r1]
GATA-1dn 5’-CCATGGCACCGTTTGGTTCAGG-3’
FYAB1 5’-TCCCCCTCAACTGAGAACTC-3’ 306 bp
FYAB2 5’-AAGGCTGAGCCATACCAGAC-3’
서 론
사람의 적혈구에는 500개 이상의 혈액형 항원 이 존재하고 각각의 유전자 빈도는 인종에 따라 차이를 보이므로 인종별로 적혈구 항원의 표현 빈도도 다르게 나타난다. 대부분의 혈액형 항원 들은 면역성(immunogenecity)이 약하여 항체 형 성을 잘 유발시키지 못하며, 인구집단에 따라서 대부분의 사람에 존재하거나 극소수에게만 존재 함으로써 임상적으로 중요한 의미를 지니지 않게 된다. 보통 임상적으로 중요한 혈액형 항원군은 20개 정도에 불과하다.1)
Duffy 혈액형은 다회 수혈을 받은 혈우병환자 에서 처음 발견하여 그 이름을 따서 명명되었 다.2) 두 개의 우성 allele인 FYA와 FYB가 염색체 1번에 위치하는데 항원은 44번 위치의 아미노산 서열 변화로 인해 Fya와 Fyb항원으로 나뉘어진 다.3-5) Fy(a-b-) 표현형의 경우 서부 아프리카나 미 국흑인에게서 주로 발견되는데 이는 삼일열 말라 리아가 적혈구에 침입하기 위해서는 Duffy항원 을 필요로 하므로 말라리아 감염을 피하기 위해 서 적응과정에서 선택된 것으로 여겨지고 있다.
서부아프리카 흑인의 경우 95%에서 Fy(a-b-)표현 형을 보인다.6-8) 따라서 인종이나 지역마다 Duffy 혈액형의 분포에 차이가 있는데 최근 삼일열 말 라리아가 심하게 유행하는 파푸아 뉴기니아 지역 의 원주민에서도 Fy(a-b-) 표현형이 나타난다는 보고도 있다.9,10) 본 연구에서는 한국에 거주하는
5개국 아시아인들에서 Duffy 항원 유전자형 빈도 검사를 통해 아시아인에서의 분포양상을 확인하 고자 하였다.
대상 및 방법
1. 연구대상
Duffy 혈액형 유전자형 분석을 위해 고려대학 교 안산병원 임상연구심의위원회의 연구승인을 받아 2002년 3월부터 2007년 8월까지 고려대학교 안산병원에 내원한 한국인 정상인 지원자 107명 과 태국인 34명 방글라데시인 43명 필리핀인 16 명 중국인 54명에서 총 254명에서 EDTA tube에 혈액을 채혈 하였고, 이 검체로부터 유전자형 분 석을 실시하였다. Duffy 혈액형 표현형 검사의 경 우 유전자검사의 확인 목적으로만 실시하였고 본 연구 전체에서는 실시하지 않았다.
2. 방법
1) Duffy 항원의 표현형 검사
Duffy 항원의 표현형검사는 단클론성 항체를 이용한 상업용시약(Biotest AG, Dreieich, Ger- many)으로 검사하였다. 항-Duffy 혈청과 2∼5%의 혈구 부유액을 시험관에 동량 넣고 37oC에서 30 분간 항온 시킨 후 3,400 rpm에서 15초간 원심침 전을 한 다음 응집을 관찰하였고 음성인 경우 항 글로블린 시약을 첨가하고 항온과 원심침전을 시
Fig. 1. (A) Schemic illustration of Duffy gene PCR- RFLP analysis. Each fragment sizes in promoter and exon regions mean final products after restriction enzy- me digestion. (B) RFLP analysis of PCR products am- plified with FYAB1/FYAB2 primer set, using Ban I after electrophoesis in 3% agarose gel. Lane M shows the DNA ladder (bp). Lanes 1 is the result from the samples with FY*A/A genotypes. Lanes 2 is the sam- ples with FY*A/B. Lane 3 is the sample with FY*B/B genotypes. (C) RFLP analysis of PCR products am- plified with GATA-1up/GATA-1dn primer set, fol- lowed by Sty I digestion. Electrophoresis was done on 12% Polyacrylamide gel for the detection of GATA mutation. Lane SM shows the DNA ladder (bp). Lane 1, homozygote wild type. Lane 2, 3, heterozygote and homozygote for T-46C mutation, respectively.
행한 후 응집을 관찰하였다．
2) Duffy 항원의 유전자형 검사
Duffy 항원의 유전자형 분석을 위하여 중합효소 연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR) 및 제 한효소절편법(restriction fragment length polymor- phism, RFLP)을 이용하였다.
(1) 시발체(primer) 선정: 시발체는 Reid M.E 등과 Zimmerman 등이 발표한 것을 일부 수정하 여 사용하였다(Table 1).9,11)
(2) DNA 추출: EDTA가 첨가된 말초혈액 50 uL에 MIPsafeTM blood Mini Kit (GenoteinⓇ, 한국) 를 이용하여 추출한 뒤 80oC에서 보관하여 사용 하였다.
(3) 중합효소연쇄반응: 중합효소연쇄반응을 위 하여 100 uL 반응액에 genomic DNA를 0.5∼1.0 ug, 시발체는 각각 10 pmol, Taq polymerase는 2.5 units (Boehringer Manheim Gmbh, ManheimⓇ, Ger- many) 등을 넣었다. 중합효소연쇄반응은 Gene- Amp PCR system 9,600 thermal cycler (Perkin ElmerⓇ, USA)를 이용하여 94oC에서 5분 처리한 후에 94oC 1분, 63oC 1분, 72oC 2분씩 35회 증폭하 였고, 마지막에 72oC에서 4분간 유지한 후 정지 하였다. 중합효소연쇄반응이 완료된 후 반응 산 물 8 uL를 취하여 0.8% agarose gel에서 전기영동 을 시행한 후 ethidium bromide (EtBr)로 염색하였 다.
(4) 제한효소 처리: 제한효소절편을 위해서 20 uL 반응액에 증폭산물 5 uL를 넣고, 10× buffer 2 uL, 제한효소(Sty I, Ban I, New England BioLab, UK)를 10 units 넣었다. 각각의 GATA 및 FYAB의 증폭산물에 대한 제한 효소의 절단부위는 다음과 같다(Fig. 1A). GATA 유전자 증폭산물의 경우 12% Polyacrylamide gel에서, Duffy 항원의 FYAB 유전자형 검사에는 제한효소 Ban I로 절단된 단 편들은 3% agarose gel에서 전기영동을 시행한 후
Table 2. Genotyping results for Duffy blood group in Asian samples Genotyping
Genotype Korean (%) Chinese (%) Thailand (%) Philiphine (%) Bagladesh (%) Total
FY*A/FY*B 15 14.0 5 14.7 5 11.6 2 12.5 17 31.5 44
FY*A/FY*A 91 85.0 29 85.3 38 88.4 14 87.5 30 55.6 202
FY*B/FY*B 1 0.9 0 0.0 0 0 0 0 7 13 8
FYnull 0 0.0 0 0.0 0 0 0 0 0 0 0
Total 107 34 43 16 54 254
EtBr에 염색된 밴드를 관찰하였다.
결 과
1. Duffy 혈액형 유전자 promotor GATA 영역에서 중합효소연쇄반응 증폭산물에 대한 제한효소 절단 양상 분석
최종 중합효소반응에서 얻어진 323 bp의 결과 물에서 유전자형 분석에서 Sty I을 처리한 경우 T-46C 염기서열변화가 나타나 Fy(a-b-) 표현형으 로 나타난 경우 138 bp, 108 bp, 65 bp, 12 bp의 네 개 밴드로 나누어지고(12 bp의 밴드는 보이지 않음) Fy(a-b-)이외의 다른 유전형의 경우 T-46C 염기서열 변화가 일어나지 않아 138 bp, 108 bp, 77 bp로 나타났다. 두 유전자가 섞여 있는 hetero- zygote의 경우 12 bp, 65 bp, 77 bp, 108 bp, 138 bp의 band가 모두 관찰되었다. 아시아인에서는 Fy(a-b-) 표현형이 나타나지 않아 모두 138 bp, 108 bp, 77 bp의 밴드만 보였다.
2. Duffy 혈액형 유전자 FYAB 영역에서 중합효소연쇄반응 증폭산물에 대한 제한 효소 절단 양상 분석
최종 중합효소반응에서 얻어진 392 bp의 결과 물에서 유전자형 분석에서 Ban I을 처리한 경우
G625A염기서열차이로 변화가 나타나 FY*A/FY*A 유전형으로 나타난 경우 210 bp, 96 bp, FY*B/
FY*B의 경우 86 bp, 306 bp, FY*A/FY*B의 경우 86 bp, 96 bp, 210 bp, 306 bp 네개의 밴드로 나누 어 나타났다. 총 254명의 한국인 및 외국인에서 Duffy 혈액형의 유전형을 검사한 결과, FY*A/
FY*B, FY*A/FY*A, FY*B/FY*B, FY*null의 분포는 한국인의 경우 각각 14.0%, 85.0%, 1%, 0%이었으 며, 태국인은 11.6%, 88.4%, 0%, 0%로, 중국인의 경우 14.7%, 85.3%, 0%, 0%, 필리핀인의 경우 12.5%, 87.5%, 0%, 0%, 방글라데시인의 경우 31.5%, 55.6%, 13.0%, 0%로 나타났다(Table 2).
고 찰
일반적으로 Duffy 혈액형군의 표현형 검사는 단클론성 항체를 이용한 혈구응집반응을 이용하 는데, 검사에 이용한 시약의 종류 및 비특이적인 항원 강도 등이 나타나면 의해 잘못 검사될 수 있 다.1) Duffy 항원군에 속하는 항체는 검사에 반응 성이 약하여 잘 검출되지 않고, 항원 자극이 없어 지면 항체 역가도 급격히 감소한다.4,5) 다수에서 용혈성 수혈반응을 보여 Duffy계는 임상적으로 중요한 비예기항체로 알려져 있다.12) 적혈구 항 원에 대한 분자생물학적 typing은 그 유용성이 인 정되고 있으며 그 이외에도 신생아 용혈성 질환
의 진단, 친자 감별 등에도 그 유용성이 인정되고
있다.3,11) 적혈구 항원을 결정하는데 현재 널리 쓰
이고 있는 분자생물학적 방법 중 Duffy 혈액형 의 유전형 검사는 신선한 적혈구를 구하기 어려운 항원의 typing이 필요한 경우에도 검사가 가능한 장점이 있는데 이중 중합효소연쇄반응 산물에 대 한 제한효소절편 분석법(PCR-RFLP)이 선호되고 있다. 적당한 제한효소 절단 부위가 존재하는 경 우 유용하게 사용할 수 있다는 장점 때문이다. 하 지만 제한된 제한효소작용부위로 인해 반응 후 단절 절편의 크기가 유전형을 구분하기 쉽도록 미리 디자인하지 않는 경우 typing해석에 상당한 어려움을 줄 수 있다는 단점도 존재 한다. 본 연 구에서는 아시아인에서의 Duffy 혈액형의 유전 자형 분포를 알아보기 위해 제한효소절편 분석법 (PCR-RFLP)으로 확인해 보았다. Duffy 항원은 아 프리카 흑인에서는 거의 발견되지 않는 저빈도 항원이나 아시아 민족과 서양인에서는 비교적 높 은 빈도로 발견되므로 인류학적 중요성을 가진 다. 아프리카 흑인에서 주로 발견되는 Fy(a-b-) 적 혈구는 Plasmodium vivax에 잘 감염되지 않는 특 징을 가진다.8) Fy(a-b-)형은 거의 대부분 FY 유전 자, 특히 FY*B 대립유전자의 promotor region에서 한 개의 염기치환으로 인해서 생기는데,4,5) 이러 한 경우 비록 Fy(b+) 적혈구를 수혈 받더라도 항- Fyb를 만들지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나 최근 연구에서는 파푸아뉴기니의 P. vivax 유행지 역에서 FY*Anull 출현을 보고하였는데, 이것은 아 프리카 흑인에서 나타나는 FY*B유전자의 변이가 아닌 FY*A 유전자 중에 GATA-1 (-46T＞C) 부위 에 돌연변이로 인해 생긴 것이다.9) 최근에는 Fy(a-b-) 적혈구 항원에 대해 FYA 대립유전자 (allele)의 변이를 유세포 분석기 및 유전자 분석 을 통해서 이형접합체(heterozygote) (FY*A/FY*Anull) 와 동형접합체(homogygote) (FY*A/FY*A)의 두 분
류의 Fy 항원으로 표시되는 사실을 밝혀냈다. 이 중에서 동형접합체(FY*A/FY*A)가 이형접합체(FY*A/
FY*Anull) 보다 P. vivax에 더 감염이 잘 된다고 보 고하였다.9) 서구인에서는 Fya 음성자가 34% 정도 이며 항-Fya가 항-Fyb보다 더 자주 발견되지만, 동 양인에서는 Fya 음성자가 적고 Fyb 음성자가 많으 므로 항-Fyb가 더 문제가 된다.1) FY*A 유전자의 경우 한국인에서는 99%에서 발견되며 중국인, 태국인, 필리핀인도 비숫한 양상을 보였으나, 방 글라데시인의 경우 FY*A 유전자는 86.9%로 상대 적으로 감소되어 나타나며 반면에 FY*B 유전자 양성률이 43.4%로서 중국인에서는 14%, 필리핀 인 14%, 태국인에서는 11.8%보다 높게 나타났다.
다른 연구자들의 표현형 검사로 추론해 볼 때 중 국인의 경우 FY*B 유전자는 9.2% 태국은 31%로 나타나 태국인의 경우 본 연구보다는 높게 나타 났다. 이는 검사 방법의 차이라기보다는 참여 대 상자군의 숫자가 너무 낮아 생긴 결과로 더 많은 집단을 대상으로 다시 확인해 볼 필요가 있을 것 으로 보인다.13)
또 다른 문헌에 의하면 표현형에 기초한 FY*B 유전자 양성률은 한국인에서는 15.2%, 서구인에 서는 83%이며 같은 동양인 안에서도 큰 차이를 보인다.14) 방글라데시인의 경우 이 중간에 해당 하며 항-Fya나 항-Fyb의 존재도 같은 양상을 띨 것 으로 추정된다. 방글라데시인 뿐 아니라 같은 인 디아, 스리랑카, 남부 아시아인 등도 동남부아시 아인과 달리 비슷한 결과를 보일 것으로 추정된 다. FY*B 유전자에서 변이를 일으키는 아프리카 형의 예와 FY*A에서 변형을 일으키는 파푸아 뉴 기니아의 예를 비교하여 볼 때 방글라데시인 및 남부아시아인에서 이러한 특정 유전자의 증가 여 부 및 말라리아의 오랜 노출 자극과 관련 관계는 유전자 분석을 통해서 추후 연구되어야 할 것으 로 보인다. 본 연구에서는 한국인의 FY*B 유전자
의 비율이 과거 보고한 Fyb 항원 양성율 44%15)보 다 낮은 11.9%의 양성률을 보였고, 다른 중국 및 일본인 양성율과 커다란 차이를 보이지 않았다.
이는 유전자와 항원검사의 차이라기보다는 과거 검사에서 항원검사의 불정확성에서 기인한 것이 아닌가 추정된다. 이와 같은 Duffy 혈액형 항원에 대한 유전자형 검사는 인종이나 종족 별로 감염 성 질병과의 관계를 알 수 있고, 용혈성 질환 및 수혈 부작용 등을 미리 알고 예방하는데 도움을 줄 수 있을 것이며 혈액형 판정상 어려움이 있었 던 검체 등에 대하여 추가 확인 검사의 하나로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
요 약
배경: Duffy 혈액형은 지역과 인종에 따라 아주 다른 분포를 보인다. Duffy 혈액형 유전자형 분석 에는 여러 가지 방법이 사용되고 있으나 중합효 소연쇄반응과 제한효소절편법(PCR-RFLP)을 이 용하는 방법이 가장 널리 쓰인다. 본 연구에서는 PCR-RFLP방법을 이용하여 한국인을 포함한 아 시아 5개국에서 Duffy 혈액형을 분석하였다.
방법: 아시아인 254명의 말초 혈액 검체를 이 용하여 Duffy 혈액형 유전자형의 GATA와 FYAB 를 증폭할 수 있는 primer 사용하여 PCR을 시행 한 후 분석을 시행하였고 5uL 중합효소연쇄반응 산물들은 제한효소 Sty I, Ban I을 이용하여 소화 시켜 절단하였다. 절단된 산물은 agarose gel과 polyacrylamide gel에서 전기영동을 시행한 후 ethidium bromide 염색 후 중합효소연쇄반응 산물 의 절단 여부를 확인하였다.
결과: FY*A/FY*B, FY*A/FY*A, FY*B/FY*B, FYnull 유전자의 분포는 한국에서 각각 14.2%, 84.9%, 1%, 0%이었고 태국, 중국, 필리핀인의 경 우도 비슷한 양상을 보였으나 방글라데시인의경
우 FY*B의 빈도가 43.4%로서 다른 아시아인에 비해 높았다.
결론: 아시아 5개국인중에서 방글라데시인의 Duffy 혈액형 유전자 분포는 동부 아시아인과 다 르며 이는 아시아 인류의 이동시 인종 간 적응의 역사를 반영하는 것으로 보인다.
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