, 서울대학교병원 의생명연구원

한국 폐경 여성에서 Sclerostin (SOST) 유전자 다형성과 골밀도 및 순환계 Osteoprotegerin (OPG) –용질성 Receptor Activator of NF-κB

Ligand (sRANKL) 사이의 연관성

서울대학교 의과대학 산부인과학교실

, 서울대학교병원 의생명연구원

이희준

․김 훈

․구승엽

․김석현

․최영민

․김정구

The Association between Single Nucleotide Polymorphisms of Sclerostin (SOST) Gene, Bone Mineral Density and Circulating Osteoprotegerin (OPG) –Soluble Receptor Activator of NF-κB Ligand (sRANKL) in Postmenopausal Korean Women

Hee Jun Lee

, Hoon Kim

, Seung-Yup Ku

, Seok Hyun Kim

, Young Min Choi

, Jung Gu Kim

1

Department of Obstetrics and Gynecology, Seoul National University College of Medicine,

2

Biomedical Research Institute, Seoul National University Hospital

Objectives: To investigate the relationship between polymorphisms of sclerostin (SOST) gene and bone mineral density (BMD) in postmenopausal Korean women.

Materials and Methods: The SOST rs865429 (g.5942C>T), rs17882143 (c.28G>A), rs10534024 (-1396TCC/Del) polymorphisms were analyzed by Taqman assay and direct DNA sequencing in 399 postmenopausal Korean women. Serum CrossLaps (CTX), bone alkaline phosphatase (BAP), osteocalcin, osteoprotegerin (OPG) and soluble receptor activator of NF-kB ligand (sRANKL) were measured by enzyme linked immunosorbent assay. The BMD at the lumbar spine (LS) and femoral neck (FN) were determined by dual energy X-ray absorptiometry, and in 311 postmenopausal women receiving hormone therapy (HT) BMD was also measured after HT of 1 year.

Results: The SOST g.5942C>T and c.28G>A polymorphisms were not observed. No significant differences in adjusted BMD at LS and FN, prevalence for osteoporosis and serum levels of biochemical markers were noted among genotypes of the SOST -1396TCC/del polymorphism. A significant association was found between SOST -1396TCC/Del polymorphism and the annual percent changes of BMD at LS but not FN after HT. The Del/Del genotype showed a significant decrease in BMD after HT compared with other genotypes.

Conclusions: The SOST -1396TCC/Del polymorphism affects an annual BMD change at LS after HT in postmenopausal Korean women.

Key Words: BMD, Genetic polymorphism, Hormone therapy, SOST

Received: November 7, 2012 Revised: December 20, 2012 Accepted: December 21, 2012

Corresponding Author: Jung Gu Kim, Department of Obstetrics and Gynecology, Seoul National University Hospital, 28 Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seoul 110-744, Korea

Tel: +82-2-2072-3256, Fax: +82-2-762-3599, E-mail: [email protected]

* 본 연구는 2010년도 서울대학교병원 일반연구비(#04-2010-0580)의 지원에 의해 이루어진 것임.

골다공증은 파골세포의 골흡수 작용과 조골세포 의 골형성 작용의 불균형에 의해 골 강도 이상이 발 생하여 골절 위험이 높아지는 골격질환으로,

골절 뿐만 아니라 그에 따른 합병증으로 인해 환자의 삶 의 질이 떨어지고 상당한 사회적, 경제적 손실을 초 래할 수 있다. 골다공증은 노인에서 주로 발생하는 만성 질환의 일종으로 특히 폐경 여성에서 급격한 골소실에 의해 발생하며, 현재와 같은 평균 수명 연 장에 따른 노인 인구의 급속한 증가는 골다공증 발 생 빈도를 더욱 증가시키고 있다.

골다공증의 원인 중 많은 부분이 유전적 원인에 의해 발생하는 것으로 생각되고 있어 골다공증에 관 여하는 유전인자를 찾기 위한 연구가 지속적으로 진 행되어 왔으나 정확하게 규명되고 있지 않은 상태이 다.

본 연구자 등은 이전에 한국 자연 폐경 여성에 서 에스트로겐,

인슐린유사성장인자유전자,

비타민 D 수용체유전자

다형성들이 골밀도의 중요한 유전 학적 인자라고 보고한 바 있다. 그러나, 이외에도 골 다공증에 관여하는 다른 여러 유전인자가 인종적, 환경적 차이에 의해 다양하게 존재할 수 있으므로 이에 대한 연구가 지속되어야 한다.

최근 Wnt 신호전달계가 조골세포의 골형성에 중 요한 역할을 한다고 알려졌다.

Wnt는 저밀도 저단 백 수용체 연관 단백질(low density lipoprotein recep- tor related protein, LRP), 또는 frizzled 수용체와 결합 하여 몇 가지의 세포 반응을 연속적으로 발생시키는 과정을 통해 조골세포의 분화를 조절한다. 한편 SOST 유전자의 산물이며 골세포에서만 분비되는 sclerostin이 Wnt 신호전달기능의 억제인자로 알려져

있다.

SOST 유전자 다형성이 스페인 폐경 여성,

네덜란드 남성과 여성,

오스트레일리아 폐경 여성

14

및 중국 폐경 전 여성, 폐경 후 여성과 일부 남성 에서

골밀도와 연관된 유전인자일 가능성이 보고 되었으나 아직까지 한국인에서 SOST 유전자 다형성 과 골밀도와의 연관성에 대해 보고된 바가 없다.

호르몬 치료는 60세 이하의 골절 위험이 있는 폐 경 후 여성에서 일차적으로 사용될 수 있는 치료약 제이다. 그러나, 호르몬 치료 후에도 2~26%의 여성 에서는 골밀도가 감소되는 것으로 알려져 있다.

이러한 호르몬 치료에 대한 비반응군이, 호르몬 치

료를 받는 폐경 후 한국 여성에서는 약 26%에서 관 찰되었는데,

비용 대비 효과를 비교하였을 때 비반 응군을 치료 전에 예측할 수 있다면 의료비의 낭비 를 막을 수 있다. 본 연구에서는 한국 자연 폐경 여 성에서 SOST 유전자 내 다형성과 골밀도 및 호르몬 치료에 대한 골밀도로 표현한 골반응도 사이의 연관 성을 규명하고자 하였다.

대상 및 방법

1.연구 대상자

본 병원 폐경 클리닉에 호르몬 치료와 골밀도 측정 을 목적으로 방문한 폐경 여성 중 본 연구의 목적을 충분히 이해하고 동의한 여성 399명을 대상으로 하였 다. 폐경은 양측 난소절제술의 과거력 없이 마지막 생리가 있은 지 적어도 1년이 경과된 여성 중 혈청 난포자극호르몬이 40 mIU/mL 이상인 경우로 하였다.

이러한 연구대상자에서 당뇨병, 간질환, 신장질환 등 급성, 만성질환이 있거나 호르몬, 활성 비타민 D, 칼 시토닌과 같은 골대사에 영향을 준다고 알려진 약제 를 복용한 여성은 제외하였고, 에스트로겐 제제 사용 의 절대적 금기사항인 원인이 확실치 않은 비정상 질 출혈, 급성 혈관질환, 유방암 등이 있는 환자도 제외 하였다. 연구 대상자에게 경구용 접합 마 에스트로겐 (conjugated equine estrogen)인 premarin

0.30 mg/일과 함께 Provera

(medroxyprogesterone acetate (MPA) 5 mg을 매달 1일에서 12일까지 1일 1회, 취침 전에 복 용하게 하였고 칼슘 1 g을 병행 투여하였다. 1년간 호 르몬 치료를 하였고, 1년 후 골밀도를 측정한 최종 대 상자는 311명이었다. 본 연구는 서울대학교 병원 의 학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)에 서 승인되었다.

2. 혈액 채취 및 신체질량지수 측정

연구대상자들로부터 호르몬 치료 전 혈액을 헤파

린(heparin)이 들어 있는 튜브에 채취하고 연막(buffy

coat)을 제조 후 냉장 보관하였다가 DNA 추출에 사

용하였다. 일부 혈액은 항응고제가 들어 있지 않은

튜브에 채취하여 각각 원심분리하여 혈청을 모아서

-70˚C에 보관하였다가 골대사의 생화학적 인자 등

의 측정에 사용하였다. 키와 체중을 측정하여 신체 질량지수(body mass index: kg/m

)를 계산하였다.

3. 골밀도 측정

모든 연구대상자들은 호르몬 치료 전과 치료 후 1 년에 골밀도를 측정하였다. 연구대상자에서 척추, 대퇴골경부의 골밀도 측정에 Lunar사(Lunar PPX-L, Medison, Wisconsin, USA)의 이중에너지 엑스레이 흡수계측기(dual energy X-ray absoptiometry; DXA)를 이용하였다. 이 측정기의 요추 골밀도 측정에서의 체내 변이계수(in vivo coefficient of variation)는 1.4%, 대퇴골경부 2.1%였다.

4. 혈청 골교체 인자 측정

혈청 bone alkaline phosphatase (BAP)는 Metra Biosystems사(Santa Clara, CA, USA)의 Alkphase-B 키 트를 사용하여 면역측정법으로 측정하였고, 측정 민 감도는 0.7 U/L이고 측정 간의 변이는 5.2%, 측정 내 변이는 3.9%였다. 혈청 CrossLaps (CTX)는 Osteometer 사(Herlev, Denmark)의 혈청 CTX 키트를 사용하여 측 정하였으며, 측정 민감도는 94 pM, 측정 간의 변이는 5.4%이며, 측정 내 변이는 5.0%였다. 혈청 osteocalcin (OST)은 ELSA-OSTEO 키트(CIS bio international, Codolet, France)를 이용하여 면역방사선 측정법(radio- immunoassay)으로 측정하였는데, 측정 민감도는 0.4 ng/mL였고 측정 간의 변이는 5.2%, 측정 내 변이는 3.8%였다.

5. 혈청 OPG, sRANKL 측정 1) OPG 측정

OPG 측정은 R & D사(Minneapolis, MN, USA)의 정량적 효소면역키트를 사용하여 측정하였다. 즉, 생쥐 항인간 OPG 항체가 입혀져 있는 96 구멍 미세 판에 넣어 실온에서 18시간 방치한 후 3회 세척하고 1% 우혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)을 함 유한 phosphate buffered saline (PBS) 용액을 넣어 실 온에서 1시간 방치한 후 다시 3회 세척하였다. 구멍 에 검체를 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 다음 세척 하고 비오틴화된(biotinylated) 염소 항인간 OPG 항체 를 넣어 실온에서 2시간 반응시키고 그 후 3회 세척

하였다. Streptoavidin-horseradish peroxidase 결합체 용액을 넣어 실온에서 천천히 흔들면서 20분간 반응 시켰다. 그 후 3회 세척하고 tetramethylbenzidine 기 질용액을 넣어 실온에서 20분간 반응시킨 후 정지용 액을 넣은 다음 450 nm에서의 흡광도를 측정하고 표준곡선에서 농도를 구하였다. OPG 측정 민감도는 0.195 ng/mL였고 측정 간의 변이는 8.1%, 측정 내 변 이는 11.7%였다. 측정치는 단핵구 및 림프구 수에 따라 조절되어 pg/mL/10

세포로 표시하였다.

2) sRANKL 측정

Biomedica Gruppe사(Wien, Austria)의 RANKL 효소 면역 키트를 사용하여 sRANKL를 측정하였다. 즉, OPG를 함유한 구멍에 검체를 넣고 여기에 비오틴화 된(biotinylated) polyclonal 용해성 RANKL 항체를 넣 어 4°C에서 18시간 반응시키고 그 후 5회 세척하였 다. 그 후 streptoavidin- horeseradiah peroxidase 결합 체 용액을 넣어 실온에서 천천히 흔들면서 1시간 동 안 반응시켰다. 그 후 5회 세척하고 tetramethyl- benzidine 기질용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시 킨 후 정지용액을 넣은 다음 450 nm에서의 흡광도 를 측정하고 표준직선에서 농도를 구하였다. 측정 민감도는 0.2 pg/mL였고, 측정 간의 변이는 7.2%, 측 정 내 변이는 3.9%였다.

6. 혈액에서 DNA 추출

냉장 보관하였던 연막에 적혈구 용해 완충용액 (lysis buffer; 1M Tris pH 7.6 10 mL, 1M MgCl

5 mL, 1M NaCl 10 mL, 3차 증류수 975 mL로 제조)을 혼합 하여 1500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 다시 적혈구 용해 완충용액을 넣고 원 심분리한 후 200 μL만 남겨두고 상층액을 제거한 후 QIAamp 혈액 키트(QIAGEN Inc., Santa Clarita, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다.

7. SOST 유전자 다형성 측정

1) SOST 유전자의 g.5942C>T 다형성 측정

이러한 다형성은 Taqman allelic discrimination

assay를 사용하여 측정하였는데 다형성 부위가 포함

된 부위를 Table 1에서와 같은 특이적 시발체들을

dbSNP ID Base (amino acid)

alteration PCR primer Annealing temp

(℃)

Fragment size (bp)

rs865429 g.5942C>T F: GGCACCCCTGCAGTGT 59 297

R: CGAAAACTCCCATTCCTTCAAGTG VIC primer: CAGGCCGTGGGCAA FAM reporter: CAGGCCATGGGCAA F1: AAGQATAGCCCTGGTGTGTGG R1: CCAGGGTTCCTCTTCCTTCT

rs17882143 c.28G>A(V10L) F: GAGCCTGTGCTACTGGAAGG 60 354

R: TCTACCCCAGTCTTCCAAGC

rs10534024 -1396TCC/Del F: AGAGAAAGGAAGGCCAGAGG 59 341

R: GGCCACAGCTGTTTTCATCT Table 1. PCR primers for SOST polymorphisms

사용하여 중합효소반응(polymerase chain reaction:

PCR)로 증폭하였다. 한 개의 대립인자 지침자에 fluorescent amidite matrix로 붙였고 다른 하나는 형광 인 VIC 형광 dye를 붙였다. PCR은 각 구멍에 DNA 주형 20 ng을 가진 96 구멍 판에 uracil N-glycosylase 가 없는 Taqman universal master mix, 시발체농도 900 nM, Taqman 지침자농도 200 nM를 추가한 반응 혼합용액 5 μL를 만들어 시행하였다. 96 구멍 판을 PE 9700 thermal cycler (Applies Biosystems, CA, USA)에 놓고 50°C에서 2분간, 95°C에서 10분간 가 열 후 95°C에서 15초간 다시 변성, 60°C에서 1분간 가열과정으로 40주기를 시행하였다. Taqman 측정판 을 Prism 7900 HT instrument (Applied Biosystems)로 옮겨 각 구멍에서 형광강도를 읽은 후 SDS 2.1 software (Applied Biosystems)로 결과를 분석하였다.

그 후 20개의 검체를 택하여 염기서열분석법으로 재 확인하였다.

2) SOST 유전자 내 c.28 G>A 다형성 및–1396TCC/

Del 다형성 측정

DNA 주형 100 ng을 가진 0.5 mL 튜브에 PCR 완 충용액(50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8.3), 1.5 mM MgCl

, 각 0.2 mM의 dNTP, 10 pM의 시발체들(Table 1), Taq DNA polymerase 0.5 단위를 추가한 반응 혼 합용액 25 μL를 만들어 PCR로 증폭하였다. PCR 산 물을 확인하기 위하여 4 μL를 취하여 6 x 염색액 2 μL와 혼합하여 2% 한천 겔에서 전기영동하였고 이 를 ethidium bromide로 염색한 후 자외선 투시기로 증폭된 DNA 띠를 확인하였다.

가) 한천 겔로부터 DNA 분리

PCR 산물을 2% 한천 겔에서 전기영동시켜 분리 한 후 DNA 밴드를 잘라내어 QIAEX II 겔 추출 키트 (QIAGEN Inc., Santa Clarita, CA, USA)로 분리하였 다. 즉, DNA띠를 함유한 겔 조각을 가진 튜브에 1:3 용적의 QX I 완충용액과 QIAEX II를 넣은 후 50°C 에서 10분간 반응시키고 30초 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 남은 침전물에 QX I 완충용액, PE 완충용액으로 연속 세척하였고 침전물을 공기 중에서 30분간 건조시켰다. 증류수를 추가한 다음 혼합 부유시켜 실온에서 5분간 반응시 키고 30초간 원심분리하여 상층액을 채취하여 사용 시까지 -70°C에 보관하였다.

나) DNA 염기서열분석

염기서열을 결정하기 위하여 한천 겔에서 분리 정

제된 PCR 산물 100 ng을 사용하였다. 주기 염기서열

분석(cycle sequencing)을 하기 위하여 PRISM

Ready Dye Terminator Cycle Sequencing 키트(Perkin-

Elmer, ABI, Foster city, USA)를 이용하였다. 서열분

석은 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin-Elmer)을 이

용하여 미리 96°C로 예열하였다가 10초 동안 온도

를 유지한 후 96°C에서 30초, 50°C에서 15초, 그리고

60°C에서 4분씩 총 25회를 반응시켰다. 반응이 끝난

후 미반응된 nucleotide는 Centri-Sep

spin 원주

(Princeton, NJ, USA)를 사용하여 제거하였으며 speed

vac (Savant, NY, USA)에서 30분간 건조시켰다. 그리

고 4 μL의 deionized formamide: 50 mM EDTA (5:1)

에 녹인 후 ABI 373A DNA sequencer를 이용하여 변

A: delTCC/delTCC

B: TCC/delTCC

C: TCC/TCC

Fig. 1. DNA sequencing for rs 10534024 SNP (-1396TCC/Del) in SOST gene. Arrow indicates deletion of TCC.

성된 4.75% polyacrylamide 겔에서 30 W, 14시간 전 기영동시킨 후 ABI sequence software 1.2.1 (Applied Biosystems, XCA, USA)로 결과를 분석하였다. SOST –1396 del TCC 다형성의 3가지 유전자형에서의 전 형적인 염기서열분석 양상은 Fig. 1과 같았다.

8. 통계분석

모든 통계 분석은 Statistical package for social science (SPSS) 17.0 통계 프로그램(SPSS inc., Chicago, Illinois)을 사용하였다. SOST 유전자 내 다형성 양상 에 따른 골밀도와 혈청 골교체인자, OPG, sRANKL농 도 및 호르몬 치료 후 연간 골밀도 변화율의 비교에는 Analysis of variance (ANOVA), Analysis of covariance (ANCOVA) 검사를 이용하여 분석하였다. SOST 유전 자형 분포의 Hardy-Weinberg 평형 일치 여부 분석과 골다공증과 호르몬치료 후 비반응군의 승산비(odds ratio) 분석에는 χ

검사를 사용하였다. 모든 통계학적 분석에서 P<0.05인 경우만 유의하게 판정하였다.

결 과

1. SOST 유전자 다형성 양상

SOST g.5942C>T 다형성과 c.28 G>A 다형성이 관찰되지 않아 SOST g.5942C>T 다형성의 경우 TT 대립인자, c.28 G>A다형성에서는 GG 대립인자만이 있었다. 다형성이 관찰된 SOST -1396TCC/Del에서 다형성 양상에 따른 유전자형을 보면, TCC/TCC, TCC/ Del, Del/Del 유전자형이 각각 46.9%, 43.8%, 9.3%였고, 그 빈도는 Hardy-Weinberg의 평형을 따르 는 것으로 나타났다.

2. SOST -1396TCC/Del 다형성 양상과 골밀도 및 생화학적 인자의 연관성

SOST -1396TCC/Del 다형성에 따른 유전자형에서

의 임상적 특성 및 골밀도는 Table 2와 같았다. 각 유전

자형 간에 연령, 폐경 기간, 그리고 신체질량지수 차이

는 없었으며 각 유전자형에 따른 요추 및 대퇴골 경부

에서의 골밀도의 차이가 없었으며 골다공증의 위험도

SOST -1396delTCC

P-value TCC/TCC (n=187) TCC/Del (n=175) Del/Del (n=37)

Age (years)* 57.8±0.5 57.8±0.5 57.4±0.9 0.94

YSM (years)* 9.1±0.6 9.6±0.6 8.6±1.0 0.67

BMI (kg/m

)* 24.2±0.2 24.1±0.2 24.2±0.5 0.92

BMD (g/cm

)*

Lumbar spine 1.017±0.013 0.991±0.014 1.013±0.027 0.38

Femoral neck 0.837±0.012 0.814±0.009 0.808±0.019 0.27

Odds ratios (95% CI)

Osteoporosis at LS 1 0.89 (0.28~2.68) 1.04 (0.57~1.92) 0.96

Osteoporosis at FN 1 unavailable- 1.08 (0.47~2.49) 0.21

Osteoporosis at LS and/or FN 1 0.79 (0.25~2.35) 1.01 (0.56~1.81) 0.89

Bone markers (n=107) (n=88) (n=21)

BAP (U/L)* 17.0±0.6 17.8±0.6 16.3±1.2 0.51

CTX (pM/L)* 1975.8±443.7 1547.2±124.8 1889.7±295.0 0.64

OST* 13.8±0.5 14.2±0.5 16.6±1.5 0.07

OPG (ng/mL)* 9077.4±326.4 9206.8±218.4 9593.0±488.9 0.74

sRANKL (pg/mL)* 7.1±0.5 7.6±0.7 9.2±2.1 0.36

sRANKL

/OPG* 0.9±0.1 0.9±0.1 1.0±0.2 0.73

YSM, years since menopause; BMI, body mass index; BMD, bone mineral density; BAP, bone alkaline phosphatase;

OST, osteocalcin; CTX, CrossLaps; OPG, osteoprotegerin; RANKL, receptor activator for nuclear factor-kappa B.

*values are mean±SE.

BMDs and bone markers are adjusted for age, years since menopause, and BMI.

P: ANOVA and chi-square test.

Odd ratio and 95% CI (confidence interval): analyzed using the chi-square test.

Table 2. Clinical characteristics, bone markers and bone mineral density in postmenopausal women according to SOST -1396TCC/Del polymorphisms

SOST -1396TCC/Del

TCC/TCC TCC/Del Del/Del P

BMD changes (%/year)* (n=149) (n=131) (n=31)

LS 2.35±0.69

2.78±0.77

-(5.29±4.74)

0.002

FN 1.02±1.10 1.00±0.71 0.70±1.64 0.99

Odds ratios (95% CI)

Non-responders at LS 1 2.08 (0.85~5.04) 0.88 (0.48~1.60) 0.11

Non-responders at FN 1 0.94 (0.37~2.35) 0.64 (0.36~1.13) 0.25

Non-responders at LS and/or FN 1 1.55 (0.66~3.56) 0.73 (0.43~1.22) 0.14

* values are mean±SE, and adjusted for age, years since menopause and body mass index.

Parentheses denote 95% CI (confidence interval), analyzed using the chi-square test and P value less than 0.025 is considered as not significant after Bonferroni’s correction.

OPG, osteoprotegerin; sRANKL, soluble receptor activator of nuclear factor kB ligand; LS, lumbar spine; FN, femoral neck.

P: by ANCOVA,

: P<0.005

Table 3. Adjusted rates (%/year) of changes in BMD after hormone therapy and odds ratio for nonresponders in relation to SOST rs10534024 (-1396TCC/Del) polymorphism

도 다형성 양상에 따른 차이가 없었다. 또한 혈청 BAP, CTX, OST, OPG, sRANKL와 sRANKL

/OPG 비도 유전자형 간에 차이가 없었다.

3. SOST -1396TCC/Del 다형성 양상과 호르 몬 치료 후 골밀도 변화와의 연관성

호르몬 치료 후 1년에서의 요추에서 골밀도 변화

율의 경우 Del/Del 유전자형에서 다른 유전자형에 비하여 유의하게 감소하였으나(P<0.01) 대퇴골경부 에서의 골밀도 변화율은 다형성양상에 따른 유의한 차이는 없었다(Table 3).

호르몬 치료 1년 후 골밀도가 3% 이상 감소된 경 우를 비반응군으로 하였을 때, 요추의 경우 23.9%, 대퇴골 경부의 경우 26.6%, 요추 또는 대퇴골 경부를 포함하는 경우 36.0%에서 비반응군에 해당하였다.

그러나 비반응군의 위험도는 SOST -1396TCC/Del 다 형성 양상에 따른 차이가 없었다(Table 3).

고 찰

유전적 요인이 골밀도에 영향을 미치는 중요한 인 자 중의 하나이나 현재까지 골량을 조절하는 유전인 자가 확실하게 밝혀진 바가 없다. 골대사에 관여하 는 후보인자의 유전자 내 다형성 양상은 인종과 민 족에 따라 다르게 보고되어

다른 인종 및 민족에 서 각각 특유의 유전인자 연구가 필요하다. 최근 Wnt신호전달계가 조골세포에 의한 골형성에 관여한 다고 알려졌고

Wnt의 작용을 억제하는 여러 길항 제 중의 일부가 골량을 지배하는 유전인자 중 하나 일 가능성이 보고되었다.

본 연구자 등은 한국 여 성에서 secreted frizzled related protein (sFRP)4의 c1019G>A SNP가 요추에서의 골밀도와 연관된 유 전인자일 수 있다는 것을 보고한 바 있다.

본 연구 는 최근 연구의 초점이 되고 있는 SOST 유전자의 변이양상과 골밀도의 연관성을 규명하고자 하였다.

본 연구에서는 SOST 유전자 내 g.5942C>T, c.28G

>A 다형성은 관찰되지 않았으나 SOST -1396TCC/Del 다형성이 관찰되었고, 이의 유전자형 빈도는 TCC/

TCC 46.9%, TCC/Del 43.8%, Del/Del 9.3%였다. 이러한 TCC/TCC 유전자형의 빈도는 스코틀랜드 폐경이행기 여성을 대상으로 한 연구에서 10~11.3%

, 네덜란드 55세 이상 여성 및 남성에서의 13%보다 높았다.

또 한 Mencej-Bedrac 등은 슬로베니아 폐경 전, 폐경 후의 여성과 남성을 대상으로 한 경우에도 12.6%로 보고하 고 있어,

한국 여성에서의 SOST -1396TCC/Del 다형 성양상이 코카시안과 다르다는 것을 보여준다.

SOST 유전자의 변이 양상과 골밀도와의 연관성에

관하여 일부 백인 여성 및 남성에서 연구가 수행되어 졌으나 그 결과가 각각 연구자마다 다르게 보고되고

있다.

Uitterlinden 등은 55세 이상의 네덜란드 여

성과 남성을 대상으로 본 연구와 동일한 SOST -1396TCC/Del 다형성과 요추 및 대퇴골 경부의 골밀 도 감소 사이에 연관성이 있다고 보고하였다.

이러 한 결과와는 반대로, 본 연구에서는 한국 폐경 여성을 대상으로 처음 시행한 SOST -1396TCC/Del 다형성에 따른 각 유전자형과 골밀도와의 연관성 조사에서 요 추 및 대퇴골 경부에서의 골밀도 차이는 없었으며 골 다공증 위험도에서도 차이가 없었다. 이러한 결과는 스코틀랜드 폐경이행기 여성을 대상으로 한 Balemans 등의 결과,

덴마크 남성을 대상으로 한 Piters 등의 결과,

슬로베니아 폐경 전 여성과 폐경 후 여성 및 일부 남성도 포함하였던 Mencej-Bedrac 등의 연구 결 과와

유사하다. Uitterlinden 등의 연구 결과와

한국 폐경 여성에서의 연구 결과가 다른 이유는 연구 대상 의 인종과 평균 연령 및 여성뿐만 아니라 남성도 포함 된 것에 기인될 수 있다.

SOST 유전자 내 -1396TCC/Del 다형성 이외의 다 른 다양한 위치에서의 SOST 유전자 내 다형성과 골 밀도 사이의 연관성에 대한 보고가 있었다. Sims 등 은 오스트레일리아 폐경 여성을 대상으로 SOST 유 전자내 rs851054 및 rs851056 다형성에서 대퇴골의 골밀도와 연관성이 있다고 보고하였고,

Valero 등 은 스페인 폐경 여성을 대상으로 rs851056 다형성과 요추 골밀도가 관련이 있다고 보고하였다.

동양권 에서는 유일하게 Huang 등이 남성, 폐경 전 여성, 폐 경 후 여성의 중국 한족을 대상으로 SOST 유전자 내 rs1230399 다형성과 요추, 대퇴골 경부, 대퇴골의 골밀도와 관련이 있음을 보고하였다.

한편, 골다공증 치료에 대한 골반응도를 결정하는

유전인자를 밝히기 위해 호르몬 치료 후 골밀도 변

화양상과 유전자 다형성 간의 관련성에 대한 연구가

진행되어 왔다. 외국의 경우 VDR 유전자 내 BsmI,

다형성이 호르몬 치료 후 골밀도 변화와 연관성이

있는 것으로 보고되었다.

본 연구에서는 SOST

-1396TCC/Del 다형성 양상의 Del/Del 유전자형에서

다른 유전자형에 비해 1년간의 호르몬 치료 후 요추

에서의 골밀도 변화율이 유의하게 낮아 SOST -1396TCC/Del 다형성 양상도 골반응도에 영향을 줄 수 있는 인자로 돌출되었으나, 비반응군의 위험도는 SOST -1396TCC/Del 다형성 양상에 따른 차이가 없 었다.

본 연구 결과에서는 1년간의 호르몬 치료 후 대퇴 골 경부에서는 유전자형에 따른 골밀도 변화율에 차 이가 없고 요추에서만 차이를 보여 골다공증의 진행 양상이 폐경 이행기에 요추에서 먼저 시작되고 추후 대퇴골 경부로 진행한다는 이전 보고와

일치하는 결과를 보여 주었다. 이는 본 연구 대상자들의 평균 연령이 57세로 비교적 젊고, 호르몬 치료를 1년간 단기간 시행하여 요추의 골밀도 변화는 진행되었으 나 대퇴골 경부의 골밀도 변화는 상대적으로 크게 진행되지 않아 본 연구와 같은 결과가 도출될 수 있 다. 추후 1년 이상의 장기간의 호르몬 치료 후 유전 자형에 따른 요추 및 대퇴골 경부의 골밀도 변화율 에 대한 연구가 필요하겠다.

Wnt 신호전달계와 osteoprotegerin (OPG)-receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)-RANK계의 연관성 이 보고되었으나,

본 연구에서는 SOST rs10534024 다형성에 따른 순환계 OPG-sRANKL 농도 및 골교체 인자 사이의 농도 차이는 보이지 않았다. 그러나 본 연구에서 사용된 OPG 측정키트가 OPG의 단일체 형 태나 동종이합체(homodimer) 형태 등을 함께 측정할 수가 없어 활성 OPG를 정확하게 반영할 수 없었던 단점이 있으며, 또한 생체 내 대부분의 RANKL은 세 포와 결합된 형태로 존재하는데 sRANKL만 측정하 였을 경우에는 세포 결합 형태의 RANKL은 측정되지 못하고, 이로 인해 생체 내 RANKL의 활성도를 정확 히 반영할 수 없었다는 점을 고려해야 한다.

본 연구의 제한점으로는, 1년 이후의 장기간 호르 몬 치료 후 골밀도의 변화를 관찰하지 못하였는데, Chun 등의 연구에 의하면 호르몬 치료 첫해 골밀도 가 감소된 환자들은 대개 호르몬 치료 지속 시 2년 째에는 골밀도가 증가되었다고 보고하였다.

이외 에도 본 연구에서는 SOST 유전자의 모든 다형성에 대한 검색이 이루어지지 않았고, 서울대학교 폐경클 리닉을 방문한 여성만을 대상으로 하여 선택적 편향 (selection bias)의 가능성을 배제하지 못한다. 그리고,

골량에 영향을 줄 수도 있는 음주, 흡연, 운동 등의 생활, 환경적인 요인을 고려하지 않았다는 점을 본 연구의 제한점으로 들 수 있다. 추후에는 이러한 점 을 고려하여 보다 많은 여성을 대상으로 1년 이상의 장기간의 호르몬 치료 후, SOST유전자 내 다형성 양 상에 대한 대규모 연구가 필요하다.

결론적으로 한국 폐경 여성에서 SOST 유전자 내 rs10534024 다형성은 요추 및 대퇴골 경부에서의 골 밀도에 영향을 주지 않았으나, 호르몬 치료 1년 후 요추 골밀도의 변화율과 연관성을 보였다. 그러나, 호르몬 치료 후 비반응군의 위험도에는 영향을 미치 지 않았다. 이러한 결과는 rs10534024 다형성이 호르 몬 치료 후 비반응군의 예측인자로 사용될 수는 없 지만 호르몬 치료 후 골밀도 변화에 영향을 미칠 수 있는 유전인자라고 사료된다.

Conflict of interest: W e declare that we have no conflict of interest.

참 고 문 헌

1. Kanis JA, Melton LJ, 3rd, Christiansen C, Johnston CC, Khaltaev N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res 1994;9:1137-41.

2. Gong G, Haynatzki G. Association between bone mineral density and candidate genes in different ethnic populations and its implications. Calcif Tissue Int 2003;72:113-23..

3. Ralston SH, Uitterlinden AG. Genetics of osteo- porosis. Endocr Rev 2010;31:629-62.

4. Kim JG, Lim KS, Kim EK, Choi YM, Lee JY.

Association of vitamin D receptor and estrogen receptor gene polymorphisms with bone mass in postmenopausal Korean women. Menopause 2001;

8:222-8.

5. Kim JG, Roh KR, Lee JY. The relationship among

serum insulin-like growth factor-I, insulin-like

growth factor-I gene polymorphism, and bone

mineral density in postmenopausal women in

Korea. Am J Obstet Gynecol 2002;186:345-50.

6. Kim JG, Kwon JH, Kim SH, Choi YM, Moon SY, Lee JY. Association between vitamin D receptor gene haplotypes and bone mass in postmenopausal Korean women. Am J Obstet Gynecol 2003;189:

1234-40.

7. Hoeppner LH, Secreto FJ, Westendorf JJ. Wnt signaling as a therapeutic target for bone diseases.

Expert Opin Ther Targets 2009;13:485-96.

8. Johnson ML, Kamel MA. The Wnt signaling pathway and bone metabolism. Curr Opin Rheumatol 2007;19:376-82.

9. Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM. Wnt signaling in osteoblasts and bone diseases. Gene 2004;341:19-39.

10. Ott SM. Sclerostin and Wnt signaling--the pathway to bone strength. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:

6741-3.

11. van Bezooijen RL, ten Dijke P, Papapoulos SE, Lowik CW. SOST/sclerostin, an osteocyte-derived negative regulator of bone formation. Cytokine Growth Factor Rev 2005;16:319-27.

12. Valero C, Zarrabeitia MT, Hernandez JL, Pineda B, Cano A, Garcia-Perez MA, et al. Relationship of sclerostin and secreted frizzled protein poly- morphisms with bone mineral density: an associa- tion study with replication in postmenopausal women. Menopause 2011;18:802-7.

13. Uitterlinden AG, Arp PP, Paeper BW, Charmley P, Proll S, Rivadeneira F, et al. Polymorphisms in the sclerosteosis/van Buchem disease gene (SOST) region are associated with bone-mineral density in elderly whites. Am JHum Genet 2004;75:1032-45.

14. Sims AM, Shephard N, Carter K, Doan T, Dowling A, Duncan EL, et al. Genetic analyses in a sample of individuals with high or low BMD shows association with multiple Wnt pathway genes. J Bone Miner Res 2008;23:499-506.

15. Huang QY, Li GH, Kung AW. The -9247 T/C polymorphism in the SOST upstream regulatory region that potentially affects C/EBPalpha and

FOXA1 binding is associated with osteoporosis.

Bone 2009;45:289-94.

16. Komulainen M, Kroger H, Tuppurainen MT, Heikkinen AM, Alhava E, Honkanen R, et al.

Prevention of femoral and lumbar bone loss with hormone replacement therapy and vitamin D3 in early postmenopausal women: a population-based 5-year randomized trial. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:546-52.

17. Komulainen M, Kroger H, Tuppurainen MT, Heikkinen AM, Honkanen R, Saarikoski S. Iden- tification of early postmenopausal women with no bone response to HRT: results of a five-year clinical trial. Osteoporosis Int2000;11:211-8.

18. Kim JG, Choi YM, Moon SY, Lee JY. Association of the calcitonin gene (CA) polymorphism with bone mass and bone responsiveness to hormone therapy in postmenopausal Korean women. Menopause 2003;10:544-9.

19. Piters E, de Freitas F, Nielsen TL, Andersen M, Brixen K, Van Hul W. Association study of polymorphisms in the SOST gene region and parameters of bone strength and body composition in both young and elderly men: data from the Odense Androgen Study. Calcif Tissue Int 2012;

90:30-9.

20. Ohnaka K, Yamamoto K, Nakamura K, Adachi M, Kawate H, Kono S, et al. Association of single nucleotide polymorphisms in secreted frizzled- related protein 1 gene with bone mineral density in Japanese women. Geriatr Gerontol Int 2009;9:304- 9.

21. Lee DY, Kim H, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG. Association between polymorphisms in Wnt signaling pathway genes and bone mineral density in postmenopausal Korean women. Menopause 2010;17:1064-70.

22. Mencej-Bedrac S, Prezelj J, Kocjan T, Komadina

R, Marc J. Analysis of association of LRP5, LRP6,

SOST, DKK1, and CTNNB1 genes with bone

mineral density in a Slovenian population. Calcif Tissue int 2009;85:501-6.

23. Balemans W, Foernzler D, Parsons C, Ebeling M, Thompson A, Reid DM, et al. Lack of association between the SOST gene and bone mineral density in perimenopausal women: analysis of five poly- morphisms. Bone 2002;31:515-9.

24. Deng HW, Li J, Li JL, Johnson M, Gong G, Davis KM, et al. Change of bone mass in postmenopausal Caucasian women with and without hormone replacement therapy is associated with vitamin D receptor and estrogen receptor genotypes. Hum Genet 1998;103:576-85.

25. Kurabayashi T, Tomita M, Matsushita H, Yahata T, Honda A, Takakuwa K, et al. Association of vitamin D and estrogen receptor gene poly- morphism with the effect of hormone replacement therapy on bone mineral density in Japanese women. Am JObstet Gynecol 1999;180:1115-20.

26. Jonhston CC Jr, Hui SL, Witt RM, Appledorn R, Baker RS, Longcope C. Early menopausal changes in bone mass and sex steroids. J Clin Endocrinol 1985;61:905-11.

27. Spencer GJ, Utting JC, Etheridge SL, Arnett TR, Genever PG. Wnt signalling in osteoblasts regulates expression of the receptor activator of NFkappaB ligand and inhibits osteoclastogenesis in vitro. J Cell Sci 2006;119:1283-96.

28. Rogers A, Eastell R. Circulating osteoprotegerin and receptor activator for nuclear factor kappaB ligand: clinical utility in metabolic bone disease assessment. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:6323- 31.

29. Chun S, Kim MR, Lee BS, Yoon BK, Kang BM,

Choi H, et al. Bone response to hormone therapy

according to basa bone mineral density and

previous response to hormone therapy. J Korean

Soc Menopause 2012;18:15-27.