http://dx.doi.org/10.5369/JSST.2018.27.4.237 pISSN 1225-5475/eISSN 2093-7563
Concanavalin A 가 코팅 된 자성 입자를 이용한 미생물 농축 및 유전자 추출 칩 개발
권기록 · 곽호경 · 현경아 · 정효일+
Development of Microfluidic Chip for Enrichment and DNA Extraction of Bacteria Using Concanavalin A Coated Magnetic Particles
Kirok Kwon, Hogyeong Gwak, Kyung-A Hyun,and Hyo-Il Jung+
Abstract
The real-time enrichment and detection of pathogens are serious issues and rapidly evolving field of research because of the ability of these pathogens to cause infectious diseases. In general, bacterial detection is accomplished by conventional colony counting or by polymerase chain reaction (PCR) after DNA extraction. As colony counting requires considerable time to cultivate, PCR is an attractive method for rapid detection. A small number of pathogens can cause diseases. Hence, a pretreatment process, such as enrichment is essential for detecting bacteria in an actual environment. Thus, in this study, we developed a microfluidic chip capable of performing rapid enrichment of bacteria and the extraction of their genes. A lectin, i.e., Concanavalin A (ConA), which shows binding affinity to the surface of most bacteria, was coated on the surface of magnetic particles to nonspecifically capture bacteria. It was subsequently con- centrated through magnetic forces in a microfluidic channel. To lyse the captured bacteria, magnetic particles were irradiated by a wave- length of 532nm. The photo-thermal effect on the particles was sufficient for extracting DNA, which was consequently utilized for the identification of bacteria. Our device will help monitor the existence of bacteria in various environmental situations such as water, air, and soil.
Keywords: Gas sensors, Oxide semiconductors, SnO
2, Propane gas
1. 서 론
공기 또는 물과 같은 실제 환경 속에 존재하는 박테리아 또 는 바이러스와 같은 병원균들 중 일부는 강한 전염성을 가지며 각종 경로를 통해 체내로 흡수되어 심각한 질병을 일으킨다[1].
이렇게 체내로 흡수된 병원균은 2차적으로 혈액이나, 체액을 통 해 다른 사람에게 쉽게 전파되어 대규모 전염병을 일으킬 수 있 어 전염성 병원균의 검출은 사회적으로 큰 이슈가 된다. 이로 인해 실제 환경 속에 존재하는 병원균을 조기에 검출하여 대규 모 전염병을 예방하기 위한 실시간 검출 장치 개발이 다양한 방
법을 통해 연구되고 있다. 특히, 이러한 병원균은 극미량으로도 전염성 질병을 일으킬 수 있으며 변이도 쉽게 일어나기 때문에 다양한 접근 방법으로 연구가 필요하다[2-4].
일반적으로 연구되고 있는 병원균 검출 기술로써 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 이용한 분자 진단과 항원-항체 반응을 이용한 면역 진단 방법이 있다. 하지만, 실제 환경 시료 의 경우 검출하고자 하는 미생물 이외에도 먼지, 음식물 찌꺼기 등과 같은 불순물이 많이 섞여있는 상태이기 때문에 검출의 민 감도가 떨어진다. 따라서 이와 같은 검출 기술의 민감도를 증가 시켜 극미량의 병원균도 검출해내기 위해서는 필수적으로 시료 의 순도를 높일 수 있는 농축 기술의 연구가 필수적이다. 또한, 병원균의 세포막을 용해시켜 내부의 유전자(DNA, RNA 등)를 추출하여 정제하는 기술이 필요하다.
특히, 민감도가 높은 기술인 PCR의 경우, 검출하고자 하는 특 정 병원균을 항원-항체 반응을 통해 농축 한 후에 이어서 그에 적합한 프라이머(primer)를 통한 유전자 증폭 및 검출 과정이 필 요하기 때문에 각 병원균의 항체와 프라이머가 필요하고 따라 서 새로운 병원균을 농축하기 위한 대처가 불가능하다. 그리고 그 과정 또한, 수 회 반복되는 화학 시료 처리, 원심 분리와 세 척 과정 등이 포함되며 농축과 추출의 전처리 시간이 매우 많
연세대학교 기계공학부 (School of Mechanical Engineering, YonseiUniversity, 50 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul, 03722, Korea)
SoEECS 301-1014, Seoul National University, 599 Gwanangno, Gwanak-gu, Seoul 151-744, Korea
+Corresponding author: [email protected]
(Received: Jun. 27, 2018, Revised: Jul. 22, 2018, Accepted: Jul. 24, 2018)
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이 걸리고 전문가와 실험실 장비가 필요하다. 따라서, 이러한 전 처리 기술의 경우 신속한 병원균 검출이 필요한 현장에서의 활 용도가 떨어진다.
따라서, 본 연구에서는 대부분의 병원균의 표면과 결합력을 가 지는 Concanavalin A (ConA) 라는 렉틴 단백질을 자성입자의 표면에 코팅하여 실제 환경 속의 병원균을 비특이적으로 포획하 고 자력를 통해 고농도로 농축하여 532nm 레이저 조사를 통한 광열 효과로 신속하게 유전자를 추출 할 수 있는 미세 유체칩을 개발하였다. 렉틴(lectin) 단백질 중 하나인 ConA는 잭콩(Jack Bean) 에서 추출되며 세포 표면의 당, 당지질, 당단백질 등과 결 합하는 특성을 가지고 있는데 이러한 특성을 이용하여 박테리아 또는 바이러스를 비특이적으로 포획하는데 사용될 수 있다[5].
광열 효과란 금속 입자가 특정 파장의 전자기파에서 전자를 흡수하여 열 에너지로 전환한 뒤 방출하는 현상을 말한다[6]. 따 라서 자성 입자에 532nm 파장의 레이저를 조사하면 전자를 흡 수하여 열 에너지의 형태로 방출하여 주변의 온도를 급격하게 상승시켜 세포막을 열로써 용해할 수 있게 하였다.
먼저, 자성 입자에 ConA를 코팅한 후 병원균과 같이 처리하 여 자성 입자와 병원균의 결합을 유도하였다. 그 후 병원균이 결합된 자성 입자를 자석 어레이(magnet array)가 포함된 미세 유체칩(micro-MACS chip)에 주입하여 미세 유체 채널 속에 고 농도로 농축을 진행하였다[7]. 이어서 농축된 병원균을 용해 챔 버(dissolving chamber)와 자석이 포함된 두 번째 미세 유체칩 에 주입한 후 532nm 레이저를 챔버에 조사하여 자성 입자의 광 열 효과를 통해 발생하는 열로써 세포막을 용해하여 유전자를 추출하였다. (Fig 1.)
따라서, 본 연구에서는 타겟 병원균을 설정하여 같은 농도의 미생물을 각각 미세 유체칩을 이용한 방법과 상용화된 전처리
키트를 이용한 방법으로 유전자를 추출한 뒤 real-time PCR을 통해 개발한 미세 유체칩의 성능 평가를 진행하였다.
2. 연구 방법
2.1 미세유체칩의 제작 방법 및 설계
투명 아크릴 판의 레이저 가공을 통해 칩의 형태를 패터닝하 여 분리하고 양면 테이프를 통해 아크릴 판의 상, 하단에 투명 필름을 접착한 후 주입구(inlet)와 배출구(outlet)을 뚫은 후 튜브 를 연결하여 채널을 형성하고, 완성된 미세 유체칩의 상, 하단 에 각각 30개의 5 mm × 5 mm의 정사각형 모양의 네오디뮴 (neodyminum) 자석으로 이루어진 탈착식의 자석 어레이를 조 립하여 완성하였다. 이는 기존 photo lithography 또는 soft lithography와 달리 대량 생산에 용이하여 환경 시료의 사용에 적합하다. 또한, 본 연구에서 개발한 전처리용 미세 유체칩은 농 축용 칩과 2차 농축 및 용해용 칩의 2단계로 분리되어 이루어져 있다.
농축용 칩은 가로가 63.5 mm, 세로가 18 mm 인 두께 1.2 mm 의 아크릴 판에 패터닝되었고 가로가 40 mm, 세로가 5 mm 인 농축용 챔버 두 개와 채널로 구성되도록 설계하였으며 2차 농 축 및 용해용 칩은 가로가 40 mm, 세로가 15 mm인 5 mm 두 께의 아크릴 판에 패터닝되었고 가로 5 mm, 세로 5 mm 의 챔 버와 채널로 설계하였다.
2.2 자성 입자 표면에 ConA를 코팅하기 위한 방법
자성 입자 표면에 ConA를 결합시키기 위해 carboxyl group 이 발현된 자성 입자에 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)/NHS(N-Hydroxysuccinimide) 반응을 통해 자성 입 자의 표면에 EDC crosslinker를 부착시킨 후에 ConA와의 처리 를 통해 ConA를 자성 입자에 코팅하였다.
먼저, pH5인 PBS(Phosphate buffer saline)에 400 mM의 EDC 와 100 mM의 NHS 를 첨가하고, 특정 농도의 자성 입자 용액 을 첨가한 후 자성 입자가 중력에 의해 가라앉지 않을 정도로 가볍게 흔들며 2시간 동안 처리한다. 그 후 10 mg/mL 농도의 ConA를 첨가하고 4°C에서 overnight 처리하여 ConA가 코팅된 자성 입자를 준비하였다. (Fig 2.)
Fig. 1. Schematic illustrations of pretreatment of the bacteria. The microfluidic chip for enrichment contains 2 enrichment chambers and magnet arrays which cover top and bottom of the microchannels. The second chip for photothermal lysis has a small chamber for secondary enrichment and laser irra- diation and a magnet which covers the bottom side of lysis chamber.
Fig. 2. EDC/NHS crosslingking and ConA conjugation. Carboxyl-
ated magnetic particles are mixed with EDC, NHS and ConA
solution of PBS. (pH5)
3. 결과 및 고찰
3.1 전처리용 미세 유체칩의 설계
본 연구에서 개발한 미세 유체칩은 자기력을 통해 자성입자 를 포획할 수 있는 반복되는 챔버 구조로 이루어져 있다. 미세 유체칩을 통해 미생물의 농축을 진행 할 때, 미세 유체칩 내의 농축 챔버의 내부 부피에 따라 최종 농축 농도가 결정 되기 때 문에 농축 효율을 극대화 시키기 위해서는 내부 부피를 최소화 하면서 시료의 손실을 방지하는 설계가 필요하다.
따라서, 챔버의 개수(stage)를 하나씩 추가해가며 농축 효율 비교 실험을 진행하였다. (Fig 3.) 각각 다른 개수의 챔버로 제 작된 미세 유체칩에 동일한 농도 (10
8개/mL)의 자성 입자 용액 을 10mL주입한 후 각각의 배출구에서 얻은 시료를 UV-vis spectrophotometer 를 이용하여 흡광도를 측정하여 피크 값을 이 용해 농축 효율을 비교하였다. (Fig 4.) 아래의 스펙트럼에서 볼 수 있듯이, 농축 챔버가 하나인 stage 1 칩의 경우에 흡광도가 다른 칩의 약 세 배 이상 높은 것으로 보아stage 1칩의 배출구 로 자성 입자 및 포획된 미생물의 손실이 큰 것으로 나타났다.
따라서, 배출구로의 손실을 최소화하고 처리량을 증가시킬 수 있도록 stage 2의 칩을 사용하여 농축을 진행하는 것이 가장 효 율적이라고 판단되었다.
또한, 미세 유체칩으로 주입되는 유속에 따른 자성 입자의 캡 쳐 효율 또한 비교하였다. 총 10 mL의 자성 입자 용액(10
8개/
mL) 을 1~5 mL/min의 유속으로 주입한 후, 흡광도를 통해 배출 구에서의 자성 입자의 농도를 계산하여 비교하였다. Fig. 5에서 볼 수 있듯이, 1 mL/min 의 유속으로 주입하였을 때 손실 없이 약 100%의 캡쳐 효율을 나타내었고 유속이 증가할수록 자성 입 자의 미세유체 채널 내 캡쳐 효율이 감소하였다. 또한, 유속이 증가할수록 미세유체칩 내부의 압력이 증가하여 미세유체칩에 서 누출이 발생하여 칩의 안정성이 감소하였다. 그리고, 1 mL/
min 의 유속으로 주입하였을 때, 배출구에서 주입구의 농도에 비해 10
6fold 이상 농도가 감소한 것을 알 수 있다. 따라서, 2 개의 챔버를 가지는 미세유체칩에서 1 mL/min 의 주입구 유속 으로 본 연구의 성능 평가를 진행하였다.
PCR에 필요한 유전자는 극소량이므로 최대한 작은 부피로 농 축을 진행하는 것이 높은 농축효율과 검출 민감도에서 유리하 다. 1차 농축용 미세 유체칩에서는 높은 처리량과 빠른 유속을 위하여 2개 챔버 부피인 약 540 µL로 농축을 했다면, 2차 농축 및 용해용 칩에서 상대적으로 낮은 유속인200 µL/min 를 통해 약 100 µL의 부피로 농축하여 농축 효율을 약 5배 상승시키며 레이저 조사에 적합하게 설계하였다. (Fig 6.)
Fig. 4. UV-vis spectrum depending on the number of the chamber. In the case of a chip with an enrichment chamber, the absor- bance appears to be about three times higher than other chips.
Fig. 3. Photographic images of micro-MACS chips which have dif- ferent number of chambers.
Fig. 5. Capturing efficiencies depending on the flow rates. The cap- turing efficiency decrease as the flow rated increase.
Fig. 6. Photographic image of secondary enrichment and lysis chip.
The magnetic particles with bacteria are enriched in the
chamber and subsequently DNAs can be extracted due to the
photothermal effects.
3.2 Real-time PCR을 이용한 미세 유체칩의 전처리 성능 평가
위에서 설계한 미세유체칩의 성능을 검증하기 위해 총 4종의 미생물인 E. coli (Gram negative), S. enterica (Gram negative), S.
aureus (Gram positive) 와 B. cereus (Gram positive)를 사용하여 연속적인 농축 및 용해 실험을 진행하였다.
먼저, 각각의 미생물의 농도가 1,000 CFU/mL인 시료 20mL 를 농축용 미세유체칩에 1 mL/min 의 유속으로 주입하여 농축 한 후 자석 어레이를 분리하여 air flow를 주어 배출구로 배출 한 뒤 2차 농축 및 용해용 칩으로 200 µL/min 의 유속으로 주 입하였다. 그 후 500 mW 파워의 532 nm 파장 레이저를 15분 간 용해 챔버에 조사하여 자성 입자의 광열 효과를 유도하여 발 생되는 열을 통해 자성 입자에 결합되어 있는 미생물을 신속하 게 용해하여 배출구에서 유전자를 얻을 수 있다. 이어서, real- time PCR 을 통해 정량 분석을 진행하였다.
또한, 본 연구에서 개발한 미세유체칩을 평가하기 위해 총 20,000 CFU 가 들어간 미생물 시료를 상용화된 키트 (QIAamp DNA mini, QIAGEN)를 이용하여 유전자를 추출한 후 real- time PCR 결과를 유전자 증폭 곡선과 형광 임계선의 교차점 으로 정의되는 Ct (Threshold cycle)값을 통해 비교하였다. 이 는, 배경의 형광 세기보다 더 높은 형광 신호를 가지는 사이 클을 의미하며 초기에 검출 가능한 최소한의 양의 유전자가 증폭되었음을 의미하는 값으로 real-time PCR에서 초기 시료 의 정량 분석에 주로 사용된다. 먼저, E. coli의 경우, Fig 7.
(a) 에서 볼 수 있듯이, 키트를 사용하였을 때 평균 Ct값이 29.87, 미세유체칩을 이용하였을 때는 평균 Ct값이 28.68로 약 1.2 사이클 정도 미세유체칩의 경우가 우수하며, S. aureus 의 경우 Fig 7. (b)에서 볼 수 있듯이, 키트를 사용하였을 때 평 균 Ct값이 34.89, 미세 유체칩을 통하였을 때는 평균 Ct값이 33.38 로 약 1.5 사이클 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 마찬 가지로, S. enterica (Fig 7. (c))와 B. cereus (Fig 7. (d))의 경 우 또한 평균 Ct 값 차이가 각각 2.82 와 3.47 로써 더 우수 한 결과를 보였다.
이는 약 2~3시간이 소요되며 번거로운 반복적인 과정이 필 요한 키트 방식보다 훨씬 짧은 시간동안 효율적으로 유전자를 추출 할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, S. aureus 나 B. cereus 와 같은 Gram positive 균 또한 문제없이 유전자 추출이 가능 함을 알 수 있었으며 특히, Gram positive 균의 경우에는 키 트 방식에서 Gram negative 균의 경우와는 달리 추가적으로 lysozyme 을 추가하여 세포막을 녹이는 과정이 더 필요하여 시 간이 더 소요되는 점에도 불구하고 Ct 값 차이로 볼 때 성능 차이가 더 심한 것을 알 수 있다. 광열 효과로 인해 세포 표 면의 자성 입자 주위에서 강한 열이 급속도로 발생하게 되어 두꺼운 세포막을 파괴하기에 더 뛰어난 성능을 보이는 것으로
예상된다. Fig. 7. Real-time PCR results of (a) E. coli, (b) S. aureus, (c) S.
enterica and (d) B. cereus
4. 결 론
본 연구에서는 간단하고 신속하게 저농도의 미생물을 고농도 로 농축하여 유전자를 추출한 뒤 검출할 수 있도록 하는 전처 리용 미세유체칩을 개발하여 성능 평가를 진행하였다. 개발한 미세 유체칩은 아크릴과 투명 필름을 기반으로 간단하고 저렴 하게 제작할 수 있으며, PDMS (polydimethylsiloxane) 미세유체 칩에 비해 높은 유속을 견딜 수 있다. 또한, 본 연구에서 제작 된 자성 입자 기반의 미세 유체칩은 ConA가 코팅된 자성 입자 를 미생물과 반응시켜 캡쳐 한 후 자기력을 통해 미세 유체 채 널 내에 고농도로 농축 시킬 수 있다. 또한, 자성입자의 광열 효 과를 통해 포획한 미생물을 신속하게 용해하여 유전자를 추출 하여 PCR을 통한 검출에 이용할 수 있게 하였다. 미세유체칩의 성능을 검증하기 위해 4종의 미생물을 타겟으로 하여 동일한 농 도의 미생물 시료를 상용화된 미생물 용해용 키트와 비교하였 으며, 더 짧은 시간내에 더 많은 유전자를 추출 할 수 있음을 확인하였다.
감사의 글
본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술기 획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 연구되 었음 (316073-03-3-HD020)
REFERENCES
