Copyright ⓒ 2009, The Korean Academy of Oral Biology
81
Journal of Oral Biology
Effects of Baicalin on the differentiation and activity of preosteoclasts
Seon-Yle Ko
Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Dankook University
The present research was conducted by the research fund of Dankook University in 2007 (received April 28, 2009 ; revised May 18, 2009 ; accepted June 5, 2009)
Baicalin is a flavonoid purified from the medicinal plant Scutellaria baicalensis. It has been reported that baicalin exhibits antibacterial, anti-inflammatory and analgesic effects. The present study was undertaken to determine the underlying cellular mechanisms of baicalin action in preosteoclasts. The effects of this flavonoid on preosteoclasts were determined by measuring osteoclast generation and osteoclast activity in macrophage-colony stimulating factor (M-CSF)-dependent bone marrow cells (MDBMCs) and in co-cultures of MDBMCs and osteoblasts. Osteoclast generation was assayed by measuring the number of tartrate- resistant acid phosphatase (TRAP) ( +) multinucleated cells after culture. Osteoclast activity was assayed by measuring the area of the resorption pit after culture. We found that osteoclast generation was induced by M-CSF and receptor activator of NF-kB ligand (RANKL), and by the 1.25- dihydroxycholecalciferol in our cultures. Baicalin decreased both osteoclast generation and activity in MDBM cultures and co-cultures indicating that it may inhibit bone resorption.
Key words : baicalin, flavonoid, osteoclast, M-CSF, RANKL
서 론
골조직은 중요한 장기를 보호하고 근육을 지지하는 등 의 기계적인 기능과 혈중 칼슘의 농도를 유지하는 등의 무기질의 대사적 기능을 담당하는 석회화된 조직으로, 조 골세포 계통의 세포들과 파골세포로 구성되어 있다. 이들 세포들은 전신적인 호르몬뿐 아니라, 국소적으로 여러 인
자들에 의해 조절 됨으로써, 골개조가 이루어지는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 조절인자에 의한 골조직의 대사과정이 평형을 잃은 경우 골파괴와 연관된 골조직 질환이 발생될 수 있다 (Wasnich, 1996).
골조직 파괴가 항진된 골다공증의 치료나 예방의 목적 으로 여러 물질들이 연구되고 있다. 이러한 목적으로 현 재 사용되고 있는 골다공증 치료제는 호르몬 대체제, bisphos- phonate 제제, selective estrogen receptor modulator, 부 갑상선호르몬 제제 및 새로운 작용점을 대상으로 한 제 제 등이 있으며, 이들은 고유의 약리작용을 나타내고 있 으나, 여러 가지 부작용과 복용상의 어려움을 갖고 있다 (Rodan, 1994; Reginster, 1995; Stock, 1996). 이런 부작 용 및 문제점을 줄이기 위하여 천연물로부터 신약을 창 출하려는 시도가 진행되고 있다.
천연물은 여러 활성성분을 포함하고 있으며, 다양한 생 리활성을 가지고 있다는 연구가 되고 있다. 그 중 Herba epimedii는 여러 의학적 활성 성분을 함유하며, 수 천년 동안 심혈관계 질환, 불임, 건망증, 요통, 관절염, 사지의 마비 등에 사용되어 왔다는 보고가 있다 (Yeung, 1985).
또한 활성화 산소종 (reactive oxygen species, ROS) 들 이 파골세포 생성의 신호전달에 관여하여 파골세포의 생 성을 촉진하는 연구 결과가 있으며 (Ha 등, 2004; Reddy, 2004), 여러 생약 성분 중 하나인 flavonoid가 항산화 작 용과 활성 자유기 (free radical) 제거 효과를 가지고 있 다는 보고 (Gao 등, 1999)가 있다.
최근에 여러 종류의 flavonoid 들이 골조직내의 세포의 증식 및 활성에 영향을 미치는 등의 골조직 대사에 관여 함이 밝혀졌다. 즉 Epimedium koreanum Nakai로부터 분리한 total flavonoid는 조골세포의 생성을 억제하며, 분화를 촉진한다는 보고 (Zhang 등, 2008)가 있으며, Pueraria lobata에서 발견되는 puerarin은 조골세포의 alkaline phosphatase 활성과 석회화 결절 형성을 촉진하
*Corresponding author: Seon-Yle Ko, PhD, Dept. of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Dankook University San 29-1, Anseo-dong, Cheonan, Choongnam, 330-716, Korea.
Tel.: +82-41-550-1934, E-mail : [email protected]
는 등 조골세포의 기능을 항진시킨다는 보고 (Zhang 등 2008)가 있다. 또 다른 천연물인 Rehmannia glutinosa Libosch와 Eleutherococcus senticosus Max 추출액의 경우 파골세포의 생성을 억제한다는 보고가 있다 (Kim 등, 2007).
골다공증 치료 목적으로 다양한 flavonoid가 연구되고 있으며, 본 논문에서는 Scutellaria baicalensis 등에서 분 리되는 flavonoid인 baicalin에 대하여 연구하였다.
Scutellaria baicalensis는 중국 북부지방이 원산지이며 한 국에서도 자생하고 있고, Labiatea 과에 속하는 다년생 초로 한약제로도 사용되고 있다. Baicalin (7-glucuronic acid, 5,6-dihydroxy-flavone)은 다양한 생물학적 활성을 나타내 는 물질로, 항염증, 진통, 항균작용을 나타내며, 전사인자 인 nuclear factor-kappa B의 활성을 억제한다고 보고되 었다 (Wang 등, 2006). 또한 파골세포의 분화에 관여하는 receptor of activated nuclear factor kappa B ligand (RANKL)의 mRNA가 치주인대세포에서 baicalin에 의해 억제됨이 보고되었다 (Wang 등, 2006). 따라서 본 연구 에서는 baicalin이 뼈 조직의 주요세포인 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다. 즉 파골세 포의 생성 및 활성에 대한 직접적인 영향을 관찰하기 위 하여 마우스 골수세포를 분리하여 파골세포 전구세포로 부터 macrophage-colony stimulating factor (M-CSF)와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, 직 접 및 간접적인 영향을 관찰하기 위하여 마우스 두개관 으로부터 분리한 조골세포와 마우스 골수세포로부터 분리 한 파골세포 전구세포로부터 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25-DHCC)로 파골세포의 분화를 유도하였으며, 파골세 포의 생성 및 활성의 변화를 관찰하였다.
연구대상 및 연구방법
연구재료α-minimum essential medium (α-MEM), fetal bovine
serum (FBS), trypsin-EDTA 및 배양에 필요한 시약들은 Gibco laboratories로부터 구입하였다 (Gibco, Invitrogen Co. Grand Island, USA). 재조합 사람 M-CSF, 재조합 사 람 RANKL과 재조합 사람 TGF-β는 PeproTech EC Ltd (USA)으로부터 구입하였으며, Baicalin은 Sigma chemical company (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 1,25- DHCC은 R&D (Minneapolis, MN, USA) 사로부터 구 입하였다. 나머지 다른 시약은 Sigma chemical company 로부터 구입하였으며, 세포배양용기들은 Corning (Corning, NY, USA)사로부터 구입하였다.
M-CSF dependent bone marrow macrophage (MDBM) 세포의 분리 및 배양
마우스 골수세포를 분리하기 위해 마우스를 경부염전으
로 희생시킨 후 대퇴골과 경골을 적출하고 연조직을 제 거하였으며 장골의 양끝을 절단한 후 26G 주사침을 이용 하여 한쪽 끝의 골수강에 0.01% collagenase, 0.05% trypsin 및 0.5 mM EDTA가 포함된 효소 용액 1 ml를 천천히 주사하여 골수세포를 모은 후 30분간 37oC에서 교반하 여 골수세포를 모아 40 µm nylon mesh (Cell strainer, Falcon, USA)로 여과하여 단일 세포가 되도록 분산시켰 다. 10% FBS와 5 ng/ml M-CSF가 포함된 α-MEM으로 100 mm 배양접시에 6 × 106개 세포가 되도록 분주하여 24시간 전 배양한 후 미부착세포들을 모았다. 실험 목적 에 따라 미부착세포만을 배양하거나 일차배양 조골세포 와 혼합배양하였다. 즉 파골세포의 전구세포가 되는 미부 착세포를 10% FBS, 10 ng/ml M-CSF and 1 ng/ml TGF- β가 포함된 α-MEM으로 96-well plate 및 96-well OAASTM plate (Oscotec Inc., Korea)에서 well당 5 × 104개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 7-8일간 배양하는 동안 10 ng/
ml M-CSF, 1 ng/ml TGF-β 및 50 ng/ml RANKL과 여러 농도의 baicalin이 포함된 배양액으로 배양하였으며, 3일과 6일째 신선한 배양액으로 교환하였다. 배양이 끝난 후 파 골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하고, 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 세 포를 떼어낸 후 흡수된 부위를 관찰하였다.
MDBM과 조골세포의 혼합배양
조골세포 일차배양은 연속효소처리 방법에 의해 골세포 를 분리하였다. 즉 생후 2-3일 된 마우스 두개관을 무균 적으로 적출하여 혈청이 없는 α-MEM에 모은 후 0.1%
type II collagenase, 0.05% trypsin 및 4 mM EDTA가 포함된 효소용액으로 37oC에서 10분 (I), 10분 (II), 10분 (III), 20분 (IV) 및 20분 (V)간 처리하여 5군의 골세포 군을 분리하였다. 분리한 골세포군 중 III, IV, V군을 모 아 효소용액과 동량의 ice-cold FBS를 첨가하고, 원심분 리하여 세포를 모은 후 100 mm 조직 배양 접시에 10%
FBS가 포함된 α-MEM으로 배양하였다. 배양액은 처음 24시간 후에, 그 다음은 매 48시간마다 교환해주면서 7 일간 배양하였다. 배양시 온도는 37oC, 습도는 95%를 유 지하였으며, 계속하여 5% CO2와 95% 공기를 공급하였 다. 일주일간 전 배양한 후 96-well plate 및 96-well OAASTM plate (Oscotec Inc., Korea)에서 well당 2 × 104 개의 세포가 되도록 분주하고, 24시간 후 실험방법 2에 서 분리한 파골세포의 전구세포가 되는 미부착세포를 6× 104개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 7-8일간 배양하는 동안 10 nM 1,25-DHCC와 여러 농도의 baicalin 이 포함된 배양액으로 배양하였으며, 3일과 6일째 신선 한 배양액으로 교환하였다. 배양이 끝난 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하고, 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 세포를 떼 어낸 후 흡수된 부위를 관찰하였다.
파골세포의 생성 측정
배양이 끝난 후 인산완충 생리식염수로 세포를 세척한 다음 citrate-acetone-formaldehyde 용액으로 고정한 후 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 시행 하여 파골세포의 생성정도를 평가하였다. TRAP 염색은 Sigma 사의 TRAP 염색용 kit를 구입하여 제조사의 지시 에 따라 시행하였으며, 기질로 naphthol AS-BI phosphate 를 이용하였고, 염색제로는 fast Garnet GBC 용액을 사 용하였다. 염색이 끝난 후 광학현미경을 이용하여 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵세포를 계수하여 파골세포의 생성지표로 삼았다.
파골세포의 흡수와 관찰
파골세포의 활성을 검사하기 위하여 수산화인회석으로 피막된 OAAS plate 에서 세포를 배양 후 배양액을 제 거하였다. 5% sodium hypochlorite 용액을 5분간 처리하 여 세포를 떼어낸 후 흡수된 부위를 광학현미경상에서 관 찰하여 image-pro plus (version 3.0, Media Cybernetics Inc., USA) 프로그램을 이용하여 전체 흡수와의 면적을 측정하였다.
통계처리방법
본 실험의 통계처리는 Student's t test 방법을 사용하 였으며, 값은 평균과 표준 오차로 나타냈다.
연구 결과
Flavonoid의 일종인 baicalin이 직접 파골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 마우스 골수세포를 분리하여 파 골세포 전구세포 (MDBM)로부터 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, 파골세포의 표 지효소인 TRAP 양성 다핵세포의 형성을 관찰하여 파골 세포의 생성에 미치는 영향을 알아보았으며, 흡수와를 측 정함으로써 파골세포의 활성 변화를 측정하였다.
또한 baicalin이 직접 및 간접적으로 파골세포에 미치 는 영향을 관찰하기 위하여 마우스 두개관으로부터 분리 한 조골세포 (MCC)와 마우스 골수세포로부터 분리한 파 골세포 전구세포 (MDBM)로부터 1,25-DHCC로 파골세 포의 분화를 유도하였으며, 파골세포의 생성 및 활성의 변화를 관찰하였다.
Baicalin이 파골세포의 분화에 미치는 직접적인 영향을 관찰하기 위하여 MDBM을 배양한 후 TRAP에 양성인 다핵세포를 계수한 결과, 파골세포의 생성이 감소하는 경 향을 보였으며, 5 및 10 ug/ml의 농도에서 유의성 있는 파골세포의 생성을 관찰하였다 (Fig. 1). Baicalin이 파골 세포의 분화에 미치는 직접 및 간접적인 영향을 관찰하 기 위하여 MDBM과 MCC를 배양 후 TRAP 에 양성
인 다핵세포를 계수한 결과 파골세포의 생성이 감소하는 경향을 보였으며 5 및 10 ug/ml의 농도에서 유의성 있는 파골세포의 생성을 관찰하였다 (Fig. 2).
Baicalin이 파골세포의 활성에 미치는 직접적인 영향을 관찰하기 위하여 MDBM을 배양한 후 흡수와를 관찰한 결과 1, 5 및 10 µg/ml 의 농도에서 유의성 있는 감소를 나타냈다 (Fig. 1). Baicalin이 파골세포의 활성에 미치는 간접적인 영향을 관찰하기 위하여 MDBM과 MCC를 배 양 후 흡수와를 관찰한 결과 파골세포의 활성이 감소하 는 경향을 나타냈으며, 10 µg/ml 의 농도에서 유의성 있 는 파골세포의 활성 감소를 나타냈다 (Fig. 2).
총괄 및 고찰
전통적으로 사용되던 식물들에서 골다공증과 뼈의 파절 에 대한 치료효과들이 보고된 바 있다 (Hidaka등, 1997;
Chen 등, 2004; Xie 등, 2005). 최근 연구에서는 Ajuga decumbens 추출액이 NO 생성을 억제하며, 동물실험에서 골다공증과 관절염에 효과가 있다는 보고를 하였으며 (Ono 등, 2008), Rubus coreanus 추출액은 조골세포의 증식을 촉진하며, 파골세포의 세포사멸을 유도하였으며, 골다공증 이 유도된 동물실험에서 유의한 효과를 보여준 바 있다 (Do 등, 2008).
Baicalin은 다양한 생물학적 활성을 나타내며, 주로 항 산화 작용과, 면역 반응을 조절함이 알려져 있다 (Shen등, 2003). 또한 baicalin은 백혈구, 치은섬유아세포 및 치주 인대세포 등에서 활성화 산소종, pro-matrix metalloproteinase, pro-inflammatory cytokine 과 prostaglandin E2 등을 조 절한다고 보고되었다 (Shen등, 2003; Song등, 2004). 또 한 baicalin으로 표면을 변화시킨 poly D, L-lactic acid film위에서 조골세포의 부착과 세포증식이 유의하게 증가 되었다는 보고도 있다 (Liu등, 2003).
본 연구는 baicalin이 파골세포에 미치는 영향을 알아 보기 위하여, 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. 뼈조직에서 유일하 게 뼈의 파괴를 담당하는 파골세포는 단핵구/대식세포 계 통의 세포이며, 여러 조직에 존재하는 단핵구 대식 전구 세포로부터 시험관내에서 파골세포의 생성이 가능하다 (Suda 등, 1999). 파골세포가 조혈기관 기원인 것을 이용하여 다수의 파골세포 전구세포를 얻기 위하여 골수세포 배양 이 널리 이용되고 있으며 (Takahashi 등, 1988a), 이러한 골수세포 배양시 관찰되는 다핵세포는 TRAP 양성 반응 을 나타내고 calcitonin 수용체 (Takahashi 등, 1988b)를 가지며 석회화된 상아질을 흡수할 때 주름변연을 형성하 는 (Sasaki 등, 1989)등의 파골세포의 특징을 나타내고 있으며, TPAP은 골조직내 다른 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포화학적 표지효소로 이용된다 (Minkin,
1982). 본 연구에서는 파골세포 전구세포를 배양하여, M- CSF와 RANKL을 처리하여 TRAP 양성 다핵세포인 파 골세포의 분화를 유도하였으며, baicalin을 처리한 결과 TRAP 양성 다핵세포의 형성 및 흡수와의 면적이 유의 하게 감소되었다. 위의 결과로 baicalin이 파골세포의 생 성과 함께 활성도 억제시킴을 알 수 있었다. 이는 baicalin 이 파골세포 전구세포로부터 파골세포가 생성되는 단계 에 직접적인 영향을 끼쳤음을 알 수 있다.
또 다른 배양시스템으로 파골세포 전구세포와 일차배양 한 조골세포 전구세포를 혼합 배앙하면서 1,25-DHCC로 파골세포의 분화를 유도하였으며, baicalin을 처리한 경우 마찬가지로 TRAP 양성 다핵세포의 형성 및 흡수와의 면
적이 유의하게 감소되었다. 그러나 그 억제 비율은 파골 세포 전구세포만을 배양한 경우에 비해 낮게 나타났다. 따 라서 직접적인 효과 외에 간적접인 효과에 의한 상승 작 용은 보이지 않았다. Wang등이 (2006) 사람 치주인대세 포배양에서 IL-1β로 RANKL의 생성을 유도한 후 baicalin 에 의해 RANKL의 생성이 억제됨을 확인한 바 있다. 따 라서 본 실험에서도 baicalin이 조골세포로부터 RANKL 의 생성을 억제하여 파골세포의 생성 억제에 간접적인 영 향을 미칠 것으로 기대하였으나 유의성 있는 결과를 보이 지 않았다. 이는 RANKL의 생성을 적절한 자극인자로 유 도하지 않는 등의 배양조건의 차이에 따른 결과로 생각된다.
최근 Cai 등 (2008a, 2008b)은 nylon 결찰에 의해 치
Fig. 1. Baicalin inhibits osteoclast generation and activity of MDBM cells. MDMB were treated with M-CSF (10 ng/ml) and RANKL
(50 ng/ml) for 8 days in the absence or presence of baicalin at various concentrations. The cells were stained for TRAP and photographed at
40× (A~C). Images were photographed under a light microscope at 40× after the cells were removed (D~F). (G) TRAP + MNCs ( ) contain-
ing three or more nuclei were scored and the area of resorption pits ( ) were analyzed using Image pro-plus system. Results are expressed as
means ± SE (%). *p < 0.05 and **p < 0.01.
주질환이 유도된 rat에서 cyclooxygenase-2나 nitric oxide synthase의 발현을 억제함으로써, 또는 결체 조직의 파괴와 관련된 효소인 matrix metalloprotease (MMP)-1, MMP- 2 및 MMP-9의 발현을 억제함으로써 baicalin에 의한 치 조골 보호효과를 보고한 바 있다. 또한 baicalin이 조골 세포의 alkaline phosphatase의 활성을 증가시키며, 파골 세포의 생성 억제와 관련된 단백질인 osteoprotegerin의 생성을 억제함을 보고한 바 있다 (Ko, 2008).
이상의 결과baicalin은 파골세포의 생성 및 활성을 직 접적으로 억제함으로 골대사에 관여할 것으로 생각되며, 골다공증 뿐 아니라 치주질환과 같은 뼈 파괴 질환에서 효과를 나타낼 수 있으리라 여겨진다.
참 고 문 헌
