Anti-Oxidative and Anti-Obesity Activities of Tetrapanax papyriferus and Siegesbeckia pubescens Extracts and their Synergistic Anti-Obesity Effects

통초 · 희렴 추출물의 항산화 · 항비만 활성 및 혼합물의 항비만 시너지 효과

박정애¹, 진경숙¹, 이지영¹, 권현주^1,2, 김병우^1,2*

1동의대학교블루바이오소재개발및실용화지원센터

2동의대학교생명응용학과

Received : June 26, 2013 / Revised : August 8, 2013 / Accepted : August 9, 2013

서 론

비만^(obesity)은체내에지방조직이과다하게축적된상

태를의미하며열량의섭취와소비의불균형으로발생하는

대사성질환이다^[15]. 비만은외형적인콤플렉스에서기인한

육체적·정신적·사회적문제를야기하여개인의삶의질 에심각한영향을미치므로그자체로도큰문제가되나특 히당뇨^, 고혈압^, 고지혈증^, 관절염^, 심장병^, 뇌졸증^, 동맥경 화^, 지방간등각종대사성질환^, 심혈관계질환및암의발 생과직접적인상관관계를보이는것으로밝혀져그심각성

이더욱크다^{[7, 16].} 세계보건기구^(WHO)의보고에따르면

1980년부터전세계적으로 체질량지수(Body Mass Index, BMI)가 ^{25 (kg/m2)} 이상인비만인구가거의 ²배가량증가 하였고^{, 2008}년 ²⁰세이상성인 중 ¹⁴억명이과체중이며^, 이중 ⁵억명이비만으로^, 이는전세계성인인구의 ^35%가 과체중이며 ^11%는비만임을의미한다^[31]. 또한매년 ²⁶⁰만

명이비만으로인해사망하고있으며^{, 2010}년에는전세계

비만인구가 ¹⁰억에달하였고 ²⁰¹⁵년에는 ¹⁵억명으로증

가할것으로예측되고있다^. 특히 ²⁰¹¹년만 ⁵세이하어린 이중약 ⁴천만명이상이과체중으로나타나향후더욱심 각한건강문제를양산할것이라고경고한바있다^[3]. 최근 서구화된식습관의증가로인해국내비만인구도급증하고

있어 ²⁰⁰⁸년에는전체인구중비만인구가 ^30.7%를차지

하여한국인 ³명중 ¹명이비만인시대에도래하였다^. 비만은지방전구세포의분화및지방생성과정에의하여지 방세포의세포내중성지방(triglyceride, TG)의축적으로발 Anti-Oxidative and Anti-Obesity Activities of Tetrapanax papyriferus and Siegesbeckia pubescens Extracts and their Synergistic Anti-Obesity Effects. Park, Jung Ae¹, Kyong-Suk Jin¹, Ji Young Lee¹, Hyun Ju Kwon^1,2, and Byung Woo Kim^1,2*. ¹Blue-Bio Industry Regional Innovation Center, Dong-Eui University, Busan 614-714, Korea, ²Department of Life Sci- ence and Biotechnology, College of Natural Science, Dong-Eui University, Busan 614-714, Korea

In this study, the anti-oxidative and anti-obesity activities of two medicinal herb extracts, Tetrapanax papyriferus (TP) and Siegesbeckia pubescens (SP), were evaluated using DPPH radical scavenging activity assay, lipase enzyme inhibition assay, and the cell culture model system. Both methanol extracts of TP and SP showed DPPH radical scavenging activities dose- dependently, and the IC₅₀ of DPPH radical scavenging activities of the two medicinal herbs were 65.23 and 47.79 μg/ml, respectively. Furthermore, both extracts suppressed effectively lipase enzyme activity dose-dependently. Moreover, TP and SP extracts significantly suppressed adipocyte differentiation, lipid accumulation, triglyceride (TG) contents on 3T3-L1 preadipo- cytes in a dose-dependent manner without cytotoxicity. Their anti-obesity effect was modulated by cytidine-cytidine-adenosine- adenosine-thymidine (CCAAT)/enhancer binding proteins α (C/EBPα), C/EBPβ and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) gene and protein expressions. Furthermore, TP and SP possessed a synergistic effect on anti-obesity activity. The identification of the active compounds that confer the anti-obesity activity of TP and SP might be needed.

Keywords: Tetrapanax papyriferus, Siegesbeckia pubescens, anti-oxidative effect, lipase inhibition activity, anti-obesity activ- ity, synergistic effect

*Corresponding author

Tel: +82-51-890-2900, Fax: +82-51-890-2914 E-mail: [email protected]

© 2013, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology

생하며이러한지방생성기전을조절하는것이비만억제의

효과적인치료방법으로알려져있다^[2]. 잘알려진대표적

인비만치료제인 ^orlistat의경우췌장및위장에서분비되

는지방분해효소인 ^lipase의활성을억제하여섭취한지방

중약 ^30%의흡수를차단함으로서 체중의감소에도움을

주는것으로알려져있다^[8]. 이에최근천연물을이용한유

용비만소재개발의많은연구가천연유래 ^lipase 활성저

해제로서의 작용 가능성 탐색에 초점을 맞추고 있다^.

Adipogenesis, 즉지방세포형성은지방세포가만들어지는분

화과정으로서세포의형태의변화및관련유전자와단백질 의발현변화를동반하는데^{[14, 23],} 이러한 adipogenesis 연 구를 위한 in vitro cell model system으로는 일반적으로

mouse embryo로부터유래된지방전구세포인 ^3T3-L1을주

로 사용하며 지방세포로의 분화를 위해서는 ^insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 등의분화유도인자를필요로한다[5, 11]. Adipogenesis의분 자적인 기전으로는 peroxisome proliferator-activated receptor γ ^(PPARγ⁾ 및 cytidine-cytidine-adenosine-adenosine- thymidine (CCAAT)/enhancer binding proteins (C/EBPα^, C/EBPβ^{, C/EBP}δ⁾ 등과같은 adipogenic transcription factor 등이중요한조절자로서관여하는것으로알려져있다^[18].

분화된지방세포에서는백색지방세포(white adipose tissue) 에서나타나는 ^TG의축적과같은형태적특징과함께지방 세포특이적유전자의발현이나타나며^, 효과적인비만억제 를위해서는지방세포분화과정에관여하는전사인자들의활

성을억제하는것이매우중요한것으로밝혀졌다[4, 24, 30].

한편전세계적으로비만치료제의개발을위한다양한연 구가수행되고있는가운데현재시판되고있는비만치료 제들의부작용들이보고되면서사용기준이강화되는등의 논란이일고있어우수한효능과함께안전성이높은물질 의개발이요구되고있다^. 이에특히천연유래소재로부터 독성및부작용이없는항비만효능보유소재를발굴하기 위한많은노력이집중되고있다[13, 21, 25].

통초(Tetrapanax papyriferus)는두릅나무과상록관목인 통탈목의줄기를말하며한방에서약제로사용된다^. 흔히으 름덩굴^, 통탈목^, 통화^, 총초^, 대목통^, 방통^, 활범^, 이남^, 부지^, 관장^, 구탈^, 의상등으로도불리며^, 타이완및중국남부가 원산지로제주도에서원예용으로수입하여심은귀화식물이 나^, 점차번져서제주에서는해변에소군락을이루며자생하 기도한다^. 통초라하여주로줄기를약으로쓰지만^, 뿌리⁽통 화근⁾도같은효과를가지며^, 꽃봉오리⁽통화화^), 꽃가루⁽통화 목화상분⁾도약으로쓸수있다^. 성분으로는회분^, 지방질^, 단백질^, 섬유질을포함하며맛은싱겁고독이없으며성질은 평하다^. 한방에서는해독^, 해열^, 이뇨작용이강하여몸속의 독을풀고열을내리며소변을잘나오게하여부은것을내

리는효과가있는것으로알려져있으며폐기를내리고대 변과소변^, 젖을잘나오게하며^, 임질^, 요도염^, 방광염^, 부종^, 현기증^, 상기증^, 코막힘등을치료한다^. 또한눈을밝게하고 열을내리며^, 갖은중독을풀어주며^, 황달을낫게하며갖은 염증을삭혀주는등의효능이있다^. 보고된생리활성으로통 초추출물의세포사멸을통한암세포독성유도^[17], 통초추

출물의항산화활성및항노화효과^[22] 등이있으나통초의

항비만활성에대해서는연구된바없다^.

희렴(Siegesbeckia pubescens)은희첨^, 시첨^, 저고또는진 득찰이라고도불리는국화과식물또는이의전초를건조시 킨한약재를지칭한다^. 풀의냄새가돼지와비슷하고맵고 쏘는맛이있다^. 호랑이나개에게물린상처를치료할때사 용된다하여호고또는구고라고불리기도한다^. 전통적으로 풍습을제거해한방에서는관절염^, 사지동통마비^, 하지무력^, 중풍으로인한반신불수^, 종기^, 발진^, 피부가려움증^, 습진등 에쓰인다. 또한고혈압, 두통, 어지럼증, 급성간염등에도사 용되며^, 혈관확장작용이있어혈압강하작용을나타내는것 으로알려져있어고혈압환자는차로복용할수있다^. 희렴 의생리활성에관한연구로는희렴및분리화합물의항염 증활성^{[20, 29],} 관절염치료효과^[9], 상처치료효과^[28], 유

래화합물의항혈전작용^[27], 그리고유아식식중독유발균

의증식억제능^[12] 등이보고되었고항비만활성과관련하

여서는 ^Hwang 등^[10]이 ethanol (EtOH) 추출물의혈관신생

및지방생성억제능을보고한바있으나 methanol (MeOH)

추출물의 pancreatic lipase 활성저해및지방생성억제능 에대해서는보고된바없다^.

이에본연구에서는한방에서약재로사용되고있는통초 및희렴추출물의항비만효과및그기전을알아보고두소 재간의시너지효과를분석함으로써기능성소재로서의활 용가능성을확인해보고자하였다^.

재료 및 방법

통초 및 희렴 추출물의 제조

실험에사용한통초와희렴은부산광역시소재㈜대한생 약제품에서구입하여사용하였다^. 통초와희렴을각각 ^{10 g}

씩측량하여분말로파쇄한후시료부피의 ⁵배의 ^MeOH을

가하여 ^75oC에서 ³회반복추출하였다^. 추출한시료는여과 후감압농축기(N-1000S-W, EYELA, Japan)로농축하고동 결건조(FDU2100, EYELA, Japan)한후중량법으로각각 의수율을계산하였다^.

DPPH radical 소거 활성 측정을 통한 통초 및 희렴 추출 물의 항산화능 분석

전자공여작용은인체내에서생성되는 free radical의전

자를공여하여 free radical에의한노화와질병을억제한다^. 따라서전자공여능은항산화작용의지표로서사용되고있으 며특히식물추출물의항산화능측정에많이사용되고있 다^. 이러한 전자공여능은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거능분석을이용하여측정하였다^{. DPPH} 는비교적안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol,

polyhydroxy 방향족화합물^, 방향족아민류등에의해환원

되어짙은자색이탈색되는원리를이용하여항산화활성을 간단히측정할수있는동시에식물체의항산화활성과도연

관성이매우높기때문에많이이용되고있는방법이다^[13].

통초및희렴추출물을농도별^(1.25-320 μ^g/ml)로 ^MeOH 에녹여준비한후, 96 well plate에 ^MeOH에용해된 ^1.5× 10⁻⁴ M DPPH 40 μ^l와각시료 ¹⁶⁰ μ^l를분주한혼합액을 실온에서 ³⁰분간반응시키고, multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를이용하여 ^{520 nm}에서흡광도를측 정하였다. 시료를첨가하지않은음성대조군과비교하여처 리농도별 free radical 소거정도를백분율로나타내고^{, 50%}

저해 농도(Inhibitory Concentration, IC₅₀)를 계산하였다^. 대표적인항산화제로 DPPH radical 소거활성측정시양 성대조군으로주로사용되는 ascorbic acid를함께비교분석 하였으며측정값은 ³회반복실험의평균값으로나타내었다^.

통초 및 희렴 추출물의 pancreatic lipase 효소 활성 저 해능 분석

Lipase는주로췌장에서분비되어 ^TG를 ^glycerol과 ^fatty acid로가수분해하는효소로서지방소화효소인 pancreatic

lipase의활성저해능은시료가보유한항비만활성을예측

하기에매우유용한시험법이다^[6]. 본연구에서는통초및 희렴의항비만활성을세포실험계에서분석하기에앞서시

료가보유한 ^lipase 효소활성저해능을다음과같이측정하

였다^. 먼저 1.5 ml tube에 0.25 M Tris (pH 7.7), 250 mM CaCl₂, 5 mM 4-nitrophenyl dodecanoate (PNPD)로구성 된효소액과기질을넣고잘섞어준후 ^37oC에서 ⁵분간예 열하고, 0.25 M Tris (pH 7.7)에녹인 ^lipase와시료를넣어 37^oC에서 ¹⁰분간반응시킨후 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)를첨가하여반응을종료하였다^. 반응액을 ^{4oC, 15,000} rpm에서 ²⁰분간 원심분리하여^, 분리한 상층액을 ^96-well tissue culture plate에분주하고 multi-plate reader를이용

하여 ^{412 nm}에서흡광도를측정한후^{, 10}분간반응시킨시

료의흡광도로부터 ⁰분반응시료의흡광도를뺀값을대조 구대비백분율로나타내었다^. 측정값은 ³회반복실험의평 균값으로나타내었다^.

세포 배양 및 시료 처리

항비만활성분석에사용되는대표적인 cell model system

인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터구입하여 10% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin이포함된 ^DMEM 배지에서배양하였다^{. 0.5} μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone (DEX), 10 μ^g/ml의 ^insulin (이하 ^MDI)를처리하여 adipogenesis를유도하고통초및희 렴추출물에의한항비만활성을분석하였다^[28].

세포 독성 유무 분석

항비만활성분석수행전시료가세포생존율에미치는영 향을확인함과동시에세포독성을유발하지않는시료의처 리농도를결정하기위해 water soluble tetrazolium (WST) assay를수행하였다^{. 1}×^{105 cell}을 24-well tissue culture

plate에분주하여 ²⁴시간동안부착시킨후시료를농도별

로처리하여 ⁷²시간동안배양하였다^. 시료처리후 ^WST 시

약이든배지로교체하여한시간동안반응시킨후 ^multi-

plate reader를이용하여 ^{450 nm}에서흡광도를측정하였다^. 측정값은 ³회반복실험의평균값으로나타내었으며독성을 유발하지않는농도범위에서이후실험을수행하였다^.

Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석

3T3-L1 지방전구세포의지방세포로의분화는상기의 ^MDI

를 처리하여 유도하였다. 12-well tissue culture plate에 well 당 ²×¹⁰⁵개의세포를분주하고 ²일후 ^{10% FBS}가든 배지로교체하였다^{. 2}일경과후 ^MDI가든배지로교체하 면서 시료를 농도 별로 처리하고 ²일 간격으로 총 ⁴회

insulin과시료를처리하였다^. 마지막시료를처리하고 ²일

경과후위상차현미경을이용하여지방세포분화정도및 시료에의한분화억제정도를 ²⁰⁰배배율로관찰하여촬영 한후^, 지방세포분화억제능및 ^TG 생성저해능을 ^{Oil Red} O staining을통해분석하였다^[26]. 지방세포분화및시료 처리가완료된세포를 ¹× phosphate buffered saline (PBS) 로 씻어준 다음 10% formalin으로 고정하고 ^{Oil Red O} staining solution을처리한후 ³⁰분간염색하였다^. 염색완

료후 100% isopropanol을사용하여염색된지방을추출하

고 multi-plate reader를이용하여 ^{500 nm}에서흡광도를측 정하였다^.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통한 지방세포 분화 관련 유전자 발현 조절능 분석

통초와희렴이지방세포분화에중요한역할을담당하는

유전자의발현에미치는영향을알아보기위해 6-well tissue

culture plate에 ³×¹⁰⁵개의세포를분주하고지방생성억

제능분석과동일한방법으로시료를처리한후 ^RNA를분리

하여각유전자의발현을 ^RT-PCR로분석하였다^. 먼저시료

처리가완료된배양세포의 ^{total RNA}를 TRIzol (Invitrogen, CA, USA)을사용하여 추출한 후 NanoVue plus spectro- photometer (GE healthcare, WI, USA)를이용하여정량하 고 SuperScript^TM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)

을이용하여 ^cDNA를합성한후 ^PCR을수행하였다^. 유전자

발현 분석의 internal control로는 housekeeping gene인 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였으며실험에사용한대상유전자의염기서열은 ^Table 1에제시한바와같다^.

Western blot hybridization을 통한 지방세포 분화 관련 단백질 발현 조절능 분석

상기의 ^RT-PCR 분석에서와같은방법으로실험을수행

한후시료처리가끝난세포에서단백질을분리하여지방생 성관련단백질의발현변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다^. 먼저시료처리가끝난배양세포에서 cell lysate 를추출하여 Bradford assay로단백질농도를결정한후 ⁵⁰μ^g 의단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 로전기영동하고 nitrocellulose membrane에 ^blotting한후 대상단백질의일차항체와 hybridization하였다^. 실험에사 용한 ^C/EBPα와 ^C/EBPβ의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터구입하였고^{, PPAR}γ 및 ^actin의일차항체와 horse radish peroxidase가부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse 등의이차항체는 ^Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터구 입하여사용하였다. Membrane 수세후이차항체로한시 간동안반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem^® FC2, AlphaInnotech, USA)을이용하여각단 백질의발현을분석하였다^.

통계 분석

실험의결과는평균^(mean)± 표준편차(standard deviation,

SD)로 나타내었고^, 각 데이터의 통계 분석은 ^unpaired Student's t-test를통해 ^p 값이 ^0.05 미만(p < 0.05)인경우 유의성이있는것으로판단하였다^[1].

결과 및 고찰

통초 및 희렴 추출물의 제조 및 항산화능 분석

통초 및 희렴 ^{10 g}으로부터 ^MeOH 추출을 통해 각각

1.42 g 및 ^{1.85 g}의추출물을확보하여그수율은각각 ^14.2%

와 ^18.5%로 나타났다^. 또한 항산화능의 지표인 ^DPPH

radical 소거능분석을통해두추출물의항산능을분석한결

과 ^{Table 2}에제시된바와같이두소재모두농도의존적인

radical 소거능을보였으며 ^radical을 ^50% 억제시키는농도 를의미하는 ^IC50값은 통초와희렴이각각 ^65.23과 ^46.43 μ^g/ml으로나타나양성대조군으로사용한 ascorbic acid에 비해서는활성이낮았으나단일물이아닌추출물상태인점 을감안할때높은항산화능을보유하는것으로판단된다^.

통초 및 희렴 추출물의 pancreatic lipase 활성 억제능 분석 Pancreatic lipase의활성억제는섭취지방의흡수를저 해함으로써체중감소에직접적으로도움을줄수있는가 Table 2. DPPH radical scavenging activity by TP and SP extracts.

Extract Concentration (μ^g/ml)

Inhibition rate (%)

TP 12.8 30.11± 1.02

64 49.99± 0.39

320 97.49± 0.40

SP 12.8 29.88± 0.40

64 59.34± 0.51

320 96.32± 0.08

Ascorbic acid 2.56 21.45± 0.52

(Positive control) 12.8 97.55± 0.06

Table 1. Primer sequences used for RT-PCR.

Gene name Sequence

C/EBPα Sense

Antisense

5'-GTG TGC ACG TCT ATG CTA AAC CA-3' 5'-GCC GTT AGT GAA GAG TCT CAG TTT G-3'

C/EBPβ ^Sense

Antisense

5'-GTT TCG GGA GTT GAT GCA ATC-3' 5'-AAC AAC CCC GCA GGA ACA T-3'

PPARγ Sense

Antisense

5'-CGC TGA TGC ACT GCC TAT GA-3' 5'-TGC GAG TGG TCT TCC ATC AC-3'

GAPDH Sense

Antisense

5'-GGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3' 5'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3'

능성을나타내는중요한지표이다^[8]. 통초와희렴의 ^lipase 활성억제능보유유무를알아보기위해각추출물의농도

별처리에따른 ^lipase의활성변화를분석하였다^. 그결과

Fig. 1의 ^{A, B}에각각제시된바와같이 0.25, 0.5, 1.0, 1.5,

2.0, 2.5 mg/ml의처리에의해시료비처리대조군대비통

초는 84.2, 65.3, 59.0, 53.1, 44.7, 25.5%, 희렴은 ^73.6, 69.3, 58.7, 58.4, 57.8, 8.54%의 ^lipase 활성을나타내어통

초와희렴두추출물모두 ^lipase의활성을농도의존적으로

유의적으로억제시키는것을확인하였다^. 이러한결과는통 초와희렴이 lipase inhibitor로작용하여항비만활성을보 유할가능성을시사하였다^.

통초 및 희렴 추출물이 3T3-L1 preadipocyte의 세포 생 존율에 미치는 영향

시료의지방생성억제능의평가를위해먼저통초및희 렴추출물이 3T3-L1 preadipocyte의세포생존율에미치는 영향을 ^{WST assay}를이용하여분석하였다^. 그결과 ^{Fig. 2A}

및 ^{Fig. 3A}에 제시된 바와 같이 통초^, 희렴 두 시료 모두

50~200 μ^g/ml의시료처리에서세포독성을전혀유발하지않

음을확인하였다^. 이러한결과를통해두시료모두세포독 성을유발하지않는낮은독성의안전성이높은소재임을확 인하였다^. 이에각추출물의지방생성억제능의분석을독

성이없는것으로확인된농도범위에서수행하였다^.

통초 및 희렴 추출물이 MDI로 유도한 3T3-L1 preadipocyte 의 adipogenesis에 미치는 영향

통초및희렴추출물의항비만활성보유유무를알아보 기 위해 ^MDI로 분화를 유도한 3T3-L1 preadipocyte의

adipogenesis에각추출물이미치는영향을살펴보았다^. 먼

Fig. 1. Lipase enzyme inhibition activities of TP (A) and SP (B) extracts.

The effects of TP and SP extracts on pancreatic lipase activity. Val- ues are represented as the mean± SD (n = 3) *p < 0.01 vs control.

Fig. 2. Effect of TP extract on 3T3-L1 cell proliferation (A), morphological change and lipid accumulation (B), and TG contents (C).

(A) Cells were treated with the indicated concentrations of TP extract for 72 hr and viability was determined by WST assay. Data are expressed as the mean± SD of triplicate experiments. (B) Dif- ferentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS in presence and absence of TP extract. After day 8, cells were fixed and stained with Oil red O. The morphological change and lipid droplet accumulation were visualized using by inverted micros- copy (x200). (C) TG contents were determined by Oil red O stain- ing after treatment of TP extract. TG contents were measured at 500 nm by multi-plate reader. Data are expressed as the mean± SD of triplicate experiments. *, **Significantly different from the undifferentiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respectively (p < 0.05).

저통초의경우 ^{Fig. 2}의 ^B와 ^C에제시된바와같이처리한 모든농도범위에서지방세포분화가농도의존적으로강 하게억제되었고 Oil Red O staining 결과염색된지방의수 가급격히감소됨을확인할수있었다^. 지방생성의억제정 도를정량적으로평가하기위해염색된지방을추출하여 ^TG 생성량의정도를측정한결과 ⁵⁰에서 ²⁰⁰ μ^g/ml의시료처 리범위에서농도의존적으로유의적인감소를나타내어억

제능의정도는 50, 100, 150, 200 μ^g/ml의처리에의해 ^28,

49, 75, 79%로나타나 지방생성 저해능의 ^50% 억제농도

(Inhibitory concentration), 즉 ^IC50값이 ^99.60 μ^g/ml로산 출되었다^. 희렴의경우에도 ^{Fig. 3}의 ^B와 ^C에제시된바와 같이농도의존적인지방세포분화억제가관찰되었고 ^Oil

Red O staining 결과염색된지방의수가감소됨을확인할

수있었으나그정도는통초에비해다소낮게나타났다^{. TG} 생성량의정도를측정한결과 ⁵⁰에서 ²⁰⁰ μ^g/ml의시료처 리범위에서농도의존적으로감소됨을보여억제능의정도 는 50, 100, 150, 200 μ^g/ml의처리에 의해 5, 12, 17, 27%

로나타났다^. 즉통초및희렴두추출물이농도의존적인지 방생성억제능을보유함을확인하였으며그억제능의정도 는통초가희렴보다높게나타났다^. 이러한결과를통해통 초와희렴이낮은독성과높은지방생성억제능을보유함 을확인하였으며그작용기전을확인할필요성이제기되었다^.

통초 및 희렴 추출물이 adipogenesis 관련 유전자 및 단 백질 발현에 미치는 영향

지방전구세포가지방세포로분화되는 adipogenesis의과 정에는초기^, 중기^, 후기의각단계별로중요한분화조절자 들이관여한다^{. MDI} 처리초기에는가장먼저 c-fos, c-jun,

c-myc 등의유전자발현이증가하며이와함께 ^C/EBPβ와 δ

의발현또한유도된다^{. C/EBP}β와δ는 preadipocyte가 ^MDI 등의분화인자에노출되었을때분화초기에가장먼저작 용하는 전사 인자(transcription factor)로 ^MDI의경우 ^C/

EBPβ는 ^DEX에^{, C/EBP}δ는 ^IBMX에의해활성이유도되는

것으로알려져있다^. 이러한 ^C/EBPβ와δ의활성은분화중

기및후기에서작용하는 ^PPARγ와 ^C/EBPα의발현매개인

자로서^, 활성화된 ^PPARγ와 ^C/EBPα는단독혹은상호작용 을통해지방세포특이적유전자의발현(adipocyte specific

gene expression)을유도하여지방세포분화및지방형성

을완성한다^[19]. 따라서이와같은지방세포분화에관여

하는주요인자들의발현조절유무는소재가보유한지방 생성억제능및그작용기전을판단하는주요지표중하나 이다^.

본연구에서는통초및희렴이보유한지방생성억제능

의작용기전을알아보기위해각추출물이 adipogenesis에

관여하는 주요 핵심 조절자인 ^C/EBPα^{, C/EBP}β^, 그리고

PPARγ의유전자및단백질발현에미치는영향을분석하였

다^. 그결과 ^{Fig. 4}에제시된바와같이 ^MDI 처리에의해지 방세포분화가일어난대조군에서는세인자의유전자및단 백질발현이유의적으로증가되었으며각추출물의처리에 의해농도의존적으로감소함을보였다^. 먼저통초의경우 ^C/

EBPα의유전자발현은다소약하게억제되었으나 ^C/EBPβ 와 ^PPARγ의경우는 ¹⁰⁰ μ^g/ml의처리에서부터감소되었으 Fig. 3. Effect of SP extract on 3T3-L1 cell proliferation (A),

morphological change and lipid accumulation (B), and trig- lyceride (TG) contents (C).

(A) Cells were treated with the indicated concentrations of SP for 72 hr and viability was determined by WST assay. Data are expressed as the mean± SD of triplicate experiments. (B) Differ- entiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS in pres- ence and absence of SP extract. After day 8, cells were fixed and stained with Oil red O. The morphological change and lipid droplet accumulation were visualized using by inverted microscopy (x200). (C) TG contents were determined by Oil red O staining after treatment of SP extract. TG contents were measured at 500 nm by multi-plate reader. Data are expressed as the mean± SD of triplicate experiments. *, **Significantly different from the undif- ferentiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respec- tively (p < 0.05).

며^, 특히 ^C/EBPβ의경우 ²⁰⁰ μ^g/ml에서는발현이미분화세

포수준으로완전히억제됨을보였다(Fig. 4A). 통초추출물

처리에의한단백질발현또한유의적으로억제되는것으로 나타나 ^C/EBPα^, β의경우 ¹⁰⁰ μ^g/ml의처리에서부터발현

이현저히억제됨을보였으며 ^PPARγ의경우는발현억제가

다소낮게나타나 ²⁰⁰ μ^g/ml의처리에서비교적뚜렷한발

현저해를보였다(Fig. 4B). 희렴의경우에도세인자의유

전자및단백질발현이모두농도의존적으로억제되었으며 특히단백질의발현저해가 ^C/EBPα^, β의경우 ⁵⁰ μ^g/ml에서 부터^{, PPAR}γ의경우 ¹⁰⁰ μ^g/ml에서부터매우강하게억제

되었다(Fig. 4C, D). 이러한결과는통초와희렴이보유한항

비만활성이 adipogenesis에관여하는핵심인자의유전자

및단백질발현저해를통해나타남을시사한다. 한편 Hwang

등^[10]이보고한희렴 ^EtOH 추출물의지방세포분화억제

능의결과와비교해보면추출용매및지방세포분화방법 Fig. 4. Effect of TP and SP extracts on adipogenesis related

gene (A, C) and protein (B, D) expressions.

(A, C) Modulation of adipogenic transcription factors by TP and SP extracts was evaluated by RT-PCR. GAPDH was used as an inter- nal control. (B, D) Modulation of adipogenesis related protein expressions by TP and SP extracts was evaluated by Western blot analysis. Actin was used as an internal control.

Fig. 5. Synergistic effect of TP and SP extracts on morpho- logical change and lipid accumulation (A), and TG contents (B).

Differentiation of confluent 3T3-L1 preadipocytes was initiated with MDI treatment and maintained in DMEM containing 5% FBS in presence and absence of each chemical. After day 8, cells were fixed and stained with Oil Red O. The morphological change and lipid droplet accumulation were visualized using by inverted microscopy (x200). TG contents were determined by Oil red O staining after treatment of each chemical and measured at 500 nm by multi-plate reader. Data are expressed as the mean± SD of triplicate experiments. *, **Significantly different from the undiffer- entiated cell control (Con) and untreated cell control (0), respec- tively (p < 0.05).