H elicobacter p y lori 수용성 단백질로 활성화된 호중구에 대한 Rebamipide의 효과

대한소화기학회지 2002;39:13 - 21

서 론

Helicobacter py lori는 위점막을 파고들지 않는 비침습성 세균으로 H. pylori 감염의 위점막 반응은 호중구, 단핵구

및 림프구 등의 염증세포들이 점막으로 침윤하는 것이 특 징적인데, 특히 호중구의 침윤이 뚜렷하다.¹ 조직에 침윤 된 호중구 수가 증가될수록 반응성 산소대사물 및 단백분 해효소들의 분비량이 증가되어 조직 손상에 기인한 소화 성 궤양이 유발될 수 있다 . 최근 저자들은 H. pylori 배양 상청액에 의하여 활성화된 호중구에서 interleukin-8 (IL-8)의 발현 증가를 확인하였고,² H. py lori 표면의 수용성 단백질 을 투여하였을 때 호중구에서 growth-related oncogenes 발 현이 상향 조절되었으며, 실제로 위점막에서 호중구가 활 성화되었음을 보고한 바 있다.³ 또한, 저자들은 H. pylori

H e licobac te r p y lori 수용성 단백질로 활성화된 호중구에 대한 Rebamipide의 효과

서울대학교 의과대학 내과학교실 , 간연구소 , 한양대학교 의과대학 미생물학교실 및 의과학 연구소 *

김주성・김정목 *・김병관・김상균・김지원・김찬규・정현채・송인성

Eff e c t o f R e b a m ip id e o n th e N eu t ro p h i ls Ac t iv a te d b y H e l ic o ba c te r

J o o S u n g K i m , M .D ., J u n g M o g g K i m , M .D . *, B y e o n g G w a n K i m , M .D ., S a n g Gy u n K i m , M .D ., J i Wo n K i m , M .D ., C h a n G y o o K i m , M .D ., H y u n C h a e J u n g , M .D ., a n d In S u n g S o n g , M .D .

Dep artment of Internal Medicine and Liver Research Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul;

Dep artment of Microbiology and Institute of Biomedical Science *, Hanyang University College of Medicine, Seoul, Korea

Background/Aims: Helicobacter pylori (H. pylori) infection induces persistent neutrophil infiltration in gastric mucosa.

The expression of cyclooxygenase (COX)-2 and inhibition of apoptosis in the neutrophils could contribute to the pathogenesis of H. pylori infection. Rebamipide, a mucosal protective and ulcer-healing drug, has been known to inhibit neutrophil activation. The aim of this study was to evaluate the effect of rebamipide on the neutrophils activated by Helicobacter pylori water-soluble proteins. Methods: After neutrophils were stimulated with H. pylori water extract (HPWE) or pretreated with rebamipide, the expression of COX-2 mRNA and protein was assessed by quantitative RT-PCR and Western blotting, respectively. Prostaglandin (PG) E² synthesis was determined by radioimmunoassay.

Neutrophil apoptosis was evaluated by cytosolic oligonucleosome-bound DNA ELISA and caspase-3 activity was measured by the detection of p-nitroanilide after cleavage from labeled substrate. Results: Stimulation with HPWE upregulated COX-2 expression and PGE² secretion, and inhibited neutrophil apoptosis. Rebamipide suppressed PGE² secretion from neutrophils in a dose-dependent manner. However, rebamipide did not affect neutrophil apoptosis and caspase-3 activity. Conclusions: Rebamipide effectively suppresses PGE2 secretion from neutrophils activated by H.

pylori water-soluble proteins. This is another possible mechanism of gastric mucosal protection by rebamipide. (Korean

J Gastroenterol 2002;39 :13-21)

Key Words: Helicobacter pylori, Neutrophil, Rebamipide, Cyclooxgenase-2, Apoptosis

접수: 2001년 7월 20일, 승인 : 2001년 10월 11일 연락처 :정현채, 110-744, 서울특별시 종로구 연건동 28

서울대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (02) 740-8112, Fax: (02) 743-6701 E-mail: hyunchae @plaza.snu.ac.kr

※이 논문은 2001년도 서울대학교병원 일반연구비(04-2001-011) 및 일본오츠카제약회사 MAGIC project 연구비에 의하여 지원되었음.

대한소화기학회지 :제39권 제 1호, 2002

표면의 수용성 단백질에 의하여 호중구 세포사멸(apoptosis) 이 억제되어 위점막 염증반응이 지속될 수 있음을 제시하 였고,⁴ 그 기전으로 apoptosis 신호전달체계에 중요한 Fas, Fas ligand 및 tumor necrosis factor-receptor 1이라는 사망인 자(death factor)의 발현이 억제되었고,⁴ 세포사멸에 결정적 인 영향을 미치게 되는 caspase-3 활성도가 억제되었으며, Bcl-2 family 중 Bcl-XL 발현이 증가되었음을 발표하였다 .⁵

호중구 활성화에 기인한 위점막 조직 손상에 중요한 역할을 담당할 것으로 예측되는 물질 중 arachidonic acid metabolite가 있다. 이 metabolite는 총체적으로 eicosanoid라고 불리는데, hydroxyeicosatetraenoic acid (HETEs), prostaglandin (PG), thromboxane과 leukotriene 등이 포함되며, 이들은 세포 의 부착 뿐만 아니라 세포의 성장과 분화를 조절함과 동시 에 염증반응에도 관여한다. 그런데 PG와 각종 eicosanoid를 생성하는 중요한 효소는 prostaglandin H synthase (PGHS)라 고 불리는 cyclooxygenase (COX)이다. 이 효소는 정상 세포 에서 일정하게 생성되는 COX-1과 염증성 자극에 의해 유도 되는 COX-2로 나뉘어진다. 특히 COX-2 유전자는 cytokine 의 자극을 받은 염증세포 또는 대식세포 등에서 활성화되 어 많은 양의 PG을 생성한다. 그 결과 세포의 증식을 변화 시킬 뿐만 아니라 염증반응을 촉진시키는 역할을 한다.⁶ 즉, 이와같은 COX-2는 위점막 병변을 유도할 뿐만 아니라, 실 험 동물에서는 점막 손상 치유 과정을 억제하는 역할도 한 다.⁷ 그런데 H. pylori에 감염된 위점막 조직에는 많은 염증 세포가 유입되고 있기 때문에 이와 같은 COX-2 발현이 염 증반응에 상당히 깊게 관련되어 있을 것으로 추정된다.

Rebamipide는 2-(4-chlorobenzoylamino)-3-[2(1H)-quinolinone- 4-yl] propionic acid로 위점막에서의 내인성 prostaglandin 생성을 촉진하며, oxygen free radical을 억제하는 것으로 알려졌다 .^{8 ,9} 또한, Rebamipide는 호중구 활성화를 억제하여 indomethacin으로 유발된 위점막 병변을 치유하고, lipid peroxidation을 억제하는 것으로 알려졌다.¹⁰ 그러나 H.

py lori에 의해 활성화된 호중구에서의 COX-2 발현 및 세 포사멸 조절에 대한 연구는 발표된 바 없다. 이에 저자들 은 H. pylori에 의해 활성화된 호중구에서의 COX-2 발현 및 생성된 PGE² 양을 측정하고, rebamipide가 이를 조절하는지 확인하고자 한다. 또한, rebamipide가 호중구 세포사멸에 영 향을 미치는지를 평가하여 위점막 염증반응 조절에 새로운 기전을 제시하고자 한다.

대상 및 방법

1 . H. py lo ri 수용성 추출물 (wa t e r e x t ra c t ) 제조 1) H . py lo ri 균주

본 연구에 사용된 H. pylori 균주(HP99)는 서울대학교병

원에 내원 한 십 이지 장 궤양 환자 의 위 점막 에 서 분 리한 후 병 독유전자 및 공포성 세포독소 생성을 확인하였

다 .^{2 - 5} HP99은 cagA⁺/ cytotoxin⁺이었다 .

2 ) H. py lo ri 수용성 추출물 제조

HP99를 계대배양 횟수가 10회를 넘지 않는 범위 내 에서 대량으로 배양하였다. H. pylori 수용성 추출물은 이 전의 보고와 동일하게 제조하였다 .^{4 ,5} 배양된 균을 증류수 에 1× 10⁹/mL의 농도로 부유시키고 부유액을 실온에 10분 동안 둔 다음 20초 동안 vortexing하였다 . 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 상청액을 ultrafiltration membrane (Diaflo ultrafilter, Amicon, Inc., Beverly, MA, USA)을 이용 하여 10,000 Da 이하의 물질을 제거함과 동시에 농축한 다 음 -70℃에 보관하였다. 사용 직전에 18,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상청액을 0.2 µm 필터에 통과시켰다.

3 ) H. py lo ri 수용성 추출물에서의 성분 확인

H. pylori 수용성 추출물에서의 총 단백량 및 urease 활성 도를 이전의 보고와 동일하게 측정하였다.^{4 ,5} 총 단백량은 3.3 mg/mL이었고, urease 활성도는 9 1 U/mL이었으며 urease 특이 활성도는 27.6 U/mg of protein/mL이었다 . H. pylori 수용성 추출물에서 lipopolysaccharide (LPS) 함유량을 확 인하기 위하여 Limulus amebocyte lysate assay (Pyrotell test, Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA, USA)를 이용하 여 endotoxin 활성도를 측정하였다. Lyophilized standard endotoxin이 들어있는 tube에 H. py lori 수용성 추출물 200 µL를 넣고 잘 섞은 다음 37℃에서 1시간 동안 둔 후 gel clot이 일어나는지를 확인하였다 . Endotoxin 활성도는 gel clot이 일어나는 최소량의 U.S. standard endotoxin unit (EU) 로 정의하였다. 본 연구에 사용되었던 H. pylori 수용성 추 출물에서의 endotoxin 활성도는 0.125 EU/mL이었다.

2 . 인체 호중구의 분리 및 배양 1) 호중구의 분리

건강한 공혈자의 말초혈액에서 분리된 buffy coat에 2%

dextran 용액을 첨가하여 30분 동안 실온에 두었다. 그 상 청액에 1/4 volume의 Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 1,450 rpm으로 30분 동안 원심분리한 후 침전된 pellet을 얻었다. 남아있는 적혈구는 0.2% NaCl로 처 리하여 완전히 제거하였고, 순수분리된 호중구를 phosphate- buffered saline (PBS)으로 세척하여 실험에 사용하였다.

2 ) 생존도 및 순도 확인

Hemacytometer로 세포 수를 측정한 후 trypan blue exclusion test로 세포의 생존도를 확인하였다 . 세포 형태를 14

김주성 외 7인. 활성화된 호중구에 대한 Rebamipide의 효과

현미경으로 확인하고 단핵구에 특이적인 fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-CD 14 antibody (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용한 flow cytometry (Becton Dickinson)로 단핵구 오염 정도를 측정함으로써 순 도를 확인하였다. 호중구의 생존도 및 순도가 각각 95%를 넘는 경우에 다음 실험으로 진행하였다.

3 ) 호중구의 배양

RPMI- 1640 media (Sigma)에 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM L-glutamine 및 10 % fetal bovine serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)을 첨가하여 호중구를 배양 하였으며, 배양용기는 호중구의 활성화를 방지하기 위하 여 polypropylene tube를 사용하였다.

3 . 호중구에 H . py lo ri 수용성 추출물 투여

호중구 세포 수가 5× 10⁶/mL이 되도록 배양액에 부유시 킨 후 배양액만 넣은 대조군과 H. pylori 수용성 추출물을 첨가한 군을 각각 배양시켰다. H. pylori 수용성 추출물을 연속 희석하여 호중구 세포사멸을 cytosolic oligonucle- osome-bound DNA ELISA 방법으로 측정하였을 때, 호중 구 세포사멸을 유의하게 억제하는 최소 농도는 50 µL/mL 이었다. 그러므로 본 연구에서는 H. pylori 수용성 추출물 을 50 µL/mL 농도로 투여하였다.

4 . T ra n s w e ll을 이용한 A G S 위상피세포주와 호중구의 동시배양

H. py lori로 감염된 위점막 생체와 유사한 모델을 확립 하기 위하여 위상피세포주와 호중구를 Transwell로 분리한 상태로 동시배양하였다 . AGS 세포주(ATCC CRL 1739)를 0.4 µm pore를 가진 polycarbonate Transwell (Costar, Cam- bridge, MA, USA)에 seeding 후 confluent monolayer 될 때

까지 배양한 다음 live H. pylori를 가하였다(AGS 세포 수 :H. pylori 수 =1:250). 이를 호중구 및 RPMI-1640 media 가 들어있는 6-well plate 위에 올려놓고 동시배양하였다 (Fig. 1).

5 . C O X- 2 정량적 역전사 P C R 1) 표준 합성 RNA 제작

인체 COX-2 mRNA의 발현 분자 수를 측정하기 위한 표준 합성 RNA는 mouse immunoglobulin α constant region으로부터 얻은 cDNA clone을 이용하여 합성하였 다 .^{1 1} 즉, cDNA clone을 PuvII로 처리하여 얻은 660-bp fragment를 대상으로 COX-2 primer의 sequence를 지닌 primer를 이용하여 1차 PCR을 시행한 후, poly(A) tail을 형 성할 수 있는 oligo(dT)15와 T7 RNA polymerase의 promoter 를 지닌 primer로 2차 PCR을 시행하여 cDNA를 얻었다.

그 후, in vitro transcription을 시행한 뒤, RNase-free DNase 로 반응액 내에 존재하는 cDNA를 제거한 다음 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform을 이용하여 poly(A) tail을 지닌 표준 RNA를 합성하였다.

2 ) 역전사

추출한 1 µg의 total RNA를 시험관에 넣고 37℃에서 60 분 동안 반응시켜 cDNA를 만들었다. 이 때 사용한 buffer는 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 5 mM MgCl², dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 1 mM, 20 unit의 RNasin ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI, USA), 0.1 µg의 oligo(dT)¹⁵와 50 unit의 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Gibco Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)로 구성되었다. 역전사 후 95℃에 서 10분간 역전사효소를 비활성화시킨 뒤, 얼음에 담궈 냉각시켰다 .

3 ) c DNA P C R

상기 방법으로 만든 cDNA 일정량을 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 그리고 25 pmol씩의 sense primer와 antisense primer가 포함된 50 µL의 buffer에서 PCR로 증폭 시켰다. 반응액을 95℃에서 5분간 가열한 후 85℃에서 7 분 가량 유지시키면서 각 시험관에 2.5 unit의 Taq DNA 중합효소 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 첨가하였다. 증 폭 프로그램은 95℃에서 45초간 denaturation시키고, 60℃에 서 1분 40초 동안 annealing과 extension이 일어나도록 하였으 며, cycle의 총 시행 횟수는 33회로 하였다. PCR product는 2%

NuSieve agarose gel로 전기영동한 뒤 ethidium bromide염색으로 확인하였다.

Fig. 1. Illustration of co-culture of neutrophils and gastric epithelial cells infected with live H. pylori using a transwell insert.

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The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 39. No. 1. 2002

4 ) 유전자 정량

이전의 보고와 동일하게 표준 합성 RNA를 5배로 연속 희석시킨 뒤 동일한 시험관 내에 호중구에서 추출한 200 ng의 RNA를 첨가하여 RT-PCR을 수행하는 방법으로 발현된 COX-2 유전자를 정량하였다.^{1 1- 13}

6 . C O X- 1 , - 2 W e s t e r n b lo t t in g

호중구에서 COX-1 및 COX-2 단백질 생성을 Western blotting으로 확인하였다 . 1× 10⁸ 세포에 CHAPS lysis buffer (20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM orthovanadate, 500 µM molybdate, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidine 및 각각 20 µg/mL 농도의 antipain, leupeptin, pepstatin, pH 7.4)를 가한 후 얼음에 15분 동안 둔 다음, 4℃에서 15,000 × g로 15분 동안 원심분리하여 그 상청액을 -70℃에 보관하였다. Cell lysate 20 µg을 2X SDS sample buffer에 1:1로 혼합하여 5분 동안 가열한 후 SDS polyacrylamide gel에 전기영동한 다음 nitrocellulose membrane (Hybond ECL, Amersham, Bucking- hamshire, England)에 transfer하였다. 10% bovine serum albumin으로 밤새 blocking시킨 후 anti-COX-1 antibody (Oxford Biomedical Res., Oxford, MI, USA) 및 anti-COX-2 antibody (Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA) 1:1000으로 희석한 1차항체를 2시간 동안 가한 다음 세척하 였다. Horseradish peroxidase에 결합된 2차항체를 1시간 동안 가한 후 enhanced chemiluminescence system (ECL, Amersham, Buckinghamshire, England)을 이용하여 blot을 확인하였다.

7 . P G E2 ra d io im m u n o a s s a y

호중구에서 생성되는 PGE2 양을 측정하기 위하여 radioimmunoassay를 이용하였다 . 즉, 일정량의 [³H]이 표지 된 PGE2를 배양상청액에 첨가한 뒤, anti-PGE2 monoclonal antibody를 가하였다 . 그 뒤, 결합되지 않은 [³H]-labelled PGE2를 magnetic dextran-coated charcoal에 흡착시킨 다음, 원심분리 방법으로 제거한 뒤, anti-PGE2 monoclonal antibody 와 결합된 [³H]-labelled PGE2만을 liquid scintillation counter 로 측정하여 배양상청액에 포함된 PGE2의 양을 구하였다 .

8 . Re b a m ip id e 투여 후 P G E² ra d io im m u n o a s s a y Rebamipide를 투여한 후 호중구에서의 PGE² 생성을 radioimmunoassay법으로 확인하였다.

9 . Re b a m ip id e 투여 후 c yt o s o lic o lig o n u c le o s o me - b o u n d DNA E LIS A 및 c a s p a s e - 3 활성도 측정

1) Cyt o s o lic o ligo n uc le os o me - b o und DNA ELIS A

1× 10⁵ 호중구에 lysis buffer 0.2 mL을 가한 후 실온에 30분동안 둔 다음, 20,000×g로 10분 동안 원심분리한 후 상청액을 분리하여 ELISA (Cell Death Detection ELISA^{P L U S} Kit, Boehringer Mannheim GmbH, Germany)를 시행하였다. 대 상 검체 20 µL에 anti-histone, anti-DNA-POD 및 incubation buffer로 구성된 immunoreagent 80 µL를 가한 후 실온에 2 시간 동안 두었다. Incubation buffer 250 µL로 3회 세척한 후 substrate solution 100 µL를 가하고 20분 동안 둔 후 405 nm 파장(reference filter 492 nm)하에서 ELISA 판독기로 광 학지수를 측정하였다 .⁴

2 ) Ca s pa s e - 3 활성도 측정

Caspase 활성화 최종 단계인 caspase-3 활성도는 p-nitroanilide (pNA)로 표지된 DEVD의 분해 정도로 측정하 였다. 즉, 호중구 lysate에 DEVD-pNA를 가한 뒤, lysate에 존 재하는 caspase-3에 의해 DEVD-pNA를 분해할 때 유리되는 pNA를 ELISA reader로 측정하여 대조군과 비교한 상대적 수치로 caspase-3의 활성도를 colorimetric assay (ApoAlert Caspase-3 Colorimetric Assay Kit, Clontech , Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 측정하였다 .¹⁴ Caspase-3 활성화 양성 대조군으로 인체 T세포 림프종 세포주인 Jurkat세 포에 anti-Fas monoclonal antibody (clone CH-11, 50 ng/mL, Calbiochem, Cambridge, MA, USA)를 투여한 후 8시간 배 양하여 사용하며, 호중구 세포사멸 억제 양성 대조군으로 호중구에 E. coli LPS (10 µg/mL)를 투여하여 사용하였다.

실험마다 caspase-3 활성 억제제인 DEVD-fmk를 투여하 여 caspase-3 활성도가 억제되는지 확인하였다.

10 . 통계적 분석

결과는 mean ± SE로 제시하였고, 통계적 분석을 위하 여 Wilcoxon rank sum test가 사용되었으며, p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다 .

결 과

1 . 호중구에서의 C O X- 2 발현 1) COX- 2 mRNA 발현

호중구에서 COX-2 mRNA는 기본적으로 발현(constitu- tive expression)되었다. H. pylori 수용성 추출물로 자극하 였을 때 mRNA transcript는 4시간 후가 정점에 도달하였 으며, 대조군에 비해 3배 정도 증가되었다(Fig. 2).

Transwell을 이용한 위상피세포 -호중구 동시배양 모 델에서도 H. pylori로 자극하였을 때 호중구로부터 발현 된 COX -2 mRNA는 대조군에 비해 4배 정도 증가되었 다 (Fig. 3).

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Kim, et al. Effect of Rebamipide on the Activated Neutrophils

2 ) COX- 1 , - 2 단백질 발현

COX- 1에 대한 Western blotting을 시행하였을 때 H.

pylori 수용성 추출물 투여군과 대조군과 차이가 없었으나, COX-2 단백질의 경우 H. pylori 수용성 추출물 투여군에 서 유의하게 증가되었다(Fig. 4).

2 . 호중구에서의 P G E2 생성

COX-2 mRNA 및 단백질 발현이 PGE² 생성으로 이어 지는 가를 확인하기 위하여 호중구 배양상청액에서 PGE2

치를 측정하였다 . 호중구 자극군에서 PGE2치는 대조군에 비하여 현저히 증가되었다(Fig. 5).

3 . Re b a m ip id e 투여 후 호중구에서의 P G E2 생성

Rebamipide로 전처치한 후 호중구에 H. pylori 수용성 추출물을 투여하였을 때 호중구 배양상청액에서의 PGE² 치는 용량의존적으로 억제되었다 . Rebamipide 0.1 mM로 전처치하였을 때 PGE2치는 억제되지 않았으나, 1 mM로 전처치하였을 때 유의하게 억제되었다(Fig. 6).

4 . Re b a m ip id e 투여 후 c yt o s o lic o lig o n u c le o s o me - b o u n d DNA E LIS A 및 c a s p a s e - 3 활성도 호중구에 H. pylori 수용성 추출물을 투여하였을 때 대조군에 비하여 cytosolic oligonucleosome-bound DNA ELISA치는 감소하여 세포사멸이 억제되었음을 확인하였 으며, rebamipide로 전처치한 결과 cytosolic oligonucleosome- bound DNA ELISA치는 변화하지 않아 세포사멸에 영향을 Fig. 2. The quantification of cyclooxygenase (COX)-2 mRNA

in the neutrophils. After the neutrophils were cultured with H.

pylori water extract (HPWE) or culture medium only (control) for 12 hours, the total RNA was extracted, co-reverse transcribed with synthetic standard RNA, and amplified by PCR, as described in Materials and Methods. The data shown are representative of the results of three separate experiments.

Fig. 3. The quantification of cyclooxygenase (COX)-2 mRNA in the neutrophils. After the neutrophils were co-cultured with AGS cells infected with live H. p ylori using transwell inserts (0.4 µm pore) for 12 hours, the total RNA was extracted, co-reverse transcribed with synthetic standard RNA, and amplified by PCR, as described in Materials and Methods. The data shown are representative of the results of three separate experiments.

Fig. 4. Western blot for COX-1 and COX-2. After the neutrophils were co-cultured with HPWE for 24 hours, the cell lysates were electrophoresed in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 10% gradient gel and electroblotted on nitrocellulose filters. The blots were incubated with primary and horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies, and then examined using an enhanced chemiluminescence detection kit. The representative Western blots of three separate experiments are shown. C, neutrophils cultured with medium only (control); S, neutrophils co-cultured with HPWE. (A) Western blot for COX-1. (B) Western blot for COX-2.

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대한소화기학회지 :제39권 제 1호, 2002

Fig. 6. Inhibitory effects of rebamipide on PGE2 secretion in neutrophils. The neutrophils were co-cultured with HPWE for 12 hours after a pretreatment with rebamipide (0.1mM and 1 mM).

Then, the neutrophil culture supernatant was obtained. The PGE2

levels were analyzed by radioimmunoassay. The data are expressed as the mean ± SEM of four separate experiments. * p<0.05.

주지 않았다(Fig. 7).

또한, 호중구에 H. pylori 수용성 추출물을 투여하였을 때 대조군에 비하여 caspase-3 활성도는 감소하여 세포사멸 억제기전으로 확인되었으며, rebamipide로 전처치한 결과 caspase-3 활성도는 변화하지 않아 세포사멸에 영향을 주지 않았던 결과와 일치하였다(Fig. 8).

Fig. 7. Effects of rebamipide on neutrophil apoptosis. Rebamipide did not affect neutrophil apoptosis. The neutrophils were co-cultured with HPWE for 24 hours after a pretreatment with rebamipide (0.1 mM and 1 mM). Then, cells were lysed at the designated time point. After colorimetric assay was carried out, the absorbance of samples at 409 nm using a reference wave- length of 490 nm was measured using an ELISA reader. The data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments.

Fig. 5. Secretion of PGE2 by the neutrophils. After the neutro- phils were cultured with HPWE or culture medium only (control) for 24 hours, the neutrophil culture supernatant was obtained and the PGE2 levels were analyzed by radioimmunoassay. The data are expressed as mean ± SEM of four separate experiments.

* p<0.05.

Fig. 8. Effects of rebamipide on caspase-3 activity in neutro- phils. Rebamipide did not affect caspase-3 activity in neutrophils. The neutrophils were co-cultured with HPWE for 24 hours after a pretreatment with rebamipide (0.1 mM and 1 mM). Then, cells were lysed at the designated time point.

Activation of caspase-3 was determined by detection of the chromophore p-nitroanilide (pNA) after cleavage from the labeled substrate DEVD-pNA. The supernatants were incubated with DEVD-pNA for 1 hour at 37 ℃, and then optical density was measured at 405 nm. The data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments.

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김주성 외 7인. 활성화된 호중구에 대한 Rebamipide의 효과

고 찰

본 연구 결과, H. pylori 수용성 추출물이 인체 호중구 에서 COX-2 유전자와 단백질 발현을 증가시켰음을 최초로 규명하였다. 호중구에서의 COX-2 발현의 증가는 PGE2 생성 증가로 이어졌으므로, PGE² 생성기전에 COX-2 유도가 중요 한 역할을 담당하였음을 확인하였다. LPS, granulocyte- macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF), TNF-α, IL- 1 β 및 formyl-methionyl- leucyl-phenylalanine 등을 위시한 염증성 자극물질이 호중구 COX-2 발현을 증가시키는 것 으로 알려졌다.^{15 , 16} 특히 LPS의 경우 COX-2 발현 유도가 빨리 나타나는데, 본 연구 결과에서도 H. pylori 수용성 추 출물로 자극한 지 2시간에서부터 COX-2 발현 유도가 현저 히 증가되었다.

본 연구에서 생체내 H. pylori 감염에 의한 호중구 활 성화를 simulation하기 위하여 transwell model을 확립하였 다 . 이 transwell model은 화학주성 자극이나 침습성 세균 에 의한 호중구의 transepithelial migration을 평가하기 위하여 흔히 사용되는 것으로,^{17 ,1 8} 본 연구에서는 H. pylori 생성 물질이나 H. pylori로 자극된 위상피세포에서 분비되는 proinflammatory cytokine, chemokine에 의한 호중구 활성화 정도를 COX-2 mRNA 발현으로 측정하고자 하였다. 그 결과, COX-2 mRNA 발현은 H. pylori 수용성 추출물로 자극한 결 과와 유사하게 측정되었다. 이는 H. pylori 감염에 의한 위점 막내 호중구 활성화에서 H. pylori 수용성 단백질이 중요한 역할을 차지하는 것을 시사한다.

COX-2에 의하여 생성되는 중요한 물질 중의 하나가 PGE²이다. 호중구로부터 생성되어 분비되는 PGE2는 염증 성 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있는데, 첫째, 상기 기술한 바 여러 염증성 물질들이 호중구의 PGE2 생성을 촉진시킨다 . 둘째, 동물실험 모델에서 COX-2 특이 억제제 인 NS-398을 조기 투여하였을 때 염증반응이 억제되는 것 이 확인되었다 .¹⁹ 셋째, PGE²는 호중구 세포사멸을 억제하 는 것으로 알려졌다.^{2 0} 호중구가 시험관이나 생체 내에서 세포사멸 과정을 거쳐 세포사하는 것을 고려하면,^{2 1} PGE2

생성 증가에 의한 호중구 세포사멸 억제가 염증 지속을 유도할 수 있을 것이다. 본 연구에서 호중구를 rebamipide 로 전처치하였을 때 PGE2 생성을 용량의존적으로 억제하 였음을 규명하였다 . 이는 rebamipide가 호중구 활성화를 억제하는 새로운 기전을 제시하였다고 판단된다.

Rebamipide는 위상피세포에서 PG 생성을 증가시켜 궤 양의 치료 속도뿐만 아니라 질(quality of ulcer healing)도 향상시키는 것으로 알려졌다.^{2 2 - 2 4} 또한, 호중구가 내피세포 에 부착되는 것을 억제하고 H. pylori 수용성 추출물로 자 극된 호중구에서 반응성 산소대사물(reactive oxygen

metabolites) 생성을 억제하는 것으로 알려졌다 .^{2 5} 본 연구 에서는 rebamipide가 PGE2 생성에 관여하는 역할에 대하 여 dual action이 있음을 최초로 제시하였다. 즉, rebamipide 가 위상피세포에서의 PGE2 생성을 증가시키는 것은 여러 보고로 확인된 사실이며 , 본 연구에서 rebamipide가 호중 구로부터의 PGE2 생성을 억제시키는 것을 규명함으로써 rebamipide가 PGE2 생성에 dual action이 있음을 제시한 것 이다 . 이 dual action 모두 염증 억제 및 상피세포 보호 효과를 나타내어 결국 rebamipide의 위점막 염증 억제 및 위점막 보호 효과에 대한 새로운 생물학적 기전을 설명할 수 있게 되었다 .

저자들이 이전 연구에서 H. pylori 감염에 의한 위점막 염증반응 지속 기전으로 H. pylori 수용성 추출물로 호중 구를 자극하였을 때 호중구 세포사멸 억제 및 그 기전으 로 caspase-3 활성도 감소를 제시한 바 있다.^{4 ,5} 호중구 세 포사멸에 대한 rebamipide의 효과를 확인하기 위하여 rebamipide로 전처치하였을 때 호중구 세포사멸 및 caspase-3 활성도는 영향을 받지 않았다 . 즉, rebamipide는 호중구 life-span에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였 다 . 본 연구 결과 rebamipide는 호중구 세포사멸에 영향 을 주지 않으면서 염증성 물질 생성을 억제하는 것으로 판단되었다 . 향후 rebamipide의 염증 억제 및 점막 보호 효과에 대한 새로운 기전을 규명하기 위하여 많은 연구 가 진행될 것이며, 특히 호중구에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다 .

요 약

목 적 : Helicobacter pylori는 비침습성 세균임에도 불구 하고 감염 후 위점막에는 호중구의 침윤이 특징적이다 . 염증반응에서 중요한 역할을 담당하는 것이 cyclooxy- genase(COX)-2 및 prostaglandin (PG)이다 . H. pylori에 의해 활성화된 호중구에서의 COX-2 발현 및 생성된 PGE² 양 을 측정하고, rebamipide가 이를 조절하는 지 확인하고자 하며, 또한 rebamipide가 호중구 세포사멸 (apoptosis)에 영 향을 미치는 지를 평가하여 위점막 염증 반응 조절에 새로운 기전을 제시하고자 하였다. 대 상 및 방 법 : H.

pylori 수용성 추출물을 제조한 후 그 특성을 확인하였으 며 , 호중구는 건강한 공혈자의 buffy coat에서 density gradient separation 방법으로 분리하였다. H. pylori 수용성 추출물을 호중구에 투여한 후, COX-2 유전자 및 단백질 발현을 표준 합성 RNA를 이용한 정량적 RT-PCR 및 Western blot으로 확인하였다 . 위상피세포주와 호중구를 동시 배양한 상태에서 H. pylori를 가한 transwell model 을 확립한 후 호중구에서의 COX-2 유전자 발현을 정량 1 9

The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 39. No. 1. 2002

적 RT-PCR으로 확인하였다. COX-2 발현이 PGE2 생성으 로 이어지는지를 확인하기 위하여 radioimmunoassay를 시 행하였다 . Rebamipide로 전처치한 후 PGE2 생성 변화를 측정하였으며, 호중구 세포사멸에 영향을 주는지 확인하 기 위하여 cytosolic oligonucleosome-bound DNA ELISA를 시행하였고 caspase-3 활성도를 측정하였다 . 결 과 : H.

pylori 수용성 추출물로 자극하였을 때 호중구에서 COX-2 유전자 및 단백질 발현이 증가되었으며, PGE2 생성이 증 가되었다 . Transwell model에서도 COX-2 유전자는 비슷하 게 증가되었다. Rebamipide를 투여하였을 때 PGE² 생성은 용량의존적으로 억제되었으며, 세포사멸 정도 및 세포내 caspase-3 활성도는 영향을 받지 않았다 . 결 론 : H. pylori 수용성 단백질은 호중구를 자극하여 COX-2 발현 및 PGE² 생성을 증가시켰다 . Rebamipide는 호중구로부터의 PGE2 생 성을 억제시킴으로써 염증반응 억제 효과를 나타냈으나 호 중구 세포사멸에는 영향을 미치지 않았다.

색인단어 : Helicobacter pylori, 호중구, Rebamipide, Cyclooxgenase-2, 세포사멸

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