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©The Korean Society of Food Science and Technology
양파 첨가가 가열한 햄버거 패티의 heterocyclic amine 형성과
돌연변이원성에 미치는 영향
이재환·김동혁·신한승∗
동국대학교 식품공학과, Lotus 기능성식품소재연구소
Influence of Onion (Allium cepa L.) on Genotoxic Heterocyclic Amine
Formation and Overall Mutagenicity in Fried Hamburger Patty
Jaehwan Lee, Dong-Hyuk Kim, and Han-Seung Shin∗
Department of Food Science and Technology and Institute of Lotus Functional Food Ingredient, Dongguk University
Abstract
This study examined the effects of cooking temperature and onion (Allium cepa L.) tissue concentrate on
heterocyclic amine (HCA) formation in fried ground beef patties. Various amounts of onion tissue (2.0, 5.0, and 10.0%,
w/w) were added to the ground beef patties, which were then fried at two different temperatures (190 and 225
oC) for
10 min/side. The ground beef patties fried at 190
oC and containing 10.0% (w/w) onion showed a 51% decrease in
mutagenicity, and formation of 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f ]quinoxaline (MeIQx) and
2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]-pyridine (PhIP) was reduced by 58% and 63%, respectively. For the patties fried at 225
oC, total
mutagenicity decreased by 35% and 48% with the additions of 5.0 and 10.0% (w/w) onion, respectively, and PhIP
formation was reduced 50, 60, and 71% with the additions of 2.0, 5.0, and 10.0% (w/w) onion, respectively.
Key words: onion, hamburger patty, heterocyclic aromatic amine, mutagenicity
서
론
인류는 예전부터 불을 이용해 식품을 조리·가공하였다. 식품 의 가열처리는 식품의 기호성과 일부 위생적인 향상에 기여하는 반면, 돌연변이성, 발암성 물질을 생성시킨다. 즉, 태운 고기와 생 선과 같은 육류 뿐만 아니라 곡류와 콩과 같은 단백질 식품 등 을 열에서 굽고 튀길 때 유해물질들이 생성된다. 최근에는 돌연 변이성, 발암성 물질을 효과적으로 분해 또는 억제시키는 돌연변 이원성 억제인자를 찾는 것이 식품의 안전성 측면에서 중요해졌 다(1-3). 직화 또는 숯불 위에서 가열 조리된 육류나 어패류의 탄 표면에서 형성되는 돌연변이성 혹은 발암성 물질을 이환방향족 아민이라고 하며 가장 많이 검출되는 이환방향족아민에는 2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f ]quinoxaline(MeIQx), 2-amino-3,4,8 trime-thylimidazo[4,5-f]-quinoxaline(DiMeIQx), 2-amino-1-methyl-6-phe-nylimidazo[4,5-b]-pyridine(PhIP) 등(Fig. 1)이 있다(4-7). Heterocyclic amine(HCA)는 Maillard 반응과 밀접한 관계가 있는데, 즉 아미노 산과 creatine 또는 creatinine의 열분해에 의해 생성된다(8-11). HCAs는 그 화학적 구조에 따라 크게 두 종류로 나뉘어지는데 하나는 순수 아미노산의 가열 분해 산물들인 amino[α]carboline들 이고, 다른 하나는 아미노기를 가진 imidazole 고리가 quinoline이 나 quinoxaline 또는 pyridine에 붙어 있는 aminoimidazoazzarene으로 크게 나뉜다. Amino[α]carboline은 300o
C 이상의 높은 온도 에서 생성되나 aminoimidazoazzarene은 300oC 이하의 가정의 조
리조건에서도 생성된다(12,13).
국제 암 연구기구(International Agency for Research on Cancer; IARC)는 HCAs를 발암가능물질(possibly carcinogenic to human)로 구분하고 있으며 일상생활에서의 HCAs 노출 정도를 줄이라고 권장하고 있다. Rohrmann등(14)은 인간이 하루 동안 전체적으로 103-160 ng/day 정도의 HCAs를 섭취한다고 보고하였고 Felton 등 (15)의 연구에서는 인간이 MeIQx는 0.5-1.8 µg, PhIP는 0.1-13.8 µg 정도 섭취한다고 보고하였다. HCAs의 돌연변이성은 매우 큰 것 으로 알려져 있는데 강한 독성을 가진 aflatoxin B1과 비교해보면
aflatoxin B1 1µg당 Salmonella Typhimurium TA98의 역돌연변이
집락의 수가 6,000개인데 비해 HCAs 중 하나인 IQ의 경우 433,000개의 역돌연변이 집락이 나타나는 결과를 보인다(16). 조리시간과 관련해서 변이원성은 조리시간이 10분 이상 일 때 증가하는 것으로 보고되고 있으며, 온도 및 시간 변수간 비교에 서는 온도가 변이원 형성에 더 중요한 것으로 보였다(17). 또한 올리고당(18), 비타민E(19), 마늘에 함유된 황화합물(20,21), 공액리놀레산(conjugated lonoleic acid)(22), 농축대두단백(23) 등을 육류에 첨가하여 가열 조리할 경우 돌연변이원성이 감소되었다. Aoyama 등(24)은 trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)와 ferric reducing antioxidant power(FRAP) 측정을 통해 양파의 항산 화 능력을 알아보았으며 Gibis 등(25)은 가열조리 전 육류에 양 파를 첨가하여 가열 조리하면 MeIQx 형성이 최대 31.2% 정도 억제되었다. 그러나 아직 양파 첨가와 HCAs 형성억제효과와의 상관관계가 입증되지 않았다. 본 연구에서는 두 가지 다른 온도조건(190, 225o C)에서 양파 첨 *Corresponding author: Han-Seung Shin, Department of Food
Sci-ence and Technology, Dongguk University, Seoul 100-715, Korea Tel: 82-2-2260-8590
Fax: 82-2-2260-8740 E-mail: [email protected]
Received May 29, 2008; revised June 27, 2008; accepted June 28, 2008
가(2.0, 5.0, 10.0%, w/w)가 HCAs(MeIQx, DiMeIQx, PhIP)형성에 미치는 영향과 S. Typhimurium TA98 균주를 사용한 Ames assay 를 통해 항돌연변이 원성에 미치는 영향을 알아보았다.
재료
및
방법
시약 및 재료 본 연구에 사용된 햄버거 패티용 쇠고기와 양파는 지역 슈퍼 마켓에서 구입하였으며, 양파는 수세, 탈피 등의 과정을 거친 후 싹이 트는 것을 방지하기 위해 0o C에서 냉장 보관하였다. 3종의 HCA 표준물질(MeIQx, DiMeIQx, PhIP)은 Toronto Research Chemicals(Toronto, Canada)사에서 구입하였으며 표준용액은 표준 물질을 HPLC급 메탄올에 녹여 조제하였다. Polysulfonic acid(PRS) bond elute columns(500 mg), C-18 cartridge(100 mg), hydromatrix 는 Varian(Harbor City, CA, USA)사로부터 구입하였고 Extrelut-20 columns은 E.M. Separations Technology(Gibbstown, NJ, USA)로부 터 구입하여 사용하였다. 분석에 사용된 모든 유기용매는 Fisher Scientific(Fair Lawn, NJ, USA)의 HPLC 등급을 사용하였다.햄버거 패티 준비 및 조리 지방이 14±2% 포함된 갈은 쇠고기(100 g)를 이용해서 대조군 패티(양파 무첨가)와 양파가 각각 2.0, 5.0, 10.0% (w/w) 포함된 실험군 패티를 준비하였으며 믹서기를 이용하여 골고루 섞어준 후 petri dish(9×1.5 cm)을 이용하여 정형화하였다. 모든 햄버거 패티는 사용하기 전까지 -20o C에서 냉동 보관하였다. 냉동 보관된 햄버거 패티는 teflon-coated electric frying pan(Chefline Corp., Seoul, Korea)를 이용하여 표면온도가 190oC와 225oC인 상태에서
햄버거 패티의 앞·뒷면을 각각 10분씩 가열하였다. 프라이팬의 표면온도와 패티의 내부온도는 surface temperature thermometer와 thermocouple thermometer(Pacific Transducer Corp., Los Angeles, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 20분 조리 후 햄버거 패티의 내부온도는 88±4o
C이었다. 조리된 햄버거 패티는 잘게 자른 뒤 -70o
C deep freezer에 3시간 동안 넣고 얼린 다음 이를 동결건조 기(Labconco, Kansas City, MO, USA)를 이용하여 동결건조 시키 고 동결건조된 패티를 막자사발과 blender(Hanil Electronics, Seoul, Korea)를 이용하여 잘게 부수었다.
햄버거 패티에서의 HCAs 정제 및 추출
동결 건조된 패티에서 HCAs을 정제 추출하기 위해 solid-phase extraction(SPE) 방법을 사용하였으며 Gross 등(26)의 방법에 따 라 실험하였다. 정제 추출된 HCAs은 Shin 등(27)의 방법과 같 이 TSK-gel ODS80-TM column(25 cm×4.6 mm i.d.; Tosoh Haas, Montgomeryville, PA, USA)를 사용하여 분석되었다.
돌연변이원성 시험
돌연변이원성 시험은 Ames 등(28)의 방법에 따라 S-9 mixture (Molecular Toxicology, Inc., Boone, NJ, USA)존재 하에서 S. Typhimurium TA98(Molecular Toxicology, Inc.)을 균주로 사용하여 행하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 negative control(spontane-ous revertant colonies)로서 사용되었고 2-aminoanthracene는 S. Typhimurium TA98 균주의 positive control로 사용되었다. 돌연변 이원성은 Moore 등(29)의 방법에 따라 실시되었으며 용량반응곡 선(dose-response curve)을 통해 계산되었다. 즉 용량반응곡선의 liner portion은 가열 조리된 육류의 역돌연변이 집락을 나타내는 데 사용되었다. 통계처리 모든 실험 data는 3회 반복한 것이며 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Windows용 Sigma-Stat 2.0(Jandel Co. San Rafael, CA, USA)를 이용하였다. 각 군간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행하였으며 유의성은 신뢰구간 p<0.05 에서 의미를 부여하였다. 결과의 적절한 비교를 위해 Student-Newman-Keuls test를 실시 하였으며 돌연변이원성 시험은 용량반응곡선의 선형회귀분석(liner regression analysis)을 통해 육류의 역돌연변이 집락을 계산하였다.
결과
및
고찰
본 연구에서는 고체상 추출방법(SPE)을 사용하여 정체 추출하 였고 이 정제추출물을 이용하여 양파가 첨가된 햄버거 패티에서 의 HCAs 형성억제효과와 항돌연변이 활성을 알아보았다. 양파가 첨가되지 않은 햄버거 패티를 가열 조리한 후 분석한 결과 전체 회수율은 31-76%이었다. 즉, HCAs 표준용액을 바탕시료에 spike 시켜 회수율을 구한 결과 MeIQx, DiMeIQx, PhIP 각각 50±6, 37±4, 49±5%이었다. Toribio 등(30)의 연구결과에서는 3가지 HCAs의 회수율이 각각 80.8, 80.1, 57.2%이었고, Shin 등(31)의 결과에서는 74±16, 74±19, 66±16%의 회수율을 나타내었다. 표면온도가 190oC인 프라이팬에서 햄버거 패티를 가열 조리한 경우 Table 1에서 보는 바와 같이 MeIQx가 8.23±1.9 ng/g로 가장 많이 검출되었으며 PhIP는 4.24±1.2 ng/g 검출되었다. 양파의 HCAs 형성억제효과를 알아보기 위해 가열조리 전 햄버거 패티 에 양파를 각각 2.0, 5.0, 10.0% 첨가하였을 경우 MeIQx, PhIP 모두 5.0%와 10.0%에서 억제효과를 보였다. MeIQx의 경우 각 농도(5.0, 10.0%)에서 23.3, 58.0%의 HCAs 형성억제효과를 보였 으며 PhIP는 각각 38.9%, 63.0%의 형성억제효과를 보였다. 양파 를 2.0% 첨가하였을 경우 유의적인 차이가 없었다. Knize 등(32) 은 조리온도가 증가할수록 HCAs의 검출량도 증가한다고 보고하 Fig. 1. Structures of major heterocyclic aromatic amines found in cooked food.였으며 Arvidsson 등(33)의 결과에서도 225oC에서 MeIQx가 가장
많이 형성된다고 보고하였다. 프라이팬 표면온도를 225o
C로 상승 시킨 후 햄버거 패티를 가열조리한 경우 MeIQx, DiMeIQx, PhIP 각각 13.41±3.2, 4.61±1.4, 18.21±3.7 ng/g 수준으로 검출되었는데 MeIQx, PhIP의 경우 190oC(프라이팬 표면온도)에서 조리한 경우 보다 많이 검출되었다(Table 2). 쇠고기 패티에 양파(2.0, 5.0, 10.0%, w/w)를 첨가하여 225o C(프라이팬 표면온도)에서 조리한 경우 PhIP 형성이 농도의존적으로 50.3-70.5% 정도 억제되었으며 그 다음 MeIQx(31.8-44.6%), DIMeIQx(24.1-39.1%) 순으로 형성이 억제되 었다. HCAs 형성에 있어서 조리온도는 매우 중요한 요소이다 (17). Ahn 등(34)은 조리온도 범위를 180-220o C로 설정하여 가열 조리된 소고기 패티 내의 HCAs 함량을 분석한 결과 온도가 증 가할수록 검출함량이 증가한다고 보고하였고 Skog(35) 등의 결과 에서도 225o C에서 가장 많은 HCAs 검출빈도를 보였다. 본 연구 결과에서도 프라이팬 표면온도가 190o C인 경우보다 225o C인 경 우에 더 많은 HCAs가 검출되었다. 또한 양파를 햄버거 패티에 첨가시 MeIQx, DiMeIQx, PhIP 등과 같은 HCAs의 형성이 억제 되는 결과를 얻었는데(Table 1,2) 양파에는 thiosulfinate compounds (diallyl disulfide(DADS), diallyl trisulfide(DATS), dipropyl disulfide (DPDS), dipropyl trisulfide(DPTS)가 함유되어 있으며 이 성분들은 강한 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있다(36-38). 특히 DADS 가 가장 강한 항산화능력을 가진 것으로 알려져 있다(37). Kim 등 (39)은 양파의 항산화 능력을 알아보기 위해 DPPH radical scav-enging activity을 측정하였는데 비가식 부위에서 91.9%의 높은 활 성을 보였으며 Nuutila 등(40)도 양파가 32.9-78.8% 정도의 항산 화 능력을 가진다고 보고하였다.
Maillard reaction의 초기단계에서 free radical이 형성되는데 이 는 pyrazine, pyridine, pyridazine 등의 전구체 역할을 한다(41-43). 이 때 sulfhydryl group를 포함하는 DADS, DATS, DPDS 등이 강한 항산화 효과에 free radical을 제거함으로써 Maillard 반응이 억제된다(36,38). DADS의 경우 78% 정도의 HCAs 형성억제효과 를 보이는데 특히 MeIQx, DiMeIQx, PhIP의 경우 각각 68, 82, 82% 정도 형성을 억제시켰다(21). 또한 Allium속 채소류에 속하 는 양파는 flavonoid계인 quercetin과 그와 관련된 배당체 물질들 을 포함하고 있는데 가식부위에 2.26 mg/g, 비가식부위에는 208.8 mg/g 정도 포함되어 있고 이들 또한 강한 항산화 능력을 갖고 있다(44,45). 일본산 양파에는 수분(90%), 당(7.6%), 단백질(0.9%), 지질(0.1%) 등이 함유되어 있고 네덜란드산 양파에는 수용성 당(glucose, fructose, sucrose)이 33-44 g/100 g 정도 함유되어 있다(25,46,47). Kato 등(48)은 glucose 함량변화에 따른 돌연변이원성의 변화를 알아보기 위해 glucose/glycine/creat(in)ine model system를 실시하 였는데 glucose가 많이 포함될수록 돌연변이원성이 감소된다고 보 고하였다. 즉, 양파의 glucose을 포함한 당이 Maillard 반응의 전 Table 1. Effect of onion tissue addition on the formation of heterocyclic aromatic amine in hamburger patties fried at 190o
C1) Sample (%) MeIQx (ng/g)2) % Inhibition PhIP (ng/g)2) % Inhibition Control 8.23±1.9a 6.05±1.2a 2.0 8.45±1.4a NSD 7.81±1.4a NSD 5.0 6.31±1.7a 23.3 3.70±1.0b 38.9 10.0 3.46±1.3b 58.0 2.24±0.8b 63.0 1)Values are expressed on a cooked ground beef basis.
2)Means in the same columns bearing different superscripts are significantly different (p<0.05). Data represent the mean and standard deviation of three analysis per treatment (n=3). NSD=No significant difference
Table 2. Effect of onion tissue addition on the formation of heterocyclic aromatic amine in hamburger patties fried at 225o
C1)
Sample (%) MeIQx (ng/g)2) Inhibition (%) DiMeIQx (ng/g)2) Inhibition (%) PhIP (ng/g)2) Inhibition (%)
Control 13.41±3.2a 4.61±1.4 a 18.21±3.7a 2.0 13.25±3.6a NSD 4.23±1.8 a NDS 19.05±3.1b 50.3 5.0 9.14±2.8b 31.8 3.50±1.6 a 24.1 17.24±3.8bc 60.2 10.0 7.43±2.1b 44.6 2.81±1.2 b 39.1 15.37±1.2c 70.5
1)Values are expressed on a cooked ground beef basis.
2)Means in the same columns bearing different superscripts are significantly different (p<0.05). Data represent the mean and standard deviation of three analysis per treatment (n=3). NSD=No significant difference
Table 3. Mutagenic activities of hamburger patties with differing onion content fried at 190o
C and 225o C1) Sample (%) Frying temp. 190oC Inhibition (%) Frying temp. 225oC Inhibition (%) Mutagenicity (Revertants/g of meat)2)
Mutagenicity (Revertants/g of meat)2)
Control 945±56 1235±104 2.0 1945±87a NSD 1236±124a NSD 5.0 531±64b 43.8 804±101b 34.9 10.0 461±49b 51.2 639±84b 1 48.3
1)Data represent the mean and standard deviation of three analysis per treatment (n=3). 2)Means in the same columns bearing different superscripts are significantly different (p<0.05). NSD=no significant difference
구물질인 creatinine과 반응해서 결국 Maillard 반응이 억제되어 MeIQx, 7,8-DiMeIQx, 4,8-DiMeIQx 등의 형성이 억제된다(49-51). Glucose 뿐만 아니라 양파의 lactose(4%) 또한 40-70% 정도의 항 돌연변이 활성을 나타낸다(52). Table 3은 햄버거 패티에 양파를 첨가(2.0, 5.0, 10.0%, w/w)하여 가열 조리(190, 225o C)한 후 Ames assay를 통해 항돌연변이 활성을 측정한 결과이다. 양파의 첨가가 햄버거 패티 가열 중 생성되는 HCAs형성은 억제하나 높 은 온도에서 조리 시 쇠고기의 성분과 반응하여 다른 돌연변이 성물질을 생성할 수 있으므로 돌연변이원성을 측정하였다. Ames assay에서는 S. Typhimurium TA98 균주를 사용하였는데 그 이유 는 HCAs가 base pair 돌연변이 보다는 frameshift 돌연변이를 잘 일으키기 때문이다(53). 햄버거 패티에 양파를 첨가한 후 190o C (프라이팬 표면온도)에서 가열 조리하였을 경우 항돌연변이능이 각각 43.8, 51.2%이었다. 억제정도는 다르지만 Table 1의 결과와 유사하게 양파 10% 첨가 시 가장 항돌연변이 및 HCAs 형성억 제효과가 높았다. 프라이팬 표면온도를 225o C로 높혔을 경우 34.9-48.3%의 항돌연변이능을 보였는데 이 또한 Table 2의 결과와 비 슷한 경향을 나타내었다. 양파뿐만 아니라 복분자, 마늘, 체리 등을 육류에 첨가하였을 경우에도 항돌연변이 활성이 있다(20,21,54,55). 또한 Weisburger 등(56)은 녹차와 홍차를 첨가하여 glucose/creatinine/phenylalanine model system을 실시한 결과 29-91% 정도의 돌연변이 억제효과 가 있으며 특히, PhIP 형성이 가장 많이 억제된다고 보고하였다.
요
약
양파를 첨가하여 가열 조리한 햄버거 패티의 HCAs 형성과 돌 연변이원성에 미치는 영향을 알아보았다. 가열조리 전 햄버거 패 티에 양파(2.0, 5.0, 10.0%, w/w)를 첨가한 후 190o C(프라이팬 표 면온도)에서 조리한 경우 MeIQx 형성이 23.3-58.0% 억제되었고 PhIP는 38.9-63.0% 억제되었다. 반면 표면온도를 225o C로 증가시 켜 HCAs 형성억제효과를 측정한 결과 MeIQx는 31.8-44.6%, DiMeIQx는 24.1-39.1%, PhIP는 50.3-70.5%의 억제효과를 보였다. 또한 양파 첨가에 따른 항돌연변이 활성을 측정한 결과 190oC에 서는 43.8-51.2%, 225o C에서는 34.9-48.3%의 수준이었으며 양파 첨가량이 증가할수록 높은 항돌연변이 활성을 보였다. 이러한 결 과는 양파에 함유되어 있는 당(glucose, fructose, lactose), fla-vonoid계(quercetin 및 그 배당체), thiosulfinate compounds(DADS, DATS, DPDS, DPTS) 등에 의해 Maillard 반응이 억제되었기 때 문이며 결과적으로 양파가 HCAs 형성을 억제하고 돌연변이원성 을 감소시키는데 효과적임을 알 수 있었다.문
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