Anticancer Activity of Acer mono Wood Extracted by Ultra High Pressure Extraction Process

초고압 추출 공정을 통한 고로쇠 목부 추출물의 항암활성 증진

정명훈*^,**·최운용*·서용창*·강하영***·최근표****·이현용*^,**^,*****^†

*강원대학교 바이오산업공학부 생물소재공학과, **의료·바이오신소재융복합연구사업단, ***국립산림과학원,

****강원도립대학 식품가공제과제빵과, *****강원대학교 생명공학연구소

Anticancer Activity of Acer mono Wood Extracted by Ultra High Pressure Extraction Process

Myoung Hoon Jeong*^,**, Woon Yong Choi*, Yong Chang Seo*, Ha Young Kang***, Geun Pyo Choi**** and Hyeon Yong Lee*^,**^,*****^†

*Department of Biomaterials Engineering, College of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Korea.

**Medical & Bio-materials Research Consortium and Department of Biomaterials Engineering, College of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Korea.

***Korea Forest Research Institute, Seoul 130-712, Korea.

****Department of Food Processing & Bakery, Gangneung Provincial University, Gangneung 210-804, Korea.

*****Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Korea.

ABSTRACT : We investigated a method to improve anticancer activities of

wood extracts by ultra high pressure extraction process. The

was extracted by water at 40

and 300 MPa for 15 min (High Pressure Extraction, HPE). The extraction yield by ultra high pressure extraction process was 5.42%. The cytotoxicity on human normal lung cell (HEL299) of the extracts from HPE showed 21.54% lower than that from conventional water extraction at 100

in adding the maximum concentration of 1.0

/

. Ultra high pressure extracts process for 15 minutes extracts (HPE15) showed more potent scaveng- ing effect than the control, BHA. On SOD-like test, the HPE15 showed highest activity as 32.4% at 1.0

/

concentration.

Human stomach adenocarcinoma, liver adenocarcinoma, breast adenocarcinoma and lung adenocarcinoma cell growth were inhibited up to about 67~79%, in adding 1.0

/

of extracts from HPE. HPE was 20~25% higher than conventional water extraction. It was interesting that, among several cancer cell lines (stomach adenocarcinoma, liver adenocarcinoma), the growth of digestive related cancer cells were most effectively inhibited as about 75~79%. On

experiment using ICR mice, the variation of body weight of mice group treated

wood extracts from HPE of 100

/

/day concentration was very lower than control and other group. The survival times of group treated this extracts was 61.96% longer than that of the control group and this extracts showed the lower tumor weight, which were 10.49 g than positive control as 16.17 g. Based on these results, we could tell that the HPE wood extracts of

had higher anticancer activity than conventional water extraction. The results of HPE showed obvious advantages in higher efficiency, shorter extraction time, at lower energy costs.

Key Words

:

서 언

현재국내에서고로쇠나무에관한연구는대부분수액에관

한연구가주를이루고있으며, 즉무기물과당류분석 (Kim

et al., 1991), ^{자작나무수액중에칼슘}, ^{마그네슘분석} (Yoon et al., 1992), 수액성분분석과효능 (Ahn, 1975) 에대한연 구 등이 보고되고 있다. 일본의 경우는 국내에 비해 비교적 폭넓은연구가이루어지고있으나우리나라와마찬가지로약

리적 효과보다는 수액의 성분분석에 관한 (Terazawa et al.,

1984) 연구가많이보고되고있다. 우리나라는고로쇠나무수

액에대한 음용의역사도깊고최근에는수액소비량도증가 하고있어 수액을이용한산업화가시도되고있으나이를뒷 받침할 과학적 연구가 많지 않다 (Moon and Kwon, 2004).

또한 대부분의연구가 고로쇠수액에 관한것으로, 고로쇠나 무자체의활성연구는분획을통한항산화물질분리 (Kwon

et al., 1997), 고로쇠와 우산고로쇠 나무의 항산화능 및

†Corresponding author: (Phone) +82-33-250-6455 (E-mail) [email protected]

Received 2010 April 19 / 1st Revised 2010 May 20 / 2nd Revised 2010 May 26 /3rd Revised 2010 June 4 / Accepted 2010 June 8

glutathione S-transferase^활성비교 (Jin et al., 2008), ^고로쇠와

우산고로쇠나무의부위별항암및면역조절능비교 (Syed et al., 2007) 등이보고되고있을 뿐이다.

인간을 비롯한 모든 호기성 생물체들은공기 중의 산소를 이용하여생명유지에필요한에너지를생성하는과정에서활 성산소족 (¹O2, H2O2, ^·OH)이발생하며, 이들에대한자기방 어기구를가지고있다. 그러나생체 방어 기구에이상이초 래되거나각종물리, ^{화학적요인들에의해활성산소족의생}

성이증가되면산화적손상을입게되어직접 또는간접적으

로생체에 장애를 유발하는것으로 알려져 있다 (Gutteridge

and Halliwell, 1994). 특히 노화나 암, 심혈관계 및 신경계 질환을일으키는것으로알려진활성산소는효소계, 환원대사,

화학약품, 공해물질, 광화학반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인들에의하여인체내의안정한상태의산소가전환되어세 포구성성분을 비가역적으로 파괴한다고알려져있다 (Cross et al., 1987). ^{그러므로생체내활성산소 생성을억제하는것}

은질병예방을 위한중요한대응책 중하나이다. 기존의합 성 항산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA)와 butylated hydroxytoluene (BHT)는 효과는 우수하나 이들 페놀계 합성 항산화제의안전성에대하여 논란이제기되어소비자들의거 부반응으로 인한 사용이 감소되고 있는 추세이다 (Barene, 1975). ^{산화에의해 생성되는각종 산화생성물은} DNA^를손

상시키거나 암을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Ames and Saul, 1987). 이처럼산화와암발병은매우 밀접하게연관되 어있는데, 암은전세계적으로가장널리퍼져있는질병으로 해마다많은 인구가 사망하고있으며, 우리나라의경우암으 로인한사망률이전체사망률중높은수치를나타내고있고 발생률도증가하고있다. 암이 발병되어진행이 계속될경우 수술, ^{약물처방및방사선치료등을통한집중적인치료를해}

야하지만이와같은약물치료는그독성등의후유증을배제 할수없으므로최근항암및암예방이우수한새로운천연물 중에서 항산화물질 (Park and Kim, 1992) 및안전성이 높은 약물개발이절실히요구되고있다 (Kang and Liang, 1997).

한편 기존의 천연물 추출에 사용된 전통적인방법은 추출 효율이낮고에너지소비가많으며열로인한 많은유용성분 의파괴, ^{단백질의변이}, ^{성분의손실}, ^{가용성분위주의추출},

열에 대하여 불안정한 것 등의 단점을 드러내고 있다 (Park

et al., 2004). 이러한단점을 극복하기위하여초고압 기술을 약용식물의유용 성분을추출하는데적용할 수있는데, 이러 한추출법을초고압 추출이라고한다. 초고압기술은 약용작 물의 유효 성분을짧은 시간 내에 추출할 수있으며 순도가 높은 단일 성분과불순물이 거의 없는 추출물을얻을 수있 다. ^{그것은 초고압 하에서 세포막이 파괴} (Bennett et al.,

1998) ^{되어 세포 안으로 용매의 침투가가능하여 보다 많은}

성분이세포밖으로쉽게용출되어나오기때문으로추정하고

있다. ^{그리고 고로쇠와같은 표면이딱딱한 조직으로이루어}

진목본류의추출에있어서단순 열수추출공정으로는용매 의목본류조직으로의효과적인침투가어려워유용성분의추 출에한계가있고, 이러한단점을극복하기위해고온의열수 를이용하게되면목적하지않는독성성분의용출로식품이나 약용으로서의이용에한계가있다. 따라서이러한목본류의기 존추출공정의단점을극복하고활성성분의효과적인용출을 가능하게하기위해본연구에서는초고압공정을고로쇠목 부의추출에적용하였다.

고로쇠나무의경우수액이흐르는목부부위에관한연구는 많지 않은 실정이다. 수액을 건강음료로서마시는 풍습은소 련, 중국, 일본등에서도오랜역사를가지고있으며민간약으 로서는 이뇨, 변비, 위장병, 통풍, 류마티스, 관절염, 수창, 부 창, 습진, 괴혈병, 신경통, 산후통등에효험이있다고하여이 들수액성분에 대한관심이 높다. ^{이처럼 여러가지 효능을}

가진수액이흐르는목부 부위의기능성식품소재혹은 약용 으로서의가능성을확인하고자초고압공정을통한추출물의 항산화활성을분석하였고, 항산화력과항암활성이밀접하게 연관되어있다는 연구들 (An et al., 2006; Lee et al., 2005)

에근거하여 SRB (sulforhodamine B) assay에의한항암활성 증진효과를연구하였다.

재료 및 방법

1.

고로쇠나무의 목부를 2009년 5월에 강원도 인제군에서채 취한것으로, 재료를실온에서음건시킨후사용하였다.

2.

초고압추출은고로쇠나무목부 100 g^{을비닐팩에물과함}

께넣어공기가 들어가지않도록잘밀봉한후, 초고압 추출 장치 (Ilshin autoclave, Daejeon, Korea)를 이용하여 300 MPa의압력으로 15분간초고압추출을시행하였다. 초고압추 출이끝난고로쇠목부를수직환류냉각기가부착된추출 flask

에 10배의증류수를사용하여 40℃에서 12시간 동안 2회반 복추출하였다. ^{얻어진추출물을감압여과장치로여과하여농}

축·동결건조 한후 실험에 사용하였다. 대조군으로 사용된 일반 열수추출공정은 100 g의고로쇠목부 시료를수직환류 냉각기가 부착된추출 flask에각각 10배의 증류수를 사용하 여 100℃에서 12시간동안 2회반복추출하였다. 얻어진각각 의추출물을감압여과한후여액을회전증발기 (rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)로 감압농축하고 다시 농축액을 동결건조하여 분말 상태의 추출물을 0.2, 0.4 0.6. 0.8 ^및 1.0^㎎/^{㎖의농도로증류수에녹여실험에사용하}

였다.

3.

세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640^과 Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12(D-MEM/

F-12)를사용하였고, Hepes buffer를배지제조시사용하였다.

또한, 혈청은 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였 고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA를배지 제조 시사용하 였다.

4.

실험에 이용된 세포주는 인간 위암세포인 AGS (stomach adenocarcinoma, human, ATCC CRL-1739, USA), 인간 폐 암세포인 A549 (lung adenocarcinoma, human, ATCC CCL- 185, USA), 인간 유방암세포인 MCF-7 (breast adenocarci- noma, human, ATCC HTB-22, USA), 인간 간암세포인

Hep3B (liver adenocarcinoma, human, ATCC HB-8064, USA)를사용하였고, 시료자체의세포독성을알아보기위한 정상세포로는 인간 정상 폐 세포인 HEL299 (Human Embryonic lung, ATCC CCL-137, USA)를사용하였다.

5.

In vivo 실험에 사용된 실험동물은 4주령의 ICR (female, 22~24 g) ^{마우스를구입하여온도} 20~25^℃, ^습도 55^±10%^가

유지 가능한 사육실에서 일주일간안정기를 취한 후 실험에 사용하였다. 12시간간격으로점등하였으며, 멸균된고형사료 와 식수를 자유 급식하였다. 실험에 사용된 암세포주는

Sarcoma-180 (ATCC CCL 8, USA)을사용하였다.

6. DPPH radical

추출물의전자공여작용 (electron donating abilities, EDA)^은

각각의 추출물에대한 DPPH (α,α-diphenyl-picrylhydrazyl)의 전자공여효과로각시료의환원력을측정하였다. 즉, 에탄올 1

㎖, 시료 10㎕, 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) 990㎕를분주한 시험관에 0.5 mM DPPH 용액 (Abs. EtOH soln.) 0.5㎖를넣어교반하고, 암실에서 5분간반응을유도한 후, 잔존 radical의 농도를 UV spectrometer를이용하여 517

㎚에서 측정하였다 (Lee and Lee, 2008). ^{전자공여능}(%)^은 [(1−As / Ac) × 100]으로나타내었고, As와 Ac에실험군과대 조군의흡광도 값을 각각대입하여 계산하였다. 그리고항산 화제인 butylated hydroxy anisole (BHA)의활성을 조사하여 본실험의추출물과의비교를실시하였다.

As:추출물첨가구의흡광도

Ac:추출물첨가구의흡광도

7. SOD

SOD ^{유사활성은} Marklund^와 Marklund^의방법 (Marklund and Marklund, 1974)에따라과산화수소 (H2O2)로전환 반응 을촉매하는 pyrogallol의생성량을측정하여 SOD 유사활성으 로나타내었다. 즉, 일정농도의 시료 0.2㎖에 pH 8.5로보 정한 Tris-HCl buffer (50 mM tris [hydroxymethyl] amino- methane + 10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6㎖ 와 7.2 mM pyro- gallol 0.2^{㎖를첨가하고} 25^℃에서 10^{분간 반응 후} 1N HCl 0.1^{㎖ 를 가하여 반응을 정지시켰다}. ^{반응액 중 산화된} pyrogallol의 양은 spectrophotometer를 이용하여 420㎚에서 흡광도를측정하였다. SOD 유사활성은시료 첨가및무첨가 구간의 흡광도차이를백분율(%)로나타내었다.

As:추출물첨가구의흡광도

Ac:추출물무첨가구의흡광도

단, As와 Ac는대조구의흡광도를제외한수치

8.

HEL299^의 SRB (sulforhodamine B) assay (Dool and Peto,

1983) 는세포단백질을염색하여세포의증식이나독성을측

정하는방법으로실험에사용된세포주로는인간 정상폐세

포인 HEL299를이용하여세포독성을측정하였고, 항암활성은

폐암세포 (A549), 위암세포 (AGS), 간암세포 (Hep3B), 유방 암세포 (MCF-7)를이용하여 측정하였다. 실험 대상 세포의 농도를 4~5 × 10⁴cells/㎖ 으로 96 well plate의 각 well에

100^{㎕씩첨가하여} 24^{시간 동안배양} (37^℃ 5% CO²)^한후,

각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0㎎/㎖ 로 100㎕씩첨가하여 48시간배양하였다. 배양이완료된후 에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v) TCA (trichlo- roacetic acid) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후증류수로 5회세척하여 TCA를제거하고실온에서 plate를 건조한 뒤각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/

v) SRB^용액을 100^{㎕씩첨가하고상온에서} 30^{분동안 염색}

시켰다. 결합되지않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4~5

회정도 세척, 건조시킨 후에 100㎕의 10 mM Tris buffer

를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540㎚ 에서 microplate reader (Molecular Devices, THERMO max, USA)를 이용하 여흡광도를측정하였다.

Selecivity 측정은 SRB assay를 이용하여 정상세포

(HEL299)^{에대한 각} sample ^{농도에서세포독성을 측정하고},

각암세포주의생육억제활성을측정한후각농도에서의세 포독성에대한암세포생육억제활성의비로써계산한다. EDA (%) = (1− _AcAs )×100

SOD 유사활성 (%) = (1⁻ _Ac^As )×100

9. Sarcoma-180

flask^{로부터분리한후} 2 × 10⁶ cells/mouse^{의농도로조절하여} 200^㎕를 mouse ^복강에 1^㎖ syringe^{를이용하여피하이식하}

였다. 상기의 방법으로 mouse 복강 내에서 6~7일 간격으로 계대배양을통해 보존된 sarcoma-180 세포를 취하여 복수암 실험군 mouse의복강과고형암실험군 mouse의왼쪽대퇴부 근육에 200㎕ 씩 피하이식하였다. 종양세포 이식 후 21일 동안 1일투여량 0.5㎖, 최종 농도를 30, 100㎎/㎏로조절 한각각의시료를 경구투여하였다. ^{실험군은암을 유발시키}

지 않고 사료만 먹인 group (negative control group), 암유 발 후 사료만 먹인 group (positive control group), 암을 유 발시킨 후 시료를 투여한 group (treated samples group)으 로분리하여 실험을 수행하였다. 30일간 3일간격으로 복수 암 유발 mouse의 체중을 측정하였고 생존율 (survival rate)

을측정하였으며, 고형암 유발 mouse에서 종양세포이식 30

일후 경추 탈골법을 통해 치사 후 고형암과 비장 및간의 무게를 측정하여 체중에 대한 장기의 중량을 측정하였다

(Kim et al., 2007).

S:Mean survival days of treated mouse C:Mean survival days of control mouse

C:The average tumor weight of control / The average body weight of control

S:The average tumor weight of treated group / The average body weight of treated group

10. Scanning Electron Microscope

초고압공정을거친후세포조직의형태학적변화를관찰하 기위해 저진공주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron,

× 400)은일본의 Hitachi Science systems의 S-3500N으로 촬 영하여고로쇠수피의표면을관찰하였다.

11. HPLC

시료 내유용성분들의 비교를위해 HPLC ^분석용 water^에

녹여 0.45㎛ syringe filter로 여과하고물 추출물과물 추출 후초음파병행추출물, 5분의초고압추출물 그리고 15분의 초고압 추출물을 각각 1㎎/㎖의 농도로 조제하여 injection volume 20㎕ 로 측정하였다. HPLC 기기는 BIO-TEK instrument (Italy)사의 HPLC 500 series (Pump : BIO-TEK 522 controller, column : Alltech Prevail C18 5 µ) ^및 ELSD 2000ES^{를사용하였다}. ^{이동상은물과} acetonitrile^{을사용하였}

는데처음 10분간은 acetonitrile과물의 비율을 20 : 80, 그후 매 10분간 40 : 60, 60 : 40, 80 : 20으로하였고마지막 10분간 은 20 : 80의 비율로 하였으며, 유속은 1.0㎖/min, 파장은

203㎚에서측정하였다.

12.

데이터의통계처리는각시료를 3^{회반복으로행해졌으며},

실험값의통계는 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여평균과표준편차를구하여처리하였다.

결과 및 고찰

1.

Table 1은고로쇠나무목부추출물의추출공정별추출수율

을나타낸것이다. 각공정을 3번추출하여그평균값을수율 로계산하였다. 추출수율결과를통해초고압처리추출물의

수율이 5.42%로가장 높은추출 수율을나타내어일반 열수

추출공정과비교하여약 1.5배의높은추출수율을나타내었는

데 이는 초고압 공정을 통한 복분자의 면역활성 (Kwon et

al., 2007) ^{에관한 연구에서 보고된 초고압} 5^분, 15^{분 처리}

추출물이일반열수 추출에비해각각 1.8^배, 1.9^{배까지증가}

하였다고보고된내용과유사한결과로서초고압공정을통해 고로쇠나무 목부의 수율이 증가하는결과를 확인할 수 있었 다. 또한, 이와비슷한목본류를사용한연구결과로저온고압 공정을 통한 매자나무 연구에서도 (Ling et al., 2008) 일반 열수추출공정의 8.39%에비해약 3%가높은 11.41%의추 출수율을나타내었다. ^{이처럼초고압공정에의해기존의추}

출방법으로는용출되어지지 않았던성분들이초고압처리를 통한 조직과 세포막의 변형으로 인해 용매들이 세포 안으로 쉽게들어감으로써기존물질들의용출량이증가한결과라사 료된다. 한편 앞선 고로쇠나무 수피의 추출 수율 연구결과

(Jeong et al., 2009) 일반 열수 추출물의 5.68%, 15분 초고

압추출물의 9.87%와비교하여보면본연구의목부추출수

율이 약 4% ^{정도 낮은 것을 알 수 있는데}, ^{이러한 결과는}

수피와 비교하여 비교적 단단한 조직으로엉겨 있는 목부의 표면조직 특성상용매의침투가수피에비하여어려워추출

Selectivity = ^암세포_{정상세포의}^생육억제_세포^활성_독성

Survival rate (%) = ^S−_C^C ×100

Tumor growth inhibition ratio (%) = ^C_C^−S ×100

수율이낮은것으로사료된다. 수피와목부의추출수율비교 결과를바탕으로목부의추출수율을높이기위한새로운추 출공정의연구가필요할것으로사료된다.

2.

실험에 사용된 sample^{의 농도를} 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ^그리고 1.0㎎/㎖로조절하여정상폐세포인 HEL299에대한세포독 성을 측정하였다 (Fig. 1). HEL299에 대한 실험결과 농도가 증가할수록세포독성이증가하는것을 확인할수있었고, 초 고압추출물의경우시료농도 0.6㎎/㎖이상의농도에서유 의적인 독성증가를 보였다. HPE (High Pressure Extracts)가

0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ^및 1.0^㎎/^{㎖의모든 농도에서} WE (Water Extracts) ^{보다 낮은세포독성을나타내었다}. ^{독성이가장높}

은 1.0㎎/㎖의 농도에서 HPE가 21.54%, WE가 24.58%로 높은세포독성을나타내었다. 세포독성결과를살펴보면초고 압처리를한추출물의세포독성이일반열수 추출물의세포

독성과비교하여약 4% 낮은세포독성을나타내는것을확 인할 수있는데, ^{이는 초고압 공정으로 인한 목질계 시료에}

함유되어있던독성물질이높은압력에의해파괴및변성된 결과라사료되고일반열수추출공정의경우열에의한유용

성분의변성으로독성을나타내는것으로사료된다 (Kim et

al., 2007).

3. DPPH radical

일반적으로특정물질에대한항산화활성을측정하는방법 중 DPPH radical ^{소거활성법은비교적간단하면서도대량으}

로측정이 가능한방법이다. 전자공여작용은 활성라디칼에 전자를공여하여지방질산화를 억제시키는척도로사용되고 있을뿐만아니라인체내에서활성라디칼에의한노화를억 제하는작용의척도로도이용되고있다 (Choi and Oh, 1985).

추출공정에따른 고로쇠나무 목부추출물의 DPPH radical

소거활성을 Fig. 2^{에나타내었다}. ^{추출물의농도} 1^㎎/^㎖에서

초고압처리한추출물이 91.54%의활성을보여대조군으로처

리한같은농도의 BHA의 93.24%보다는낮은활성을나타내

었으나 일반열수 추출물의 80.41%보다는 높은값을 나타내

었다. 또한 1.0㎎/㎖의 농도로 처리한 일반 열수 추출물의

80.41% 활성의경우도 BHA의활성보다낮은값을나타내었

으나 약용 식물의 항산화 활성의 연구 (Jung et al., 2004)

에서 보고된 1.0^㎎/^{㎖의같은 농도에서녹차의} 64.6%, ^작약

의 57.1%, 생강의 48.3%보다 높은 활성을 나타내는 것으로 보아 고로쇠나무추출물이항산화 활성을가지고 있으며, 또

한일반열수추출물과비교하여약 10% 이상활성이증진된

Table 1. The extraction yields of Acer mono according to different extraction processes.

Sample Yields(%, w/w)*

WE 3.67 ± 1.12A**

HPE 5.42 ± 0.51B

*Data are expressed as Mean ± S.D. WE, water extract at 100℃, control; HPE, holding high pressure for 15 minutes at 40℃ with water solvent. **Different letters are significantly different at p< 0.05.

Fig. 1. cell line, HEL299 according to different extractionCytotoxicity of the extracts from Acer mono on normal processes.*Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown.Mean with difference letter (A, B) within same extraction condition are significantly different at p< 0.05 and mean with difference letter (a, b) within same concentration are significantly different at p<0.05.

WE: water extract at 100^℃, control; HPE: holding high pressure for 15 minutes at 40^℃ with water solvent).

Fig. 2. Scavenging effect of the extracts from Acer mono on DPPH. ^*Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A, B) within same extraction condition are significantly different at p< 0.05 and mean with difference letter (a, b) within same concentration are significantly different at p<0.05.

WE: water extract at 100^℃, control; HPE: holding high pressure for 15 minutes at 40^℃ with water solvent).

결과로미루어초고압공정을통해항산화활성이증진된것을 확인할수있었다.

4. SOD

SOD (Superoxide dismutase)는산패로인하여형성된세포 에해로운환원산소종을과산화수소로 전환시키는반응 (2O2−

+ 2H^+→ H²O²+ O²)^{를촉매하고}, catalase^는 SOD^{에의해생성}

된 H²O^{2를무해한물분자와 산소분자로 전환시키는역할을}

하는효소이다. 생체내활성산소종은산소에서유래된것들 로안정한분자상태인 triplet oxygen이자외선, 대사과정, 화 학반응을통하여 생성된다 (Trush et al., 1982). 이러한활성 산소에의한지질과산화결과생성되는지질과산화물을비롯 하여여러체내 과산화물도세포에대한산화적파괴로인한 각종장애를 야기하며 (Miquel et al., 1989), ^{활성산소가정}

상적으로제거되지않았을때에는잔존하고있는자유라디칼 에의해 산화적스트레스를받게됨으로써다른질병의원인 이되기도한다.

이러한항산화효소활성을살펴본결과는 Table 2에나타내 었다. 초고압추출물이 1.0㎎/㎖의농도에서 36.3%를나타내 었으며, 그외다른 농도에서는 BHA의활성보다 높은값을 나타내었다. ^{열수추출물의경우 모든농도에서} BHA^의활성

보다낮은값을나타내었다. 가장높은활성을나타냈던초고

압 추출물의 36.3%의 활성은, 본 연구자의 선행 연구결과

(Jeong et al., 2009) 에서 나타난고로쇠나무수피초고압추 출물의 SOD 유사활성인 38.6% 보다는낮은 수치이나, 고로 쇠목부의일반열수 추출물의 27.7% 보다 약 10% 이상증 진된결과로고로쇠목부의초고압공정에의해항산화활성 증진이이루어진 것으로사료된다. ^{이러한항산화 활성실험}

을통하여초고압추출공정에따른활성증진효과를확인할 수있었다.

5.

Fig. 3는내분비계통인인간 유방암세포 MCF-7에대한암

세포 생육억제활성 및 selectivity^{를나타낸 것이다}. ^모든추

출물에서농도의존적으로항암활성이증가하는것을확인할

수있었고, HPE의 암세포억제 활성이 WE에비해 높은것

으로나타났다. 특히, 1.0㎎/㎖의농도에서 62.45%의암세포 억제 활성과 2.90의 selectivity를나타내었고, 앞의 AGS보다 는 전체적으로낮은 활성을 나타내었고, 0.6㎎/㎖의 농도에 서가장 높은 selectivity를나타내었다. 이와 같은 결과는감 귤농축액에서배양한운지버섯배양추출물의항산화및항 암활성에 관한 연구 (Lee et al., 2003) ^{에서 보고된} MCF-7

에대한 암세포생육저해율실험에서 6.0㎎/㎖의처리농도 일 때의 82%와 비교하면 1.0㎎/㎖ 의 농도에서 보여준

62.45%의 MCF-7 생육저해활성이낮은세포독성에비해높 은암세포 생육저해활성을나타낸 것이라판단되며, 따라서 초고압공정에의한추출물의효과적인항암활성을기대할수 있을것이라사료된다.

Table 2. SOD-like activities of the extracts from Acer mono wood.

Sample Concentration(㎎/㎖)

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

BHA^† 5.3 ± 0.2Aa 14.7 ± 1.5Ba 20.6 ± 1.7Ca 33.6 ± 1.7Da 37.3 ± 1.2Ea*

WE^‡ 3.8 ± 0.5Ab 12.8 ± 1.3Bb 15.2 ± 0.3Cb 25.7 ± 0.7Db 27.7 ± 2.2Eb

HPE^§ 8.9 ± 2.2Ac 20.5 ± 1.2Bc 23.2 ± 1.3Cc 37.4 ± 1.7Dc 36.3 ± 0.4Da

*Means with different letters (A-E) within a row are significantly different at p< 0.05 and means with different letters (a-c) within a colunm are sgnificantly different at p< 0.05.

†BHA: butylated hydroxy anisole.

‡WE: water extract at 100^℃, control.

§ HPE: holding high pressure for 15 minutes at 40℃ with water solvent.

Fig. 3. Inhibition ratio of the growth of MCF-7 (bar chart, %) and selectivity (line chart) by adding the crude extracts of Acer mono wood. ^*Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A, B) within same extraction condition are significantly different at p< 0.05 and mean with difference letter (a, b) within same concentration are significantly different at p< 0.05. WE: water extract at 100^℃, control; HPE: holding high pressure for 15 minutes at 40^℃ with water solvent).

Table 3은인간위암세포인 AGS, 인간 폐암 세포인 A549

와 인간 간암 세포인 Hep3B에 대한 암세포 억제활성 및

selectivity를나타낸 것이다. AGS의경우 암세포 억제활성을 살펴보면모든추출조건에서 농도가증가할수록억제활성역 시 증가하는 경향을 보였는데 HPE^가 0.6^㎎/^{㎖의 농도에서} 61.35%의억제활성과 4.18의높은 selectivity를 보였다. 이는

추출 공정다변화를 통한홍경천의항암활성 증진효과 (Kim

et al., 2006) 에서보고된 1.0㎎/㎖의농도에서물 60℃에서 초음파병행한추출물의 76.70%보다낮은활성이나 0.6㎎/㎖ 의비교적낮은농도에서높은 selectivity를나타낸것으로서,

낮은세포독성에비해높은암세포억제활성을나타내는결 과로적은추출물의농도로높은암세포억제활성을나타낸다 고결론지을수있다. 세가지의암세포에서모두 농도의존 적으로암세포생육억제활성이증가하는것을 확인할수있 었고, 특히 A549에비해 AGS 및 Hep3B의억제 활성이 더 높은것을확인할수있다. 또한 Hep3B 억제활성의경우 0.6

㎎/㎖의농도에서앞의 MCF-7 암세포실험과비슷한결과를

나타낸 것을 알 수 있는데 고로쇠나무 목부 추출물의 경우

0.6^㎎/^{㎖의농도로 처리를하였을 때낮은세포독성과함께}

높은 selectivity를보이는결과를 얻을 수있었다. 그리고소 화기계통의암세포인 Hep3B 및 AGS와호흡기계통의암세포

인 A549의암세포억제활성을비교한결과 고로쇠나무목부

추출물의 경우 전반적으로 소화기계통의 암세포 억제활성에 더효과가높은것으로사료된다.

Fig. 4^{는 인간 정상 폐세포인} HEL299^{에대해 비교적 낮}

은 15.69%의세포 독성을나타내었던목부 초고압추출물을

0.6㎎/㎖의농도로 처리하였을때암세포생육 저해활성및

selectivity를나타낸것이다. 4종류의암세포에대한억제활성

을분석한결과, 소화기계통인 AGS와 Hep3B 암세포억제활 성이내분비계통인 MCF-7와호흡기계통인 A549의암세포억 제활성보다 높은 결과를 나타내었다. 이는 HEL299 정상 폐 세포의낮은세포독성결과와함께고로쇠나무목부추출물이 전반적으로소화기계통의암세포에효과적인암세포생육저 해활성및높은 selectivity를보임으로써소화기계통의 암세 포의억제활성에효과적인항암소재로의개발가능성을나타 낸결과라사료된다.

Table 3. Inhibition ratio of human lung adenocarcinoma cell and liver adenocarcinoma cell growth and their selectivity in adding sample.

Cont.

(㎎/㎖) Sample

Human cancer cell lines

AGS A549 Hep3B

Inhibition ratio (%) Selectivity Inhibition ratio (%) Selectivity Inhibition ratio (%) Selectivity 0.2 WE^† 16.24 ± 0.18Aa 1.30 ± 0.28Aa 99.57 ± 0.63Aa 0.77 ± 0.26Aa 11.25 ± 0.31Aa 0.90 ± 0.01Aa*

HPE^‡ 16.84 ± 0.03Ab 2.70 ± 0.18Ab 15.85 ± 0.21Ab 2.79 ± 0.17Ab 98.57 ± 0.26Ab 1.51 ± 0.07Ab 0.4 WE 25.34 ± 0.28Ba 1.62 ± 0.01Ba 18.32 ± 0.21Ba 1.17 ± 0.25Ba 24.15 ± 0.73Ba 1.54 ± 0.02Ba

HPE 36.48 ± 0.34Bb 2.66 ± 0.17Bb 29.35 ± 0.32Bb 3.90 ± 0.72Bb 50.24 ± 0.18Bb 6.63 ± 0.04Bb 0.6 WE 33.59 ± 0.41Ca 1.92 ± 0.30Ca 36.24 ± 0.63Ca 2.07 ± 0.11Ca 38.75 ± 0.48Ca 2.21 ± 0.04Ca HPE 61.35 ± 0.21Cb 4.18 ± 0.28Cb 53.17 ± 0.78Cb 3.62 ± 0.09Cb 63.32 ± 0.55Cb 2.94 ± 0.09Cb 0.8 WE 42.58 ± 0.38Da 1.98 ± 0.13Da 48.74 ± 0.16Da 2.54 ± 0.21Da 52.33 ± 0.84Da 2.72 ± 0.14Da HPE 68.42 ± 0.42Db 3.31 ± 0.28Db 58.43 ± 0.42Db 2.37 ± 0.52Db 68.75 ± 0.25 Db 2.79 ± 0.22Db 1.0 WE 57.63 ± 0.18Ea 2.44 ± 0.10Ea 56.89 ± 0.12Ea 2.64 ± 0.08Ea 63.87 ± 0.37Ea 2.96 ± 0.01Ea

HPE 72.39 ± 0.19Eb 3.36 ± 0.07Eb 67.52 ± 0.78Eb 2.53 ± 0.07Eb 79.42 ± 0.93Eb 2.97 ± 0.05Ea

*Means with different letters (A-E) within a row are significantly different at p< 0.05 and means with different letters (a-b) within a colunm are sgnificantly different at ^p< 0.05.

†WE: water extract at 100℃, control.

‡HPE: holding high pressure for 15 minutes at 40℃ with water solvent.

Fig. 4. Inhibition ratio of Acer mono wood (0.6^㎎/^㎖) on human cancer cell lines. *Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown. Mean with difference letter (A, B) within cell lines are significantly different at p

< 0.05 and mean with difference letter (a, b) within same concentration are significantly different at p< 0.05. WE:

water extract at 100^℃, control; HPE: holding high pressure for 15 minutes at 40^℃ with water solvent).