랫드의 혈액응고 및 혈소판 응집에 미치는 은나노 입자의 영향
이연진·박광식# 동덕여자대학교 약학대학
(Received November 12, 2012; Revised December 24, 2012; Accepted December 27, 2012)
Effects of Citrate-capped Silver Nanoparticles on the Blood Coagulation and Platelet Aggregation in Rats
Yeonjin Lee and Kwangsik Park#
College of Pharmacy, Dongduk Women’s University, Seoul 136-714, Korea
Abstract — Effects of citrate-capped silver nanoparticles (AgNPs) on the blood coagulation and platelet aggregation were investigated using whole blood, platelet rich plasma (PRP) and washed platelet obtained from SD male rats. To confirm the stability of AgNPs in the test, size distribution of the nanoparticles was measured in the vehicles including distilled water, serum, and platelet buffers. The average size of AgNPs was 20 nm in the vehicles, which means that the stability was main- tained during the whole experimental period. When blood coagulation was monitored by using whole blood impedance aggregometer, coagulation was not observed at the concentration of 1, 10 and 50 ppm. Platelets in plasma or in buffer were not aggregated by AgNPs at the concentration of 1, 2 and 4 ppm, respectively. The test concentration of AgNPs could not be increased because the dark color of the nanoparticles impeded the transmission of light, which is an indicator of aggre- gation. Although the blood or platelets were pre-activated by collagen, thrombin, or ADP with sub-threshold level, aggre- gation was not observed at the test concentration. Microscopic observation also supported the result obtained by the aggregometer.
Keywords □ silver nanoparticles, blood coagulation, platelet aggregation, rat
은나노를 활용한 제품의 개발이 증가함에 따라 환경 및 인체 에 미치는 은나노 입자의 위해성이 우려되고 있으며 최근 들어 은나노 입자의 유해성에 대한 연구결과 보고는 급격히 증가하고 있다.1,2) Mukherjee 등은 은나노를 HeLa 또는 HaCaT 세포에 노출시켰을 때 산화적 스트레스를 유발함으로써 세포사멸을 유 도한다는 사실을 보고 한 바 있으며 Li 등은 TK6 세포에 은나 노를 처리하였을 때 농도 의존적으로 유전독성이 증가한다는 사 실을 보고한 바 있다.3,4)이외에도 표면전하, 크기, 모양 등 물리 적 특성이 다른 은나노에 대한 세포독성을 비교하는 등 다양한 연구결과가 보고된 바 있다.5-7) In vitro 독성시험에서 은나노 독 성에 관한 연구결과가 다양하게 보고되는 것과 동시에, 최근 들 어 동물을 이용한 in vivo 독성시험의 연구결과도 증가하고 있다.
은나노의 체내 축적에 관한 연구로서 은나노를 시험동물에 투여
하였을 때 간, 신장, 폐, 비장 등에 은나노가 축적되는 것이 확인 되었다.8,9) Kim 등은 은나노를 랫드에 30, 300, 1,000 mg/kg 용 량으로 28일간 경구투여 한 결과, 사망개체나 체중변화 등을 확 인할 수 없다고 하였으며 Sung 등은 은나노의 흡입독성시험을 수행한 결과 최대무영향농도값(NOAEL)을 100 µg/m3으로 보고 한 바 있다.10,11)또한, Kim 등은 랫드에 은나노를 급성경구투여 한 결과 2,000 mg/kg 용량에서도 사망개체나 특이적인 독성증상 이 나타나지 않은 것으로 보고하였다.12)경구투여 은나노의 경 우 흡입경로 등에 비해 비교적 독성이 낮은 것으로 나타났는데 이는 은나노의 체내이용율과 관련된 것으로 판단된다. Park 등 은 은나노를 경구투여 하였을 경우 생체이용율은 10 mg/kg 투여 시 4.2%라고 제시한 바 있다.13)
한편, 은나노는 현재 상처치료, 피임기구, 수술기구, 인공보철, 혈관카테터 등의 코팅제로 사용되고 있으나 인체에 미치는 독성, 특히 혈액응고작용 등에 대한 연구는 미흡한 실정이다. Stevens 등은 실제 은나노가 코팅된 카테터에 대해 혈소판 활성을 연구한 결과 강력한 항미생물작용과 함께 혈액과의 상호작용으로 트롬
#본 논문에 관한 문의는 저자에게로
(전화) 02-940-4522 (팩스) 02-940-4195 (E-mail) [email protected]
종설
빈 활성이 일어나 혈소판이 활성화 되어 부착됨을 확인하였다.14) Choi 등은 220 µg/ml 이상의 은나노 농도에서 은이온의 증가로 적혈구 용혈이 일어남을 확인하였으며 Zook 등 역시 은나노가 용혈작용을 일으킬 수 있음을 보고하였다.15,16) Tang 등은 은나 노에서 발생하는 은이온으로 인해 혈액 순환에 영향이 올 수 있 음을 제시하였으며 Asharani 등은 은나노에 노출된 제브라피쉬 의 혈행이 저하되었으며 말초 부종, 부정맥등 심질환이 일어남 을 확인하였다.17,18)
은나노의 혈소판 응집에 관련된 연구로 Jun 등은 혈액에 역치 이하반응농도의 트롬빈을 처리하여 활성화 시킨 상태에서 은나 노를 노출시킬 경우 혈소판 활성이 증가한다고 보고하였다.19)반 면, Ragaseema, Shrivastava 등은 은나노가 항 혈소판응집활성 이 있음을 보였다.20,21)은나노의 혈액응고작용 또는 혈소판 응집 작용이 서로 다르게 나타나는 근본적인 이유는 아직 명확하지 않 으며 시험에 사용된 은나노의 물리화학적 특성 또는 시험에 사 용된 은나노의 농도, 이온생성여부 등이 주요한 원인일 수 도 있다.
본 연구에서는 은나노 물질의 심혈관계 질환과 관련된 영향을 알아보고자 구연산으로 캡핑된 은나노에 대해 랫드의 혈소판 응 집 및 혈액응고에 미치는 영향을 평가하였다.
실험방법
은나노
시험에 사용한 은나노는 구연산(citrate)으로 캡핑되어 있는 은 나노(ABC Nanotech, Korea)를 사용하였다. 제공된 은나노의 농 도는 20%(w/v)로 현탁되어 있었으며 제조사가 제공한 정보에 의 하면 구연산의 농도는 1%(w/v)이다. 은나노의 입도는 전자현미 경으로 측정한 결과 7.9±1.0 nm였으며, 표면적은 입자 당 7.5×
102nm2, 입자의 평균무게는 2.0×10-17g, 평균 체적은 1.9×103 nm3, 탈이온 증류수로 10 ppm 농도로 희석된 은나노의 표면전 하(Zeta Potential)는 -17.6±4.2 mV이었다. 은나노 원액은 4oC 냉장보관 하였으며 실험에 사용하기 전 부드럽게 흔들어 균질화 시킨 후 필요량만 희석하여 사용하였다.
은나노 입도 측정
시험용매에서의 은나노 입도 분포를 측정하기 위해 Submicron Particle Sizer (NICOMP TM CA, USA)의 Number-wt Gaussian 법으로 3분마다 3번 측정하고 평균 및 표준편차를 기록하였다.
실험환경에서의 입도 분포를 알아보기 위하여 1, 10, 50, 100 ppm의 농도의 은나노 입자를 증류수, Platelet Poor Plasma (PRP)를 대신하여 혈청(Fetal Bovine Serum) 및 혈소판응집 측 정용 완충액(Washed Platelet Buffer, WPB)에서의 입도를 시간 대별로 측정하였다. 위 용매에서의 시간경과에 따른 은나노 입 자 안정성을 평가하기 위해 동일 농도의 은나노를 각각의 용매
에 현탁시킨 후 1, 3, 6, 12, 24시간마다 입도분포를 측정하였다.31)
전혈, PRP, PPP 및 혈소판
은나노의 혈액응고능에 대한 영향평가를 위해서는 SD랫드의 전혈을 사용하였다. 랫드를 에테르로 마취시킨 후 개복하여 복 대동맥으로부터 혈액을 채취하였으며, 이때 항응고제로서 3.2%
sodium citrate 1 ml을 채혈주사기에 미리 채워둔 후 9 ml의 혈 액을 얻었다. 혈액응고시험에서는 이렇게 얻은 랫드 혈액을 다 시 0.9% NaCl과 1 : 1로 희석하여 사용하였다. 랫드의 복대동맥 에서 위와 같은 방법으로 혈액을 취한 후 원심분리하여(150 ×g, 15분) 혈소판이 풍부한 상징액 PRP를 얻었다. 이때 원심분리하 고 남은 침전분획에 대해 1,500 ×g의 크기로 20분간 원심분리 하여 혈소판이 거의 존재하지 않는 상징액(Platelet Poor Plasma, PPP)를 얻었다. PRP의 혈소판은 세포계수기(Coulter counter, Beckman, CA, USA)를 이용하여 측정하였으며 혈소판의 수가 2×108cells/ml가 되도록 PRP를 PPP로 희석하여 사용하였다. 혈 소판(washed platelet, WP)은 위와 같은 방법으로 PRP를 얻은 후 PRP를 다시 1,500 ×g로 10분 원심분리 하여 가라앉은 혈소 판 침전물을 1차 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 3.8 mM HEPES, 0.35% BSA, 0.4 mM EGTA를 함유하며 pH는 6.5)으로 현탁시켰다. 다시 1,500 ×g 로 10분간 원심분리하여 잔사를 얻은 후 2차 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 3.8 mM HEPES, 0.35% BSA를 함유하며 pH는 6.5)으로 재현탁 한 후 다시 1,500 ×g로 10분간 원심분리하여 잔사를 얻은 후 마지막 3차 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 3.8 mM HEPES, 0.35% BSA를 함유하며 pH는 7.5)으 로 재현탁 하였다. 이렇게 얻은 현탁액에 대해 세포계수기로 혈 소판 수를 측정하여 2×108cells/ml로 혈소판 농도를 조정하여 사용하였다. WPB는 3차 완충액에 해당한다.
혈액응고 및 혈소판 응집 측정
은나노의 혈액응고에 미치는 영향을 평가하기 위해 혈액응고 측정기(Aggrolink, Chrono-log, PA, USA)를 사용하여 혈액의 응 고에 따른 전기전도도의 변화(Impedance법)로써 혈액응고능을 측정하였다. 혈액응고 촉진제로서 콜라겐, 트롬빈 및 ADP를 사 용하여 혈액의 응집능을 확인한 후 은나노의 혈액응집능을 평가 하였다. 즉, 생리식염수로 희석한(1 : 1) 전혈 1 ml를 미리 큐벳에 넣어 37oC에서 1,200 rpm으로 교반하면서 은나노 첨가에 따른 전기전도도의 변화를 측정하였다. 이때 은나노의 최종농도는 1, 10, 50 ppm이었다. 먼저 혈액응고 촉진제를 처리하지 않은 상태 에서 은나노의 혈액응집능을 평가하였으며 이후 콜라겐, 트롬빈, ADP를 sub-threshold 농도로 소량 첨가하여 pre-activation시킨 후 은나노의 혈액응고능을 평가하였다. 혈액응고 촉진제로서 콜
라겐의 농도는 10 µg/ml, 트롬빈의 농도는 2 unit/ml, ADP 의 농 도는 10 µM 였으며 sub-threshold 농도로는 촉진제로 사용하였 던 농도에 비해 낮은 농도를 사용하였는데 즉, 콜라겐 1 µg/ml, 트롬빈 0.02 unit/ml, ADP 1 µM 농도로 사용하였으며 기존연구 를 참고하였다.19,30,24)
은나노가 혈소판응집능에 미치는 영향을 평가하기 위해 혈소 판응집측정기(Aggrolink, Chrono-log, PA, USA)를 사용하여 혈 소판의 응집에 따른 광투과성 변화(Optical 법)로 혈소판 응집능 을 측정하였다. PRP 및 WPB에 현탁시킨 혈소판 0.5 ml를 37oC 에서 1,200 rpm으로 교반하면서 은나노 첨가에 따른 광 투과성 변화를 평가하였다. 이때 은나노의 최종 농도는 1, 2, 4 ppm이었 으며 은나노 농도를 상승시킬 경우 은나노의 고유발색 (검은색) 에 의해 광투과성이 방해되어 더 이상의 고농도에서 은나노의 영 향을 평가하기는 어려웠다. WP에 대한 응집능 평가 시에는 은 나노 투여 5분 전에 CaCl2을 1 mM가 되도록 미리 첨가하였다.
혈액응집 현상 또는 혈소판 응집에 대한 결과를 시각적으로 표 현하기 위해 혈액, PRP에 은나노를 10, 100 ppm되도록 처리한 후 현미경관찰을 실시하였다.23,24)
실험결과 및 고찰
나노입자의 안정성
본 시험에 사용된 은나노입자는 나노입자의 표면이 구연산으 로 코팅되어 있다. 따라서 구연산의 카르복실기로 인해 강한 음 전하를 띄고 있으며 이때 나노입자는 각각의 표면 음전하의 반 발력으로 인해 분산성이 높아 원래 제조된 나노입자의 크기를 유 지하게 된다. 그러나 독성시험의 목적에 따라 은나노는 다양한 종류의 시험용매에 적용되며 이때 시험용매의 특성에 따라 은나 노의 표면전하는 영향을 받게 된다. 음이온에 의한 표면전하가 크면 입자간의 반발력으로 인해 응집이 일어나지 않으나 표면전 하가 양이온과의 결합 등으로 인해 약화될 경우 입자간의 반발 력의 감소로 나노입자는 서로 쉽게 응집하게 된다. 만약 나노입
자의 반발력이 감소하여 서로 응집될 경우 입자의 크기는 증가 하게 되며 심할 경우 나노사이즈의 크기가 아닌 마이크로 사이 즈의 입자로 성장하게 된다. 이와 같은 이유로 나노물질의 독성 시험 등에서는 시험용매로 인해 나노물질 원래의 물리화학적 성 질에 어떠한 변화가 초래되는지를 판단하는 것이 중요하다. 나 노독성연구의 초기에는 이러한 점을 간과하여 실제 제조당시의 나노입자크기가 제대로 유지되지 않은 상태에서 시험을 수행함 으로써 나노입자의 독성영향을 제대로 평가하지 못한 경우가 많 았다.
본 시험에서는 혈액 및 WPB에서의 은나노의 안정성에 관한 특성을 살펴보았다. 제조사로부터 공급받은 은나노는 20%(w/v) 농도로 탈이온 정제수에 현탁되어 공급되며 외관상 회색계열의 어두운 색조를 띠고 있다. 시험에 사용하기 위해서는 공급받은 은나노 현탁액을 탈이온수, FBS 및 WPB에 1~100 ppm 농도로 적절히 희석한 후 24시간 동안 정치하면서 은나노 입도를 측정 하였다. 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같은 은나노는 탈이온수, FBS 및 WPB에서 나노크기로 유지되는 것이 확인되었다. 은나 노를 탈이온수로 희석한 경우 농도의 변화 또는 시간의 경과에 관계없이 제조사로부터 공급받은 원래 은나노 입자의 크기를 거 의 벗어나지 않음을 알 수 있었다(Fig. 1A). 한편, 혈액응고시험 및 PRP에서의 혈소판응집시험은 은나노를 랫드의 혈장에 분산 시키게 되는 것과 유사한 상황이다. 따라서 본 시험에서는 혈청 에서의 은나노입자의 안정성을 평가하였으며 시험에 필요한 혈 청의 양을 고려하여 랫드의 혈청대신 FBS를 사용하였다. 혈청 중에 분산시킨 경우 은나노 입자의 크기는 1, 10 ppm 농도에서 는 탈이온수에 분산시킨 경우와 유사한 정도의 입도분포를 보였 으나 은나노의 농도를 50, 100 ppm으로 증가시킨 경우에는 입도 의 크기가 20~40 nm로 상승하였음을 알 수 있었다(Fig. 1B). 이 는 혈청 중에 존재하는 단백질 및 저분자 물질의 이온성 때문에 은나노 입자의 표면전하가 영향을 받았기 때문으로 판단된다. 그 러나 24시간 동안 평균입자는 40 nm 이하에서 유지됨으로써 나 노입자의 정의에 해당하는 100 nm 이하의 수준이 유지되는 것
Fig. 1− Size monitoring of citrate-capped silver nanoparticles (AgNPs) in different vehicles for 24 hours. Stock AgNPs were suspended in the respective vehicles with the final concentration ranged from 1 ppm to 100 ppm. Size was monitored at 0 (right after suspending), 3, 6, 12, and 24 hours. A: in deionized water, B: in FBS, C: in platelet washing buffer.
을 확인할 수 있었다. WPB는 다양한 이온성분이 함유되어 있으 며 이러한 이온성분들이 은나노의 표면전하를 변화시킬 가능성 은 매우 높아보였다. 그러나 Fig. 1C에서 보는바와 같이 WPB에 현탁된 은나노의 입도는 40 nm 이하의 분포를 보였다. 1, 10 ppm 의 저농도에서 보다는 50, 100 ppm의 고농도에서 입도의 크기가 증가한 것을 볼 수 있으며 저농도에서도 시간경과에 따라 입도 의 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 시험기간 내 에서 은나노 입자의 평균입도는 혈청에서와 마찬가지로 40 nm 이하로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
Fig. 2는 은나노를 탈이온수, FBS, WPB 등 각각의 용매에 100 ppm 농도로 현탁시킨 후 24시간 후에 평균입도 분포를 측정한
결과를 보여주고 있다. 평균입도는 탈이온수에서는 5.9±3.9 nm, FBS에서는 36.0±20.2 nm, WPB에서는 21.2±14.3 nm로 나타났 다. Fig. 3은 탈이온수, FBS, WPB 및 phosphate buffered saline(PBS)에 은나노를 1~100 ppm으로 분산시킨 후 24시간 경과된 후의 모습이다. 탈이온수에서와 마찬가지로 시험에 사용 한 용매(FBS 및 WPB)에서는 침전이 생성되지 않았으나 PBS에 서는 은나노 입자의 침전물질 생성된 모습을 확인할 수 있다.
PBS에서는 완충액을 구성하는 이온과 구연산 의 결합으로 은나 노 표면전하가 감소하여 입자 간 반발력이 감소함으로써 나노입 자가 응집되고 크기가 증가하여 침전이 발생한 것으로 판단되 었다.29)
Fig. 2− Size distribution of citrate-capped silver nanoparticles (AgNPs) in different vehicles at 24 hours after suspending. Stock AgNPs were suspended in the respective vehicles with the final concentration of 100 ppm. Size distribution was monitored at 24 hours after the preparation of suspension on the basis of number-weighted distribution. A: in deionized water, B: in FBS, C: in washed platelet buffer.
Fig. 3− Aggregation of citrate-capped silver nanoparticles (AgNPs) in different vehicles. AgNPs (1~100 ppm) were suspended in deionized water (A), in FBS (B), in washed platelet buffer (C), and in phosphate buffered saline (D). As shown in the photos, AgNPs were aggregated and precipitated only in phosphate buffered saline. The sizes of the precipitates were increased by concentration- dependent manner. However, the aggregation or precipitation was not shown in deionized pure water, in FBS or in washed platelet buffer, respectively.
혈액응고 및 혈소판응집에 미치는 영향
동맥경화, 뇌졸중 등의 혈행 장애로 발생하게 되는 심혈관계 질환의 원인으로는 과도한 지혈작용으로 인한 혈괴의 생성이 주 원인이다. 혈괴의 생성은 혈액의 흐름을 방해하여 혈행 이상을 초래하며 혈전과 같은 병변을 유발하게 된다. 혈전이 생성되면 정맥에서는 혈액순환장애로 부종이나 염증 등이 발생하고 동맥 에서는 허혈이나 경색을 유발하여 심근경색증, 뇌졸중, 폐동맥 경색증 등의 질환을 초래하게 된다. 이와 더불어 혈소판 활성 시 나타나는 여러 인자들이 혈관을 수축시켜 혈류의 흐름을 막아 동 맥경화, 심근경색, 심허혈질환, 뇌혈관질환 등 혈관계 질환이 생 길 수 도 있다. 혈소판은 agonist(트롬빈, ADP, 콜라겐, PAF, serotonin 등)에 의해 자극되면 응집이 일어나는데 지나친 응집 은 혈행장애를 일으키게 된다.22)나노물질이 혈액응고 또는 혈 소판응집에 미치는 영향에 대한 연구는 최근 몇몇 연구자에 의 해 수행되기 시작하였다. Deb 등25)은 철나노의 기능기에 따라 혈소판 응집활성작용이 다르게 나타나는 지를 알아보았으며 그 결과 구연산 코팅된 철나노가 농도의존적으로 항혈소판활성 효 과를 나타냄을 확인하였다. Corbalan 등26)은 실리카나노는 혈소 판을 응집시키며 이때 입도가 작을수록 혈소판응집이 잘 일어남 을 확인하였다. 그리고 Radomski 등27)과 Deb 등28)은 각각 탄소 나노와 금나노에서 혈소판응집작용이 활성화됨을 보였다. 한편, 은나노의 혈액 응고에 관련된 연구들을 살펴보면 논문별로 상반 된 결과가 도출되는 것을 확인할 수 있다. Jun 등19)은 은나노를 인간 혈소판에 대해 노출 시켰을 때 phosphatidyleserine 노출과 트롬빈 생성을 촉진시킴으로써 혈소판 응집을 촉진키는 것을 확 인하였다. 특히 sub-threshold 농도의 트롬빈을 전처리 시 세포 내 칼슘과 P-selectin 노출, serotonin 발생이 은나노에 의해 활 성화되어 혈소판을 더욱 강하게 활성화시키며 in vivo에서도 은 나노를 0.05~0.1 mg/kg 정맥주사 또는 5~10 mg/kg 기관지 내 점적 하였을 때 정맥 혈전생성, 혈소판응집, phosphatidyleserine 노출이 증가함을 확인하였다. 반면, Ragaseema,20) Shrivastava 등21)은 은나노가 항 혈소판응집활성이 있음을 보였다. Shrivastava 등은 in vivo와 in vitro 시험을 통하여 은나노가 농도 의존적으 로 integrin이 매개한 혈소판 응집 반응을 억제시키며 현미경관
찰 결과 혈소판 granule에 쌓이며 혈소판 간 접근을 차단하는 것 을 확인하였다. Ragaseema 등은 PEG 코팅된 은나노가 혈소판 현탁액에 넣었을 때 혈소판 부착을 억제하여 응집을 억제시키며 세포독성이 없음을 보였다.
따라서 본 연구에서 은나노 물질의 혈액응고와 혈소판응집을 활성화 시키는지에 관한 유무를 재확인해 보았다. Aggrolink를 이용한 혈액응고 관련 영향은 impedance 법을 사용하여 확인하 고 혈소판응집은 optical법을 사용하여 확인하였다. 시험은 전혈, 혈소판 풍부 혈장(PRP, Platelet Rich Plasma), 세척한 혈소판인 WP(Washed Platelet)에 대하여 실시하였으며 agonist로 콜라겐, 트롬빈, ADP를 사용하였다.
먼저 전혈, PRP, WP에 agonist 콜라겐 10 µg/ml, 트롬빈 2 unit/ml, ADP 10 µM를 처리한 결과, 응집이 됨을 확인함으로써 각각의 용매가 실험을 실시하기에 적절한지를 판단한 후 은나노 를 1~50 ppm 농도 범위에서 노출시켜 응집에 미치는 영향을 보 았다. 그 결과, 전혈, PRP, WP 모두에서 agonist가 투여되었을 때는 응집이 6분 내로 빠르게 일어났으나 은나노가 노출된 시험 용매에서는 10분 이상 경과하여도 응집이 일어나지 않음을 확인 하였다(Table I). 추가로 심혈관계 질환은 혈장 내의 응고인자의 지나친 활성화가 일어나 있기에 이러한 심혈관계 질환 모델로서 역치값의 agonist를 전처리한 후 은나노를 노출시켰을 때의 변화 를 관찰하였다. Jun,19) Knöfler,30) Elwood24)의 연구를 참고하여 혈액응고를 억제시키지 않는 agonist 농도를 콜라겐의 경우 1 µg/
ml, 트롬빈 0.02 unit/ml, ADP 1 µM로 설정하여 실험한 결과 역 시 전혈, PRP, WP 모두에서 응집이 일어나지 않음을 확인하였 다. Fig. 4는 WP 에 은나노를 노출시켰을 때의 응집여부를 보여 주는 그림이다. 혈소판이 응집되면 빛의 투과도 높아지므로 WPB 와 WP의 빛 투과도를 대비하여 퍼센트로 값을 나타내었다. 따 라서 100% 때에는 응집이 일어나지 않음을 의미하고 응집이 일 어날수록 WP의 빛 투과도가 증가하여 퍼센트 값이 줄어들어 응 집이 일어남을 뜻한다. Fig. 4A는 콜라겐 10 µg/ml를 WP에 투 여 후 응집이 빠르게 일어나는 것을 보여주며 아울러 은나노를 WP에 1, 2, 4 ppm 농도가 되도록 투여하였을 때는 응집이 일어 나지 않음을 보여준다. Fig. 4B, 4C, 4D 는 각각의 WP에 역치
Table I− Effects of citrate-capped silver nanoparticles on the blood coagulation and platelet aggregation
AgNPs Agonist3)
Non-activated1) Pre-activated2)
Collagen Thrombin ADP
Collagen Thrombin ADP
Whole blood - - - - + + +
PRP - - - - + + +
Washed platelet - - - - + + +
Agonists only3) were used only to show the stability of blood cells or platelet for the induction of aggregation (Collagen 10µg/ml, Thrombin 2 unit/ml and ADP 10 µM). AgNPs only1) was performed using non-activated samples while Pre-activation2) was performed using pre-activated samples by addition of sub-threshold level of the respective agonists for 3 minutes (Collagen 1µg/ml, Thrombin 0.02 unit/ml and ADP 1 µM).
값보다 낮은 값으로서 콜라겐 1 µg/ml, 트롬빈 0.02 unit/ml, ADP 1µM를 전처리한 후 은나노를 같은 농도로 투여하였을 때 응집 여부를 확인한 결과이며, 역시 응집이 일어나지 않음을 확인할 수 있다. 전혈과 PRP에서도 WP와 동일한 결과가 나왔다(그래 프 생략). 혈소판 응집능을 Optical법으로 측정 시 은나노의 농 도가 높아질수록 은나노 고유의 발색으로 인해 빛투과도의 측정 이 어려워진다. 따라서, 은나노의 최고농도를 4 ppm으로 설정하 였으며 더 이상의 고농도에서의 영향을 알아보기 위해서는 현미 경으로 확인하는 방법을 채택하였다. PRP에 은나노를 10 및 100 ppm으로 처리한 후 현미경으로 확인해 본 결과 콜라겐을 처리 한 경우와는 달리 은나노를 고농도에서 처리한 경우에도 역시 응 집이 일어나지 않음을 확인하였다(Fig. 5).
본 연구에서 사용한 구연산 캡핑된 은나노는 혈액응고 및 혈
소판 응집능을 보이지 않았는데 비슷한 결과로 Deb 등25)은 서 로 다른 표면 코팅을 한 철나노의 혈소판 응집능에 관한 연구에 서 구연산 자체만으로 혈소판 응집을 억제시키는 효과가 있으며 다른 코팅제와 달리 구연산 코팅된 철나노에서 혈소판응집억제 능이 증가한다고 하였다. Jun 등19)은 코팅제 없는 은나노를 사 용하여 혈소판 응집능이 활성화 된다는 결과를 얻었고 Shrivastava 등21)은 구연산 코팅된 은나노를 사용하여 혈소판 응집능이 억제 되었다는 결과를 볼 때 표면에 코팅된 구연산이 혈소판 응집을 억제시키는 효과를 가져왔다고 볼 수 있겠다. 현재까지 은나노 가 혈소판을 응집시킨다는 연구결과에서 사용하였던 은나노의 특성을 보면 Jun 등은 sigma사 제품을 사용하였으며 시험 환경 내에서의 물리화학적 특성이 제시되어 있지 않아 혈소판 영향을 평가하는데 어려움이 있다. Shrivastava 등은 자체 제작한 은나 Fig. 4− Effects of citrate-capped silver nanoparticles (AgNPs) on platelet aggregation. Non-activated platelets were incubated with AgNPs (1, 2, and 4 ppm) and no aggregation was observed while collagen induced aggregation. Although platelets were pre-activated by sub- threshold level of collagen (SC), sub-threshold level of thrombin (ST) and sub-threshold level of ADP (SA), no aggregation by AgNPs was observed while the respective agonists fully aggregate the platelets.
노를 사용하였으며32)구연산으로 pH를 7.4로 조정하였고 투과 전자현미경을 통하여 사이즈 및 morphology만을 알아보았을 뿐 표면전하들에 대한 정보가 제시되지 않아 물리적 특성에 의한 혈 소판 영향을 평가하는데 어려움이 있다. 그리고 Ragaseema 역 시 PEG로 코팅된 은나노를 자체 제작하여 사용하였는데 사이즈 및 morphology 정보만 간략히 있을 뿐 다른 물리적 특성에 대 한 정보가 충분하지 않았다.
결론적으로 구연산으로 캡핑된 은나노 입자는 혈액 응고 및 혈소판 응집을 활성화 시키지 않았으며 이것은 은나노의 코팅제 에 따라 다르게 결과가 나타날 수 있으므로 이에 관한 연구가 더 욱 진행되어야 할 것으로 생각된다.
결 론
본 연구에서는 구연산으로 캡핑된 평균입도 20~40 nm의 구 형 은나노 입자에 대해 혈액응고 및 혈소판응집 작용을 평가하 였다. 그 결과 본 연구에서 사용한 은나노 입자는 랫드의 혈액응 고 및 혈소판 응집에 대해 어떠한 영향도 나타내지 않았다.
은나노 입자가 혈액응고/혈소판 응집에 미치는 영향을 연구한 그간의 연구보고를 살펴보면 혈액응고 및 혈소판응집을 억제하 거나 촉진하다는 상반된 연구결과들이 제시되어 있는데, 이들이
사용한 은나노의 입도, 표면전하, 캡핑 물질, 불순물 등에 대한 상세한 정보가 제시되어 있지 않은 경우가 많다. 따라서 은나노 의 혈액응고 및 혈소판응집에 대한 영향을 제대로 평가하기 위 해서는 사용한 은나노 입자의 물리화학적 특성과 사용농도에 따 른 명확한 정보가 제시되어야 하며 본 연구에서의 연구결과는 향 후 은나노를 이용한 의료기기의 혈액응고/혈소판 응집작용에 대 한 위해성평가에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
감사의 말씀
이 논문은 2011년도 동덕여자대학교 학술연구비 지원에 의하 여 수행된 것임.
참고문헌
1) de Lima, R., Seabra, A. B. and Durán, N. : Silver nanoparticles:
a brief review of cytotoxicity and genotoxicity of chemically and biogenically synthesized nanoparticles. J. Appl. Toxicol. 32, 867 (2012).
2) Marambio-Jones, C. and Hoek, E. M. V. : A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment. J.
Nanopart. Res. 12, 1531 (2010).
3) Mukherjee, S. G., O'Claonadh, N., Casey, A. and Chambers, G. : Comparative in vitro cytotoxicity study of silver nanoparticle on two mammalian cell lines. Toxicol. In Vitro. 26, 238 (2012).
4) Li, Y., Chen, D. H., Yan, J., Chen, Y., Mittelstaedt, R. A., Zhang, Y., Biris, A. S., Heflich, R. H. and Chen, T. : Genotoxicity of silver nanoparticles evaluated using the Ames test and in vitro micronucleus assay. Mutat. Res. 745, 4 (2011).
5) Suresh, A. K., Pelletier, D. A., Wang, W., Morrell-Falvey, J. L., Gu, B. and Doktycz, M. J. : Cytotoxicity induced by engineered silver nanocrystallites is dependent on surface coatings and cell types. Langmuir. 28, 2727 (2012).
6) Choi, J., Reipa, V., Hitchins, V. M., Goering, P. L. and Malinauskas, R. A. : Physicochemical characterization and in vitro hemolysis evaluation of silver nanoparticles. Toxicol. Sci.
123, 133 (2011).
7) El Badawy, A. M., Silva, R. G., Morris, B., Scheckel, K. G., Suidan, M. T. and Tolaymat, T. M. : Surface charge-dependent toxicity of silver nanoparticles. Environ. Sci. Technol. 45, 293 (2011).
8) Loeschner, K., Hadrup, N., Qvortrup, K., Larsen, A., Gao, X., Vogel, U., Mortensen, A., Lam, H. R. and Larsen, E. H. : Distribution of silver in rats following 28 days of repeated oral exposure to silver nanoparticles or silver acetate. Part. Fibre.
Toxicol. 8, 18 (2011).
9) Park, E. J., Choi, K. and Park, K. : Induction of inflammatory Fig. 5− Microscopic observation of washed platelet aggregation by
increased AgNPs level. Washed platelets were incubated for 10 minutes with AgNPs or collagen, and the evidence of platelet aggregation was analyzed by microscope (×400). No platelet aggregation was observed in control group (A) and AgNPs-treated gorups (B; 10 ppm, C; 100 ppm) while serious aggregation was observed in collagen treated group (D).
responses and gene expression by intratracheal instillation of silver nanoparticles in mice. Arch. Pharm. Res. 34, 299 (2011).
10) Kim, Y. S., Kim, J. S., Cho, H. S., Rha, D. S., Kim, J. M., Park, J. D., Choi, B. S., Lim, R., Chang, H. K., Chung, Y. H., Kwon, I. H., Jeong, J, Han, B. S. and Yu, I. J. : Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhal. Toxicol. 20, 575 (2008).
11) Sung, J. H., Ji, J. H., Song, K. S., Lee, J. H., Choi, K. H., Lee, S. H. and Yu, I. J. : Acute inhalation toxicity of silver nanoparticles. Toxicol. Ind. Health 27, 149 (2011).
12) Kim, J. S., Song, K. S., Sung, J. H., Ryu, H. R., Choi, B. G., Cho, H. S., Lee, J. K. and Yu, I. J. : Genotoxicity, acute oral and dermal toxicity, eye and dermal irritation and corrosion and skin sensitisation evaluation of silver nanoparticles.
Nanotoxicology. Epub ahead of print (2012).
13) Park, K., Park, E. J., Chun, I. K., Choi, K., Lee, S. H., Yoon, J.
and Lee, B. C. : Bioavailability and toxicokinetics of citrate- coated silver nanoparticles in rats. Arch. Pharm. Res. 34, 153 (2011).
14) Stevens, K. N., Crespo-Biel, O., van den Bosch, E. E., Dias, A. A., Knetsch, M. L., Aldenhoff, Y. B., van der Veen, F. H., Maessen, J. G., Stobberingh, E. E. and Koole, L. H. : The relationship between the antimicrobial effect of catheter coatings containing silver nanoparticles and the coagulation of contacting blood. Biomaterials 30, 3682 (2009).
15) Choi, J., Reipa, V., Hitchins, V. M., Goering, P. L. and Malinauskas, R. A. : Physicochemical characterization and in vitro hemolysis evaluation of silver nanoparticles. Toxicol. Sci.
123, 133 (2011).
16) Zook, J. M., Maccuspie, R. I., Locascio, L. E., Halter, M. D. and Elliott, J. T. : Stable nanoparticle aggregates/agglomerates of different sizes and the effect of their size on hemolytic cytotoxicity. Nanotoxicology 5, 517 (2011).
17) Tang, J. and Xi, T. : Status of biological evaluation on silver nanoparticles. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 25, 958 (2008).
18) Asharani, P. V., Lian Wu, Y., Gong, Z. and Valiyaveettil, S. : Toxicity of silver nanoparticles in zebrafish models.
Nanotechnology 19, 255102 (2008).
19) Jun, E. A., Lim, K. M., Kim, K., Bae, O. N., Noh, J. Y., Chung, K. H. and Chung, J. H. : Silver nanoparticles enhance thrombus formation through increased platelet aggregation and procoagulant activity. Nanotoxicology 5, 157 (2011).
20) Ragaseema, V. M., Unnikrishnan, S., Kalliyana Krishnan, V.
and Krishnan, L. K. : The antithrombotic and antimicrobial properties of PEG-protected silver nanoparticle coated surfaces. Biomaterials 33, 3083 (2012).
21) Shrivastava, S., Bera, T., Singh, S. K., Singh, G.,
Ramachandrarao, P. and Dash, D. : Characterization of antiplatelet properties of silver nanoparticles. ACS Nano 3, 13571364 (2009).
22) Stalker, T. J., Newman, D. K., Ma, P., Wannemacher, K. M. and Brass, L. F. : Platelet signaling. Handb. Exp. Pharmacol. 210, 59 (2012).
23) Dyszkiewicz-Korpanty, A. M., Frenkel, E. P. and Sarode, R. : Approach to the assessment of platelet function: comparison between optical-based platelet-rich plasma and impedance- based whole blood platelet aggregation methods. Clin. Appl.
Thromb. Hemost. 11, 25 (2005).
24) Elwood, P. C., Beswick, A. D., Sharp, D. S., Yarnell, J. W., Rogers, S. and Renaud, S. : Whole blood impedance platelet aggregometry and ischemic heart disease. The caerphilly collaborative heart disease study. Arteriosclerosis 10, 1032 (1990).
25) Deb, S., Raja, S. O., Dasgupta, A. K., Sarkar, R., Chattopadhyay, A. P., Chaudhuri, U., Guha, P. and Sardar, P. : Surface tunability of nanoparticles in modulating platelet functions. Blood Cells Mol. Dis. 48, 36 (2012).
26) Corbalan, J. J., Medina, C., Jacoby, A., Malinski, T. and Radomski, M. W. : Amorphous silica nanoparticles aggregate human platelets: potential implications for vascular homeostasis.
Int. J. Nanomedicine. 7, 631 (2012).
27) Radomski, A., Jurasz, P., Alonso-Escolano, D., Drews, M., Morandi, M., Malinski, T. and Radomski, M. W. : Nanoparticle- induced platelet aggregation and vascular thrombosis. Br. J.
Pharmacol. 146, 882 (2005).
28) Deb, S., Patra, H. K., Lahiri, P., Dasgupta, A. K., Chakrabarti, K. and Chaudhuri, U. : Multistability in platelets and their response to gold nanoparticles. Nanomedicine 7, 386 (2011).
29) Li, X., Lenhart, J. J. and Walker, H. W. : Aggregation kinetics and dissolution of coated silver nanoparticles. Langmuir. 28, 1095 (2012).
30) Knöfler, R., Urano, T., Malyszko, J., Takada, Y. and Takada, A. : In vitro effect of endothelin-1 on collagen, and ADP-induced aggregation in human whole blood and platelet rich plasma.
Thromb. Res. 77, 69 (1995).
31) Tenzer, S., Docter, D., Rosfa, S., Wlodarski, A., Kuharev, J., Rekik, A., Knauer, S. K., Bantz, C., Nawroth, T., Bier, C., Sirirattanapan, J., Mann, W., Treuel, L., Zellner, R., Maskos, M., Schild, H. and Stauber, R. H. : Nanoparticle size is a critical physicochemical determinant of the human blood plasma corona: a comprehensive quantitative proteomic analysis. ACS Nano. 5, 7155 (2011).
32) Shrivastava, S., Bera, T., Roy, A., Singh, G., Ramachandrarao, P. and Dash, D. : Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles. Nanotechnology 18, 225103 (2008).
