Korean J Vet Res(2008) 48(4) : 431~440
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Brucella abortus 국내 분리주의 세포외막 단백질 분석 및 혈청학적 비교
차승빈1·강미란1·이원정1·신민경1·조동희2·정석찬2·유한상1,*
1서울대학교 수의과대학, BK21 수의과학인력양성 사업단, 인수공통질병연구소
2국립수의과학검역원 동물위생연구소 (게재승인: 2008년 12월 15일)
Comparative serological analysis of outer membrane proteins extracted from
Brucella abortusKorean isolates and 1119-3 strains
Seung-bin Cha1, Mi-lan Kang1, Won-jung Lee1, Min-kyoung Shin1, Dong-hee Cho2, Suk-chan Jung2, Han-sang Yoo1,*
1College of Veterinary Medicine, BK 21 Program for Veterinary Science and KRF Zoonotic Diseases Institute, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea
2National Veterinary Reasearch Institute, National Veterinary Reasearch & Quarantine Service, Anyang 430-824, Korea (Accepted: December 15, 2008)
Abstract :Brucellosis is one of the most important zoonosis in worldwide. As one of the control measures, attempts have been made to develop new diagnostic methods using filed isolates as a national policy in many countries. Currently, bovine brucellosis in Korea have been received attention in both public health and economical aspects due to sudden increase of outbreak. Based on the situation, we compared standard strain (B. abortus 1119-3) with field isolates to reveal the differences among them. Biological and biochemical charateristics, antibiotic resistance profiles, outer membrane proteins (OMPs) and lipopolysaccharide analysis of the strains were included in this study. For the diagnostic purpose, an attempt was made to find out a novel antigen from the Korean isolates by serological analysis. There were differences about 55 kDa, 36-38 kDa and 20 kDa in analysis of OMPs by SDS-PAGE and Western blot with positive sera (≥1:400 in SAT titer). Also, a serological diagnostic method, ELISA was conducted using OMPs of the strains as novel antigen. Relationships between O.D. and SAT titer were analyzed using field sera showing different SAT titer. High correlation coefficient was observed between SAT titer and ELISA. Results from this study suggested that a new diagnsotic method should be developed using their own field isolates in each country.
Keywords :Brucella abortus, ELISA, Korean isolates, OMPs
서 론
브루셀라증은브루셀라속균에의한대표적인인수공 통전염병의하나로, 국내는물론전세계적으로공중보 건학적, 경제적으로심각한문제를 야기하는질병이다
[26, 29, 36]. 최근국내에서본감염증이인체와가축에
서도폭발적인증가를보이고있어국민적관심사는물
론이에대한대책이시급한실정이다 [9, 10]. 특히국
내에서는소에서혈청학적양성으로판정되는경우양 성축도살(test and slaughter) 정책에따라서살처분에따 른막대한경제적인피해를유발하는질병이다. 브루셀
라균의주요한병원성인자로는 lipopolysaccharide(LPS),
*Corresponding author: Han Sang Yoo
College of Veterinary Medicine, Seoul National University, Seoul 151-742, Korea [Tel: +82-2-880-1263, Fax: +82-2-874-2738, E-mail: [email protected]]
Outer membrane proteins(OMPs), Type IV secretion system 등다양한병원성인자를가지고있다 [2, 8, 27].
Brucella균은세포내기생함으로써질병을유발하는세
균으로그종류는다양하며각각숙주특이성을가지는 균이다. 이러한브루셀라증의진단은현재까지주로혈
청학적진단에의존하고있어서감염동물을정확하게진 단하는데많은문제점을내포하고있다 [1, 4, 6, 15, 17,
31, 33]. 또한현재세계각국에서혈청학적진단을위
하여사용되고있는브루셀라표준균주는세계적으로 동일하나세계각국에서현재발생하고있는브루셀라
증의원인균의항원적변이가능성이제시되고있다 [34].
또한국내에서현재소에서많은문제를유발하고있는 브루셀라균종은 Brucella abortus(B. abortus)로서이를
진단하기위하여 B. abortus 1119 strain을이용하여국 가적으로공인하는혈청학적진단법인평판및시험관 응집반응의진단액으로사용하고있다. 이외에도다양
한혈청학적진단법이사용되기는하지만각각의혈청 학적진단기법의민감도와특이도가다양하고또한각 각의시험법들이장, 단점을가지고있기때문에, 하나
의시험법으로정확한브루셀라의진단이매우어려운 상태이다. 또한현재까지의 브루셀라진단법은 LPS, whole cell preparation, cell sonication extracts등을사용
하여왔기때문에혈청학적진단에여러가지문제점을 유발하였다. 특히 smooth B. abortus로부터얻을수있 는 LPS는강한면역반응을유도한다 [14]. 하지만이에
따른많은문제점을가지고있다 [5, 7, 13]. 첫째, B.
abortus의 O-polysaccharide의 immunodominant epitope가 여러종류의세균, Yersinia enterocolitica O:9, Salmonella urbana group, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Escherichia coli O;157 및Stenotrophomonas maltophilia
의 immunodominant epitope과유사하여교차반응(Cross- reaction)을유발할수있다 [21]. 둘째, anti-LPS 에대한 항체가 acute brucellosis 이후에오랫동안존재할수있
어진단의특이도가떨어질수있다 [16, 20]. 셋째로B.
canis, B. ovis와같은 rough strain 에감염의경우진단 을할수가없고, 마지막으로브루셀라 S19 백신균주를
접종하는나라에서는 LPS를이용한진단법으로는감염 개체와백신개체를구별할수없을수있다. 이러한문 제점을극복하고자동물과사람의브루셀라병에서는새 로운혈청학적진단기법의개발이계속적으로요구되어 오고있다. 이러한요구를충족시키기위하여 LPS-free
한단백질을이용한진단기법을개발하고자하는많은 노력들이계속적으로진행되고있다 [11, 12]. 특히이러 한단백항원은지역적또는균의성장환경에따라서발 현양상이다를수있음으로현재이에대한연구가활 발하게진행되고있다 [22-24, 29, 30, 32]. 특히국제적
으로소Brucella의효율적인방역을위하여진단방법
개선을위해진행되는많은연구중, 특히자국에서분
리된야외균주를이용한연구가활발하게진행되고있
어서 [3], 이러한측면에서우리나라에서도현재사용되
고있는국제표준균주와국내분리균주간의균주의일
반적인생화학적특성뿐만아니라 LPS, OMPs 등을비
교분석하였고, 이를이용한 ELISA 기법을 확립한후
기존의진단기법과비교하고자하였다.
재료 및 방법
공시균주 및 가검혈청
본연구에사용한공시균주는국립수의과학검역원에 보관중인B. abortus국내분리주(4주), B. abortus 1119- 3 및B. abortus RB51을사용하였다. 양성가검혈청은 표준시험관응집반응에의해서국내에서브루셀라양 성우로판정된소의혈청으로, 50배, 100배, 200배, 400
배항체가의양성혈청들을실험에사용하였다. 음성가
검혈청은국내에서 2000년도발생후재발생하지않은
제주도의소혈청을사용하였다.
성상조사
생화학적 성상으로 oxidase, catalase, urease, nitrate reduction, citrate, indole, H2S 등의검사를실시한후자 동검사기기인 Vitek II(Biomerieux, USA)를이용해서수
행하였으며, lactose, glucose, sucrose, cellobiose, arabitol, mannitol, dulcitol, sorbitol, inositol, maltose, raffinose의당 분해능은의 EASY 24E plus kit(Hanil Komed, Korea)를
사용하여검사하였다. 또한항생제에대한감수성은
Clinical and Laboratory Standards Institute의지침에 따
라서 penicillin, vancomycin, colistin, streptomycin, tetracyclin, bacitracin, erythromycin, amikacin, ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, sulfamethoxazole trimethoprime, nalidixic acid, oxacillin, cefezolin에대하
여하였다.
유전자 분석
국내분리균주와백신주로의유전적특성을확증하기 위하여, Bricker와 Halling의 PCR 방법을변형하여수행
하였다 [19, 24]. 유전자 분석을위하여브루셀라균을
Brucella agar에서 37oC 48시간배양하고 methanol-saline
을이용하여수집한후부유시켜살균하였다. Methanol
을제거하기위하여증류수로 1회원심세척후균탁도 를 600 nm에서 0.15~0.20으로조절하였다. 여기에 10µl
의 lysis buffer(10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.1% Tween 20)를가하고 100oC, 5 분간 boiling한후에 13,000 rpm,
2분간원심하여상층액을분리한후 template로사용하
였다. 본실험에사용한 oligonucleotide primer의 sequence
는B. abortus specific primer; 5'-GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC-3', RB51/2308 primer; 5'-CCC CGG AAG ATA TGC TTC GAT CC-3', eri-gene primer 1; 5'- GCG CCG CGA AGA ACT TAT CAA-3', eri-gene primer 2; 5'-CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA-3', IS711 specific primer; 5'-TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT-3' 이다. PCR 반응은 60 mM Tris-HCl(pH 9.0), 15 mM(NH4)2SO4, 1.5 mM MgCl2, 250µM 4-deoxynucleo- side triphosphates, 5 primer cocktail(각 0.2µM B. abortus specific, RB51/2308, 2 eri-gene, 1µM IS711-specific primer)로조성하였다. PCR 반응용액 45µl당 1 unit의 Taq polymerase를첨가하고 PCR tube에분주한후 PCR
반응용액 25µl당 2.5µl의 균체추출 DNA를 가하고
Thermocycler(Perkin Elmer, USA)에서 95oC, 5분간반응
시킨후 95oC에서 1분 12초, 55.5oC에서 2분, 72oC에서
2분간 35회반복하여증폭시켰다. 72oC에서 5분간 final extension 후증폭된 DNA 10µl를 2% agarose gel에서
전기영동하고 ethidium bromide로염색한 다음 DNA band를최종 반응후 UV transilluminator에서 확인후 사진촬영하였다.
OMPs 분리
공시균주로부터균외막단백의추출은 Barenkamp 등 [18]의방법에따라실시하였다. 즉, Tryptic soy broth 1 L에배양한균을 4,000 rpm으로 30분간원심분리하여 균을수집하였다. 수집된균을 PBS로 2회원심세척후, 10 mM HEPES buffer 30 ml에부유시켜한 tube에모아 희석시켰다. 이것을 ice bath에서 Sonic Dismembrator (Bandelin Electronic, Germany)로 60% power에서 투명 해질때까지 sonication 시킨후, 이것을 4,000 rpm에서
30분간원심분리하여상층액을회수하였다. 이상층액
을다시 20,000 rpm에서 1시간동안원심분리한후침 전물을회수하였다. 이침전물을 1 ml의 mixing buffer(2%
SDS, 10 mM HEPES)에완전히부유시켜실온에 1시간
방치하였다. 그후, 다시 20,000 rpm에서 1시간동안원
심분리한후침전물을회수하여, 멸균증균수 1 ml에부
유시켰다. 완전히부유시킨후, 13,000 rpm에 3분간원
심분리시켜 soluble한상층액을 OMP 항원으로하였고,
SDS-PAGE 분석에사용하였다.
LPS의 분리
공시균주로부터 LPS의 분리는 LPS extraction kit (Intron, Korea)를이용하여추출하였다. 즉, 균을 tryptic soy agar에서배양한후균을수확하여제공된 lysis buffer
를넣어부유시킨후, chloroform을섞어서실온에 5분
간방치시켰다. 그후 13,000 rpm으로 10분간원심분리
를 하여 상층액을 수집하였다. 이상층액에 제공된
purification buffer로재부유한후, −20oC에서 10분간방
치시켰다. 그리고 13,000 rpm으로 15분간원심분리를한
후 pellet을에탄올로 washing하고 10 mM Tris-HCl buffer
로부유시켜 1분간 boiling하여 LPS 항원으로 하였고,
SDS-PAGE 분석에사용하였다.
SDS-PAGE 및 Western blot 분석
OMP 및 LPS 항원에각각동량의 2×Laemmli sample buffer(50 mM Tris-Cl, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol, 100 mM mercaptoethanol)를넣어혼합하
고 100oC, 10분간처리하였고, 전기영동은 PROTEIN Ⅱ
xi Cell(Bio-rad, USA)을이용하여 15% acrylamide gel에 서실시하였다. 항원전개가끝난후 LPS는하루동안 fixation solution(25% isopropanol, 7% acetic acid)에서
fixation 시킨후, oxidation solution(25% isopropanol, 7%
acetic acid, 1.05 g periodic acid)에 5분간반응시키고, DW
로 30분씩 8번 washing 하였다. 그리고, silver staining solution(0.1 N NaOH, 29.4% ammonium hydroxide, 20%
silver nitrate)으로 10분간 staining을하고, DW로 10분씩 4번 washing하고, developer solution(50 mg citric acid, 37% formaldehyde)에서 10분간 develop 시켜서항원양 상을분석하였다.
그리고 OMP는 0.1% Coomassie brilliant blue R-250
용액을이용하여염색하여비교분석하였다. 또이처럼 전개한 OMP와 LPS는 nitrocellulose membrane에전사
한후국내브루셀라 양성우(SAT 응집가 1 : 400)의혈 청을이용하여 Western blot을실시하였다.
OMP를 항원으로 이용한 ELISA 확립 및 기존의 시험법과 비교 분석
추출한각균주의 OMP 항원을 coating buffer(0.01 M PBS : 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl)에 0.2µg/well로희 석후 4oC에서 overnight하여 ELISA plate에부착시켰다.
항원이부착된 plate를 0.05% PBST로 3회세척한후, 1% skim milk 용액으로 37oC에서 1시간 blocking시켰 다. 가검혈청으로는표준시험관응집반응을통해항체
가를측정한것으로서각각 50배(32개), 100배(60개), 200
배(151개)를 1 : 400으로희석하여사용하였으며, 양성대 조군으로는표준시험관응집반응항체가 400배의혈청
을, 음성대조군으로는 지난 7년간브루셀라발생이없 던제주도혈청을같은비율로희석하여 37oC에서 1시 간동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후, HRP- conjugated bovine IgG(Bethyl Laboratories, USA)를 1 :
10,000으로희석하여 37oC에서 1시간동안반응시켰다.
다시 PBST로 3회 washing 후 ABTS를이용하여 30분
간발색반응시킨후, 405 nm에서흡광도를측정하였다.
ELISA와 표준 시험관 응집반응의 상관관계 분석 표준시험관응집반응과확립된 ELISA의상관관계는
Microsoft사의 Excel 2003(version 11.8211.8202; Microsoft, USA)을이용하여상관계수를측정하여분석하였다. 표 준시험관응집반응각역가의흡광도의평균값을이용 하여선형회귀방정식을구하여관계를분석하였다.
결 과
생화학적 성상 및 당 분해능
B. abortus의표준주, 백신주및국내분리주간에생 화학적특성을비교한결과, 대부분의생화학적성상은
모든균주에서유사하게나타났으나, NO2생성능에있 어서 RB51은표준주(B. abortus 1119-3) 및기타분리주 와달리 NO2를생성하지못하였다. 한편, 당분해능에
대하여조사한 결과 RB51, 표준주(B. abortus 1119-3),
국내분리주모두에서실험에사용된당들을분해하지 못하였다(Table 1).
항생제 감수성
Brucella abortus의 RB51, 표준주(B. abortus 1119-3) 및
국내분리주간에대하여 penicillin등 16 종의항생제에
대한감수성을시험한결과는다음과같다(Table 2). 공
시한대부분의균주가 AP, VA, B, E, SXT, OX, CF에서 는내성을나타내었으며, S, Te, AN, N, K, C에서는감
수성을나타내었으며, 나머지항생제에대해서는중등
도의감수성을나타내었으며, 균주들간에주목할만한 차이는보이지않았다.
유전자 분석
백신주, 표준주, 균체외막및지당체추출실험을위해
선발한 4개의야외분리주의유전자분석결과, 백신주 에서는 364 bp의 RB51 특이유전자가검출되었으며, 표 준주와다른균주에서는 RB51 특이유전자는검출되지
않았으며, 498 bp의B. abortus특이유전자와, 178 bp의
eri특이유전자만이검출되었다(Fig. 1). 이를통하여야 외분리주가백신주로부터유래되지않은것임을확인하 였다.
OMP 및 LPS의 분석
B. abortus 1119-3, RB51 및국내분리주(1-7, 1-81, 2- 55, 3-60) 에대한 OMP의양상을분석한 결과 36~38 kDa 크기의단백질에 1-81, 2-55 및 3-60에서발현량의
차이를나타내었고, 각균주들간에약 10 kDa band의 발현량의 차이, 또한 1-81, 2-55 균주에서, 약 20 kDa
band, 55 kDa band의발현량의차이등을볼수있었다
Table 1. Biochemical characteristics of Brucella (B.) abortus strains
Strains Oxidase Catalase NOproduce H2 2S Urease Phenylalaninedeaminase Citrate Phosphatase Coumarate Lipase
RB51 + + − − + + − − − −
1119-3 + + + − + + − − − −
1-7 + + + − + + − − − −
1-81 + + + − + + − − − −
2-55 + + + − + + − − − −
3-60 + + + − + + − − − −
Strains Arabitol Lactose Sucrose Mannitol Dulcitol Sorbitol Inositol β-Glucose Glucose Maltose Raffinose
RB51 − − − − − − − − − − −
1119-3 − − − − − − − − − − −
1-7 − − − − − − − − − − −
1-81 − − − − − − − − − − −
2-55 − − − − − − − − − − −
3-60 − − − − − − − − − − −
+: Positive −: Negative, RB51: B. abortus RB51, 1119-3: B. abortus 1119-3, 1-7, 1-81, 2-55, 3-60: B. abortus field isolates in Korea.
(Fig. 2A). 브루셀라표준혈청반응에서양성을(1 : 400) 보 인야외가검혈청을이용하여 Western blot 결과, SDS- PAGE 결과와유사한양상을보였으나, 주로 major band
들(36~38 kDa)이양성혈청과강하게반응하였다. 일반
적으로표준주와백신주및야외분리주간에혈청학적 반응에차이를나타내었다. 1-81 균주와 2-55 균주는매
우유사한패턴을보였으며, 이들균주의 36~38 kDa 부
위에서강한반응을나타내었다. 20 kDa 부위에서표준
주를비롯하여 1-81, 2-55 균주에서만반응을볼수있
었으며, 특이한점은백신주를항원으로한부분에서는
반응이매우약함을확인할수있었다(Fig. 2B).
LPS를 silver staining한결과표준주와국내주간에비 슷한양상을나타내었다. 다만백신주인 RB51 에서는
O-side chain 부분이결손되어있는것을관찰할수있
었으며, LPS의 lipid A 부분은모든균주에서작은 size
부분에서볼수있었다. Silver staining을통한분석으로 Table 2. Antimicrobial susceptibility of Brucella (B.) abortus strains
Strains P VA CL S Te B E AN AM N K C SXT NA OX CF
RB51 R R S S S R R S I S S S R I R R
1119-3 R R I S S R R S S S S S R I R R
1-7 R R S S S R R S S S S S R I R R
1-81 R R I S S R R S S S S S R R R R
2-55 R R I S S R R S S S S S R I R R
3-60 R R I S S R R S S S S S R I R R
R: Resistance I: Intermediate S: Susceptable.
P: Penicillin 10µg, VA: Vancomycin 30µg, CL: Colistin 10µg, S: Streptomycin 10µg, Te: Tetracyclin 30µg, B: Bacitracin 10µg, E: Erythromycin 15µg, AN: Amikacin 30µg, AM: Ampicillin 10µg, N: Neomycin 30µg, K: Kanamycin 30µg, C:
Chloramphenicol 30µg, SXT: Sulfamethoxazole trimethoprime 30µg, NA: Nalidixic acid 30µg, OX: Oxacillin 1µg, CF: Cefa- zolin 30µg.
RB51: B. abortus RB51, 1119-3: B. abortus 1119-3, 1-7, 1-81, 2-55, 3-60: B. abortus field isolates in Korea.
Fig. 1. Detection of Brucella species-specific genes and eri- gene in Brucella (B.) abortus by PCR. Lane 1, 100 bp ladder; lane 2, B. abortus RB51; lane 3, B. abortus 1119; lane 4, B. abortus 1-7; lane 5, B. abortus 1-81; lane 6, B. abortus 2-55; lane 7, B. abortus 3-60.
Fig. 2. Electrophoretic and immunological analysis of outer membrane proteins extracted from Brucella (B.) abortus strains by SDS-PAGE (panel A) and Western blot (panel B). Lane 1, molecular weight marker; lane 2, B. abortus RB51; lane 3, B. abortus 1119-3; lane 4, B. abortus 1-7; lane 5, B. abortus 1-81; lane 6, B. abortus 2-55; lane 7, B. abortus 3-60.
는정확한 O-side chain의배열을파악하기힘들었으며,
이에따른국내분리주간의차이는확인하기어려웠다
(Fig. 3).
각 균주의 OMP항원을 이용한 ELISA와 표준평판 응집반응의 비교
각각의 OMP를항원으로이용하여 ELISA를실시한
결과사용한항원에따라약간씩다른결과를나타내었 다. 같은혈청임에도불구하고백신주의외막단백을항 원으로사용한경우에는대체로낮은흡광도를나타내 었으며, 몇몇혈청에서는사용한 OMP 항원에따라각 기다른값을나타냄을확인할수있었다. 추가로, 확립
된 ELISA 기법이얼마나유효성을가지는지를알아보
기위하여각샘플의흡광도의평균으로선형회귀방정 식을만들어 SAT를통한항체가와의상관관계를분석 하였다. 각각백신주, 표준주, 1-7 및 1-81 항원을사용
했을때의상관계수(R)는 0.98, 0.82, 0.87, 0.87로, 전반적 으로높은상관관계를볼수있었으며, 특히백신주의 OMP 항원을사용한경우에서가장큰상관관계를나타
냈다(Fig. 4). 이를통해전체적으로 SAT와사용항원이
다름에도높은상관관계를나타내고있음을알수있었
고, 분산분석을통하여, 같은 SAT 역가의혈청이라도
각균주의 OMP 항원에따라다양한 O.D. 값을나타냄
을확인할수있었다(Table 3).
고 찰
브루셀라병에대한효율적인국가적인방역대책을수 립하기위해서는감염개체에대한정확한진단이이루 어져야한다. 현재까지개발된소브루셀라의진단법은
다양하나그진단방법의민감도와특이도에서다양한 차이를나타내고있다. 이는소브루셀라의원인체인B.
abortus가세포내기생성을가진세균으로서세포성면
역및체액성면역을유도하고있으나, 현재는주로체 액성면역에근거한혈청학적진단방법이사용되고있 고, 또한다른장내세균들과의교차반응등균자체가
가질수있는여러가지진단의어려움, 상재감염지역 에서의 LPS에대한높은항체가및다른속의Brucella
감염증과구별에어려움, 그리고현재사용중인진단액
제조균과감염지역의균주와성상차이에따른정확한 진단의어려움등으로새로운진단방법의개선이계속 적으로재기되어왔다.
이러한문제점들을해결하기위한기초자료의확보를 위하여본연구에서는B. abortus의국내분리주, 현재
국내브루셀라진단액제조에사용되는균주B. abortus
1119-3와외국에서소브루셀라예방을위하여백신균
주로사용하고있는B. abortus RB51 균주의여러가지
성상을비교분석하였고, 각각이들균주의 OMP 및 LPS
를추출하여그차이를조사하였다. 또한, 이들 OMP 항
원을이용하여 ELISA 기법을정립한후기존의방법과
비교분석하였다.
본연구에사용될공시균주의확인을위하여브루셀 라야외분리균주, B. abortus 1119-3 및B. abortus RB51
의생화학적특성, 당분해능및유전자검색을실시한
결과본실험에공시한모든균주가 B. abortus에대하
여기존에발표된것들과동일하게나타났다. 항생제감
수성검사에서는항생제에대한균주간의커다란차이
Table 3. Optical density of a developed diagnostic method using Brucella (B.) abortus OMPs depending on Standard tube agglutination test titer
Antigen Standard tube agglutination test titer
×50 ×100 ×200
B.abortus RB51 OMP 0.468±0.084* 0.483±0.105 0.625±0.177
B.abortus 1119-3 OMP 0.934±0.260 0.961±0.210 1.072±0.189
B.abortus 1-7 OMP 0.857±0.210 0.915±0.218 1.054±0.140
B.abortus 1-81 OMP 1.009±0.243 1.007±0.232 1.157±0.186
*Mean O.D.±SD, p < 0.05
Fig. 3. Analysis of lipopolysacharides of Brucella (B.) abortus strains by SDS-PAGE and silver stainining. Lane 1, molecular weight marker; lane 2, B. abortus RB51; lane 3, B. abortus 1119-3; lane 4, B. abortus 1-7; lane 5, B. abortus 1-81; lane 6, B. abortus 2-55; lane 7, B. abortus 3-60.
는없었으나, 균주가항생제종류에따라서는감수성및 저항성이다양하게나타났다.
세균벽의구성은다양한물질로이루어져있는데이중
특히세포외막 단백질(OMP)는세포의주요기능뿐만
아니라, 항원으로서도중요한역할을한다. Brucella균
의세포벽을 분석해본결과 75개이상의 protein이존
재함이밝혀졌고, 이들 protein에는다양한 OMPs이존 재하였다 [13]. Brucella균의 OMPs는연구하는사람에
따라 다를 수있으나, 크게 세 group으로 나눠지는데
group 1, 2 그리고 3로분류된다. Group 1은일명 minor
OMPs group으로불리며 이에속하는 OMPs로서는분
자량이 88-99 kDa의단백질과, 분자량 10 kDa의 Omp 10, 16 kDa의 Omp 16, 19 kDa의 Omp 19가포함된다. Group 2는 major OMPs group으로서분자량이 34-40 kDa
사이에존재하며, 일명 porin(transmembrane protein)으로
알려져있고, 여기에속하는 OMPs는분자량이 36-38
kDa의 Omp 2a와 Omp 2b가포함된다. Group 3 또한 major OMPs group으로서분자량이 25-30 kDa 사이에 존재하는 proteins 으로써분자량 25-27 kDa의 Omp 25
와 31-34 kDa의 Omp 31이포함된다 [2]. 현재이들 group
이외의저분자량 OMPs에대한연구가다각도로진행되
어져이들 group은더욱세분화될것으로사료된다. 본
실험에사용한균주들의 OMP 특성을분석한결과국
내분리주와B. abortus 1119-3와B. abortus RB51 간에
는 OMP의 SDS-PAGE를이용하여분석한결과차이를
나타내고있었다. 이러한결과는현재국내에서브루셀
라진단액생산과추후백신의후보로B. abortus 1119- 3와B. abortus RB51이각각사용또는고려되고있다 는점에서볼때에대상균주선발이재고되어야할것 으로생각된다. 그러나, OMPs는현재까지Brucella감 염증에있어서, 항원으로서의작용이미흡한것으로알 려져있고, 또한야생주감염에대해낮거나거의효과
가없는 protective activity를나타내는것으로알려져있 으나, Jimenez de Bagues 등 [28]의결과에의하면 group
3 OMPs가B.ovis접종실험에서우수한방어효과를나
타내는것이알려져병원성및항원성으로서중요한인 자임이밝혀졌다. Brucella감염증에있어서 LPS는높은 면역원성임이밝혀져많은혈청학적진단재료로쓰여 지고있다. 그러나이러한훌륭한면역원성을갖고있음 에도불구하고, 이들 LPS는다른장내세균(Y. enteroco- litica O9, Salmonella spp., E. coli, Francisella spp. 등)과
의교차반응이나타나, Brucella감염증의진단에큰어
Fig. 4. Comparison of a serological method developed in this study with standard tube agglutination test in field bovine sera.
