Influence of Pathogen Inactivation on the Quality of Platelet Rich Plasma Derived Platelets

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Received on July 29, 2013. Revised on August 8, 2013. Accepted on August 9, 2013 Correspondence to: So-Yong Kwon

Blood Transfusion Research Institute, Korean Red Cross, 764 Sanggye 6.7-dong, Nowon-gu, Seoul 139-831, Korea Tel: 82-2-3210-0380, Fax: 82-2-3210-0340, E-mail: [email protected]

This research was supported by a grant (2010-E34005-00) from the Korea Center for Disease Control & Prevention.

Original Article

병원체 불활화가 혈소판 풍부 혈장 유래 혈소판제제의 품질에 미치는 영향 평가

권소영¹ㆍ강재원¹ㆍ조연정¹ㆍ조남선²ㆍ남기열³ㆍ장윤환⁴ㆍ한태희⁵ㆍ이상원⁶

대한적십자사 혈액수혈연구원¹, 혈액관리본부², 서울남부혈액원³, 한국원자력의학원 원자력병원 진단검사의학과⁴, 인제대학교 의과대학 상계백병원 진단검사의학교실⁵, 질병관리본부 감염병센터 백신연구과⁶

Influence of Pathogen Inactivation on the Quality of Platelet Rich Plasma Derived Platelets

So-Yong Kwon¹, Jae Won Kang¹, Youn Jung Cho¹, Nam-Sun Cho², Gy Youl Nam³, Yoon Hwan Chang⁴, Tae Hee Han⁵, Sang Won Lee⁶

Blood Transfusion Research Institute¹, Blood Service Headquarters², Seoul Nambu Blood Center³, Korean Red Cross, Department of Laboratory Medicine, Korea Cancer Center Hospital, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences⁴, Department of Laboratory Medicine, Sanggyepaik Hospital, College of Medicine, Inje University⁵, Seoul, Division of Vaccine Research, Center for Infectious Disease, Korea National Institute of Health, Korea Center for Disease Control & Prevention⁶, Osong, Korea

Background: Pathogen inactivation (PI) is a proactive approach to overcome the limitations of the current testing system and donor questionnaires. Effect of PI on non-leukoreduced platelet rich plasma derived platelets (PRP-PLTs) suspended in plasma has not yet been evaluated. This study was conducted in order to evaluate the effect of PI on the quality of non-leukoreduced PRP-PLTs suspended in plasma.

Methods: PRP-PLTs treated with the Mirasol PRT System and the Intercept Blood System were tested for PLT count, blood gas, PLT activation, and apoptosis on days 3, 5, and 7 of storage.

Results: PLT number showed a decrease after PI. No difference in pH was observed until day 5. At day 7, PLTs treated with Mirasol had a lower pH value (6.5), however, it satisfied the quality control criteria. PLTs treated with Mirasol had a lower pO2 compared to pre-inactivation PLTs. pO2 during storage differed significantly between the two PI groups. pCO2 showed a decrease after inactivation and both groups showed a significant difference, compared with the control. PLTs treated with Mirasol had increased P-selectin expression after inactivation; however, difference of P-selectin during storage was not significant compared to the control. P-selectin of PLTs treated with Intercept was significantly different compared to those treated with Mirasol and control. Annexin V showed an increase after inactivation in Mirasol treated PLTs and difference during storage was significant compared to control and Intercept.

Conclusion: As both PI systems showed satisfactory pH values, the criteria showing a high correlation with in vivo PLT viability and generally applied to monitor quality of PLTs, quality of PRP-PLTs after PI appears not to be negatively affected. (Korean J Blood Transfus 2013;24:128-139)

Key words: Pathogen inactivation, PRP-PLT, Quality

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서 론

헌혈혈액 선별검사법의 개선, 핵산증폭검사 (nucleic acid amplification test, NAT)의 도입 그리 고 보다 엄격한 헌혈자 선별기준의 적용으로 인 해 수혈로 인한 감염(transfusion-transmitted in- fection, TTI)의 위험은 현저하게 감소하였다. 그 럼에도 불구하고 TTI 발생사례가 계속 보고되고 있는데, 이는 현재 사용하고 있는 검사 기법이 갖 는 검출 능력의 한계, 검사를 적용하고 있지 않는 병원체 그리고 새로이 확인되는 수혈 감염 병원 체가 주요 요인이 된다.^1,2)

오늘날 가장 중요한 감염성 수혈부작용으로 대두되고 있는 세균에 의한 혈액오염의 경우 일 부 선진국에서는 배양법(culture method)으로 검 사를 시행하고 있으나 배양법 고유의 민감도 문 제, 검사술식의 제한점 등 검사방법의 한계가 있 어 세균에 의한 혈액오염은 아직 해결되어야 할 문제로 남아 있다.³⁾ 또한 웨스트나일 바이러스 (West Nile virus, WNV)나 치쿤군야 바이러스 (Chinkungunya virus)와 같은 병원체의 출현은 전 세계적으로 혈액의 안전성이 계속 위협받을 수 있고 현재 적용하고 있는 선별검사와 헌혈자 문 진이 이들 병원체에 대한 안전장치가 되지 못한 다는 것을 입증해주고 있다.²⁾

수혈용 혈액의 안전을 보증하기 위해서 윈도 우기(window period)를 단축하고 민감도를 향상 시키기 위해 검사시스템의 성능을 지속적으로 개 선하고 새로운 검사항목을 도입할 필요성에 대해 서는 논란의 여지가 없다. 그러나 이미 알려진 수 혈전파성 병원체나 새로 출현하는 병원체(emerging pathogen) 모두에 대해 검사를 도입하거나 헌혈자 배제 기준을 적용하는 것이 현실적으로 불가능하다는 것도 명백하다. 새로 출현하는 병 원체의 경우 병원체를 인지하기 이전에 감염성

혈액이 이미 수혈될 수 있고, 이들 병원체에 의한 위험을 인지하고 이에 대한 대응책을 적용하기까 지 상당한 시간이 필요하기 때문에 환자들은 위 험에 노출될 수 있다. 또한 이들 병원체는 혈액의 안전성뿐만 아니라 혈액의 수급에도 파급효과가 있어 혈액사업 전체를 위협할 수 있다. 이러한 배 경하에 병원체 불활화(pathogen inactivation, PI)는 현행 검사체계나 헌혈자 문진의 한계를 극복할 수 있는 대안으로 제시되고 있다.^4,5)

PI는 매우 전향적인 기술로 바이러스, 세균, 원 생동물 등 다양한 병원체에 대해 효과가 있는 것 으로 알려져 있다.^6-9) PI 기법은 buffy coat법에 의 한 혈소판제제(buffy-coat derived platelets, BC- PLT) 또는 성분채혈혈소판제제(apheresis platelets, A-PLT) 등 유럽의 혈액제제 제조 시스템에 맞추어 개발되었으며 현재 유럽을 중심으로 사용 되고 있다.¹⁰⁾ 지금까지의 연구결과들은 백혈구가 제거되고 혈소판첨가제(platelet additive solution) 를 사용한 BC-PLT 또는 A-PLT에 대한 자료로 백 혈구가 제거되지 않고 혈소판첨가제를 사용하지 않은 혈소판 풍부 혈장 유래 혈소판제제(platelet rich plasma derived platelets, PRP-PLT)에 대해서 는 검증자료가 없는 실정이다. 본 연구에서는 PRP-PLT에 대해 현재 상용화되어 있는 두 가지 PI 기법을 적용하여 혈소판제제의 품질 변화를 평가하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 혈소판제제의 제조

PRP-PLT 중 ALT 검사 결과로 인하여 부적격 으로 판정된 혈액제제를 사용하였으며, 해당 혈 액제제의 사용에 대해서는 대한적십자사 연구윤 리위원회의 승인을 득하였다. 평가에 사용하는

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Fig. 1. Procedure for pooling and aliquoting of platelet rich plasma derived platelets (PRP-PLT) for evaluation of the effect of pathogen inactivation on platelets.

두 종의 PI 시스템에서의 조건을 동일하게 하기 위하여 14단위 이상의 PRP-PLT를 Acrodose PL system (Pall Corporation, NY, USA)과 무균백줄 봉 합기(TSCD SC-201A, Terumo Corporation, Tokyo, Japan)를 이용하여 혼합한 후 대조군으로 사용할 미처리군 50 mL과 Mirasol 처리군과 Intercept 처 리군 각각 275 mL로 삼 등분하였다(Fig. 1). 보존 기간 및 혈액형에 의한 영향을 배제하기 위하여 동일 채혈일과 동일 혈액형의 PRP-PLT를 혼주하 였다. 총 144단위의 PRP-PLT가 사용되었으며, 혈 액형별로는 A형이 84단위 O형과 B형이 각각 30 단위씩 사용되었다. PI 처리는 채혈 후 최대 48시 간이 경과한 혈소판제제에 대해서 이루어졌다.

PI 처리 전과 채혈 후 3일, 5일(상황에 따라 4일

또는 6일) 및 7일째 검체를 채취하여 평가에 사용 하였다. 4일 또는 6일째의 검사결과는 5일째 검 사결과로 취급하여 분석하였다.

2. 병원체 불활화 기법

현재 임상적으로 적용되고 있는 Mirasol PRT System (Terumo BCT Inc, Co, USA)과 Intercept Blood System (Cerus Corporation, CA, USA)을 사 용하였다.

1) Mirasol PRT System

Mirasol PRT System에서는 리보플라빈(riboflavin, vitamin B2)을 혈소판제제에 혼합한 후 265∼

370 nm 파장 영역의 자외선(UV)을 약 10분간 조 사하여 병원체 핵산의 비가역적인 광-산화 손상

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Fig. 2. Workflow of Mirasol PRT System for pathogen inactivation of platelets.

Fig. 3. Workflow of Intercept Blood System for pathogen inactivation of platelets.

(photo-oxidative damage)을 일으키게 된다(Fig. 2).

이 시스템에서는 PI 처리 후 추가적인 처리과정 없이 혈소판제제를 수혈할 수 있다.

2) Intercept Blood System

Intercept Blood System은 소랄렌(psoralen) 화합 물의 한 종류인 amotosalen (S-59)을 사용하고 있 으며 자외선 A (UVA, 320∼400 nm)를 약 4분간 조사하여 병원체의 핵산을 비가역적으로 교차결 합(cross-linking)하여 병원체를 불활화시킨다(Fig.

3). UVA 조사 후 반응하지 않은 amotosalen과 광 반응물질(photoproduct)을 제거하기 위해서 불활 화 처리한 혈소판제제를 compound adsorption de- vice (CAD)를 함유하고 있는 백으로 옮겨서 혈소 판 부란기에서 16∼24시간 동안 보관한다. 이후 혈소판을 최종 백으로 옮겨 수혈할 수 있다.

3. 혈소판제제의 품질 평가

혈소판제제의 품질평가를 위해 모든 항목에 대해 검사를 이중으로 시행하였으며 평균값을 사 용하였다.

1) 혈소판 수 및 혈액가스 검사

혈소판 수는 KX21 (Sysmex, Kobe, Japan)를 이 용하여 검사하였고 혈액가스는 Rapidlab 1265 (Siemens, Leverkusen, Germany)를 사용하여 검사

하였다.

2) 혈소판 활성화 및 Apoptosis 평가

(1) P-selectin (CD62p) 검사: 검체 내 혈소판 수를 확인 후 phosphate-buffered saline (PBS)로 세 포수가 1.0×10⁴/uL가 되도록 조정하였다. 유세포 분석용 시험관에 혈소판 100 uL를 넣고 음성대조 혈청 IgG1-FITC (Beckman Coulter, Marseille, France)와 IgG1-PE (Beckman Coulter)를 각각 20 uL씩 한 시험관에 첨가하였다. 나머지 시험관에 는 CD41-FITC (Beckman Coulter)와 CD62-PE (Beckman Coulter)를 각각 20 uL씩 첨가하였다.

Vortex 혼합기로 진탕한 후 은박지로 빛을 차단 하여 실온에 20분간 방치하였다. 각 시험관에 PBS 2 mL를 첨가한 후 잘 혼합하여 1,000 rpm에 서 10분간 원심분리하여 상청액을 버리고 2초간 vortex 혼합기로 진탕하였다. 각 시험관에 0.5%

paraformaldehyde 1 mL를 첨가한 후 즉시 잘 혼합 하여 세포를 고정하였다. 유세포분석 전까지 암 소에서 보관하였고 유세포분석에는 COULTER Epics XL (Beckman Coulter, Miami, FL, USA)를 이용하였다. 단세포군 항체에 대해 강도별 백분

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율을 산정하고 CD41과 CD62가 동시에 발현되는 강도를 측정하여 분석하였다.

(2) Total P-selectin 검사: 검사 전까지 검체를

−20^oC에서 보관 후 검사 전에 실온에서 해동하 여 human soluble P-selectin/CD62P immunoassay kit (R&D system, Minnesota, USA)를 이용하여 검 사하였다. 검체 희석액으로 모든 검체를 20배 희 석하였고, 각 농도별 6종의 표준물질은 사용 전 에 증류수에 녹여 안정화하여 사용하였다. 표준 물질, 대조용액, 검체 100 uL를 각 웰에 분주하고 sP-selectin conjugate 100 uL를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응정지액 100 uL를 넣어 반응을 정지시킨 후 30분 이내에 450 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 측정된 흡광도로 KC junior software (Biotek, Vermont, USA)를 이용하여 4-pa- rameter 회귀분석으로 total P-selectin 농도를 산출 하였다.

3) Annexin-V

검사 전까지 검체를 －20^oC에서 보관 후 검사 전에 실온에서 해동하여 Annexin-V (human) ELISA kit (Alexis biochemicals, California, USA)를 이용하여 검사하였다. 표준물질을 검체희석액으 로 2배씩 희석하여 7종(0.78∼50.00 ng/mL)의 표 준물질을 준비하였다. 각각의 표준물질 100 uL를 웰에 분주하고 검체 웰에는 검체 희석액 50 uL와 검체 50 uL를 분주하였다. 모든 웰에 biotin-conjugate 50 uL를 분주하고 실온에서 2시간 동안 100 rpm에서 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 플 레이트를 4번 세척하고 streptavidin-HRP 100 uL 를 분주하여 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반 응시켰다. 이후 플레이트를 다시 4번 세척한 후 기질용액 100 uL를 분주하고 실온에서 10분 반응 시킨 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질을 기준으로 흡광도로 회귀분석을 통해 각 검체의 농도를 구하였다.

4) 혈액배양검사

세균오염으로 인한 혈소판제제의 품질변화를 배제하기 위하여 채혈 후 5일(상황에 따라 4일 또 는 6일)에 검체 10 mL을 채취하여 호기성(BacT/

ALERT SA, Biomerieux Inc., Durham, NC, USA) 및 혐기성(BacT/ALERT SN, Biomerieux Inc., Durham, NC, USA) 배양액에 각각 5 mL씩 접종하 여 BacT/ALERT 3 D system (Biomerieux Inc., Durham, NC, USA)에 7일 동안 배양하였다.

4. 통계처리

대조군, Mirasol 처리군 및 Intercept 처리군을 위해 각각 10단위의 PRP-PLT를 사용하였으며 모 든 검사결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 각 PI 처리군의 PI 처리 전과의 결과의 차이는 paired t-test로 분석하였다. 보관일수에 따른 처리방법별 결과의 차이는 SAS ver 9.1을 사용하여 선형혼합 모형(linear mixed model) 방법으로 분석하였으며 Tukey-Kramer 법으로 다중비교를 하였다. 보관일 수에 따른 각 방법별 변화의 차이가 통계적으로 유의하지 않을 경우 보관일수에 상관없이 각 방 법들의 차이에 대한 가설검정을 하였고, 보관일 수에 따른 각 방법별 변화의 차이가 유의한 경우 에만 보관일수별로 각 방법들의 차이에 대한 가 설검정을 실시하였다. 통계학적 유의수준은 P value＜0.05를 기준으로 하였다.

결 과

1. 혈소판 수 및 혈액가스 검사

Mirasol 처리군과 Intercept 처리군 모두 불활화 처리 전에 비해 혈소판 수가 유의하게 감소하였 다(Table 1). 보관일수에 따른 혈소판 수는 두 불 활화 처리군 모두 대조군과 유의한 차이(P＜

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Table 1. Results of platelet count for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (10³/uL) (n=10)

Day 2

(pre-inactivation) Day 3 Day 5 Day 7

Control

1,435.8±151.2

1,411.6±160.0 1,386.3±150.8 1,338.4±166.5

Mirasol 1,348.3±143.0* 1,327.0±174.4 1,303.5±140.6

Intercept 1,362.7±140.3* 1,321.0±182.7 1,295.9±147.7

Values shown as mean±SD.

*P＜0.0001: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test.

Table 2. Results of pH for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (n=10) Day 2

Control

6.989±0.082

7.005±0.113 6.941±0.125 6.803±0.134

Mirasol 6.968±0.056 6.856±0.147 6.458±0.134*

Intercept 6.972±0.095 6.866±0.158 6.722±0.090

*P＜0.0001: compared to values of the control and Intercept group using Tukey-Kramer test.

Table 3. Results of pO2 for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (mmHg) (n=10) Day 2

Control

198.4±52.9

177.4±36.3 159.0±43.1 171.8±35.2

Mirasol 147.9±54.9* 154.9±58.2 151.0±40.0

Intercept 191.0±36.3 176.4±39.5 195.7±30.4

*P=0.0204: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test.

0.0001)를 보였으나, Mirasol 처리군과 Intercept 처 리군간의 혈소판 수 변화의 차이는 유의하지 않 았다(P=1.0000).

불활화 처리 전과 후의 pH는 유의한 차이가 없 었다(Table 2). 보관 5일째까지 각 방법별 pH의 차 이는 유의하지 않았으나 보관 7일째에는 Mirasol 처리군의 pH가 대조군 및 Intercept 처리군과 유

의한 차이를 보였다(P＜0.0001).

Mirasol 처리군은 불활화 처리 전에 비해 낮은 pO2 값을 보였다(Table 3). 두 불활화 처리군의 보 관일수에 따른 pO2는 대조군과 유의한 차이가 없 었으나 불활화 처리군간의 pO2의 차이는 유의하 였다(P=0.0039).

불활화 처리 후 pCO2는 두 불활화 처리군 모두

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Table 4. Results of pCO2 for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (mmHg) (n=10) Day 2

Control

51.1±9.0

40.6±10.2 33.9±17.2 21.0±11.3

Mirasol 33.1±3.7* 22.8±9.5 16.5±2.8

Intercept 34.6±7.8^† 24.4±8.6 16.0±3.4

*P=0.0002: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test; ^†P＜0.0001: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test.

Table 5. Results of P-selectin for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (%) (n=10) Day 2

Control

26.84±3.86

28.73±7.30 30.07±5.66 43.66±15.90

Mirasol 33.27±6.58* 35.51±8.21 46.35±9.13

Intercept 23.38±7.58 26.30±11.61 34.51±8.92

*P=0.0038: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test.

Table 6. Results of total P-selectin for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (ng/mL) (n=10)

Day 2

Control

18.6±7.9

15.8±5.1 16.1±4.6 17.0±4.1

Mirasol 13.9±2.9* 13.2±3.3 13.7±2.7

Intercept 15.2±6.1^† 13.5±4.2 14.5±3.5

*P=0.0312: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test; ^†P=0.0024: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test.

에서 유의하게 감소하였다(Table 4). 보관일수에 따라 두 불활화 처리군은 대조군과 유의한 차이 가 있었으나(Mirasol 처리군, P=0.0014; Intercept 처리군, P=0.0054) 처리군간의 차이는 유의하지 않았다.

2. 혈소판 활성화 평가

Mirasol 처리군은 처리 전에 비해 P-selectin (CD62p)의 발현이 유의하게 증가하였다(Table 5).

대조군과 Mirasol 처리군간에는 보관일수에 따른

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Table 7. Results of Annexin V for control, Mirasol- and Intercept-treated platelets according to storage time (ng/mL) (n=10)

Day 2

Control

0.0862±0.0296

0.0869±0.0295 0.0877±0.0295 0.0885±0.0297

Mirasol 0.0970±0.0336* 0.0980±0.0337 0.1001±0.0335

Intercept 0.0872±0.0294 0.0878±0.0306 0.0889±0.0305

*P＜0.05: comparison of day 2 & day 3 values using paired t-test.

P-selectin의 차이가 없었다. 그러나 Intercept 처리 군은 대조군(P=0.0241) 및 Mirasol 처리군(P＜

0.0001)과 유의한 차이를 보였다.

Mirasol 처리군과 Intercept 처리군 모두 불활화 처리 후 total P-selectin이 유의하게 감소하였다 (Table 6). 두 불활화 처리군 모두 보관일수에 따 라 대조군과 유의한 total P-selectin의 차이를 나타 냈으나(Mirasol 처리군, P＜0.0001; Intercept 처리 군, P=0.0012) 처리군간의 차이는 유의하지 않았 다.

Mirasol 처리군은 불활화 처리 전에 비해 유의 하게 높은 Annexin V 결과를 보였으며(Table 7), 보관일수에 따라 대조군 및 Intercept 처리군과 유 의한 차이를 보였다(P＜0.0001).

3. 혈액배양검사

혈액배양검사에서 세균의 증식은 확인되지 않 았다.

고 찰

병원체 처리 이후 혈소판 수는 처리 전에 비해 Mirasol PRT System과 Intercept Blood System에서 각각 6.1% 및 5.1% 감소하였다. 식품의약품안전 처 생물학적제제 기준 및 시험방법의 혈소판제제

에 대한 기준 중 혈소판 수는 400 mL 유래 혈소 판제제의 경우 단위당 4.9×10¹⁰개(약 1.0×10⁶/uL) 이상이므로 두 시스템 모두 기준을 만족시켰다.

혈소판 수의 감소는 병원체 불활화를 위해 혈소 판을 자외선 조사용 혈액백이나 최종 혈액백으로 옮기는 과정에서 혈소판이 일부 소실될 수 있기 때문에 예상할 수 있었던 결과로 기존의 연구에 서도 병원체 불활화 처리로 혈소판 수가 감소하 는 것으로 보고하고 있다.^11,12)

혈소판제제를 육안으로 관찰시 소용돌이(swir- ling) 현상을 확인할 수 있는데 이는 원반형태 (discoid shape)의 혈소판이 빛을 굴절시키기 때문 에 나타나는 것이다.¹³⁾ 혈소판제제의 pH가 감소 하면 혈소판의 형태가 원반에서 구형(sphere shape)으로 바뀌고 소용돌이 현상도 없어지는데 이는 일반적으로 pH가 6.0 이하로 떨어질 경우 발생한다. 혈소판제제의 pH가 6.0에 근접하면 혈 소판은 alpha- 및 dense-granule의 내용물을 방출 하고 위족(pseudopod)을 형성하여 더 이상의 기능 을 하지 못한다.^13,14) 생체 외(in vitro) 혈소판 품질 지표와 생체 내(in vivo) 혈소판의 생존율의 상관 성을 평가한 연구에서 젖산 생성과 pH가 혈소판 의 생존과 가장 높은 상관성이 있는 것으로 보고 되었다.¹⁵⁾ 본 연구에서 pH는 5일째까지 각 군간 에 차이가 없었다. 7일째 검체에서 Mirasol PRT

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System으로 처리한 제제의 pH가 다른 군에 비해 유의하게 감소하였으나 유효기간 종료일에 측정 한 pH가 6.2 이상이어야 한다는 질병관리본부 혈 액원 표준업무 안내서의 품질기준을 만족시켰으 며 Mirasol PRT System으로 처리된 혈소판제제는 5일 보관용으로 CE 승인을 받았기 때문에 임상 적인 의미는 없다. 문헌에서도 본 연구결과와 유 사하게 두 시스템 모두에서 7일째까지 pH가 잘 유지되는 것으로 보고되고 있다.^12,16)

혈소판은 세포질에서 일어나는 혐기성 해당과 정(glycolysis)와 미토콘드리아 내에서 일어나는 산소 의존성 산화적인산화(oxygen-dependent oxidative phosphorylation)를 통해서 ATP를 생성한 다.¹⁶⁾ ATP 생성의 약 80%는 산화적인산화를 통 해서 이루어지는데 산소가 없는 상태에서는 해당 과정을 통한 젖산의 생성이 약 5배 가량 증가하 고 pH의 감소를 유발하기 때문에 보관기간 동안 높은 pO2와 낮은 pCO2 수준을 유지하는 것이 중 요하다. 본 연구에서 pO2는 대조군 및 불활화 처 리군에서 모두 높은 수준을 유지하고 있었다.

Mirasol PRT System 처리군에서의 pO2가 Intercept Blood System 처리군에 비해 낮은 수치를 보였는 데 이는 Picker 등¹⁷⁾의 연구결과와 유사하였다. 이 들의 연구에서 Mirasol PRT System 처리 혈소판 제제에서는 낮은 pO2 수준과 함께 산소소모율이 증가하였는데, 이는 해당과정과 산화적인산화가 모두 상향 조절된 것의 결과라고 해석하였다. 반 면 Intercept Blood System 처리군에서는 산소소모 율이 현저하게 감소하였는데, 이는 미토콘드리아 를 통한 ATP 생성이 저해되었다는 것을 시사한 다고 하였다. 본 연구에서는 산소소모율을 평가 하지 않았기 때문에 이를 직접적으로 확인할 수 는 없었다. pCO2는 기존의 연구결과와 유사하게 보관기간에 따라 감소하였다.^12,17)

P-selectin은 alpha-granule의 막단백으로 안정화

된 혈소판의 경우 alpha-granule 내막에 존재한다.

혈소판이 활성화되면 alpha-granule이 혈소판의 세포막과 융합하여 p-seletin이 혈소판 표면에 분 포하게 된다. 따라서 혈소판 표면에 P-selectin 발 현의 증가는 혈소판 활성화를 반영하는 것으로 보고되고 있다.¹⁸⁾ 그러나 P-selectin 발현의 임상적 의미에 대해서는 상반된 결과들이 보고되고 있 다. Dumont 등¹⁹⁾은 P-selectin의 발현 정도가 혈소 판 회수율 및 수혈 후 생존율과 역의 상관관계가 있다고 보고하였으나 Berger 등¹⁸⁾은 P-selectin 발 현이 혈소판의 생존율에 영향을 주지 않으며 P-selectin이 혈소판 표면에 발현된 이후 100 kD의 P-selectin fragment로 분해된다고 하여 결과 해석 시 주의가 필요하다. 본 연구에서 Mirasol PRT System 처리군과 대조군간의 P-selectin 발현은 차 이가 없는 반면 Intercept Blood System으로 처리 한 혈소판에서 P-selectin 발현의 증가가 다른 두 군에 비해 유의하게 낮았다. 일반적으로 대조군 에 비해 불활화 처리한 혈소판에서 P-selectin이 더 많이 발현된다는 보고와는 다른 결과이다.^11,20) 일본 적십자사에서 평가한 결과에서는 Mirasol PRT System으로 처리한 혈소판의 P-selectin 발현 은 대조군에 비해 유의하게 증가하였지만 Inter- cept Blood System 처리군과 대조군간에는 차이 가 없었다.²¹⁾ P-selectin이 연구에 따라 차이가 나 는 것은 앞서 설명한 P-selectin 자체의 특성 때문 일 수도 있지만 기존에 발표된 결과들은 BC-PLT 또는 A-PLT를 대상으로 한 연구결과이기 때문에 PRP-PLT를 대상으로 한 본 연구결과와 직접적인 비교를 하기에는 한계가 있다. 또한 혈소판 활성 화는 혈소판 보관백, 혈소판제제에 포함된 혈장 량 등 혈소판을 보관하는 조건과 백혈구제거와 같은 추가 조작 등에 의해서도 영향을 받기 때문 에 P-selectin에 대한 결과를 비교하기 위해서는 동일 조건의 혈소판에 대한 결과를 비교하는 것

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이 필요하다.

Phosphatidylserine (PS)은 세포 내막에 분포하 는데 세포가 apoptosis 과정을 거치게 되면 PS가 세포막 표면에 노출된다. Annexin V는 PS에 높은 친화력을 갖기 때문에 apoptosis에 대한 지표로 이용되고 있다.²²⁾ Annexin V는 Mirasol PRT System 처리군에서 다른 두 군에 비해 높은 수치 를 보였다. 이는 Mirasol PRT System이 대조군 및 Intercept Blood System에 비해 더 낮은 증가량을 보인 Picker 등¹⁷⁾의 보고와는 상반된 결과이다. 그 러나 혈소판 활성화처럼 apoptosis도 혈소판제제 의 제조방법, 보관조건 등의 영향을 받을 수 있으 므로 직접적인 비교가 어려웠다.²²⁾

본 연구는 동일 전혈 유래 PRP-PLT를 대상으 로 두 가지 병원체 불활화 기법을 적용하여 혈소 판에 대한 영향을 처음으로 시도한 연구이다. 혈 소판 활성화와 apoptosis 관련 지표는 Intercept Blood System으로 처리한 혈소판제제가 더 우수 한 결과를 보여주었다. 그러나 이들 지표와 생체 내 혈소판의 생존율에 대해서는 다양한 결과가 보고되고 있어 이를 혈소판제제의 품질과 직결시 키는 것은 무리가 있다고 본다. 혈소판의 생체 내 생존율과 상관성이 높고 혈액관리 업무에서 일반 적으로 적용하고 있는 혈소판제제의 품질관리기 준인 pH를 두 시스템 모두가 만족시키고 있어서 두 시스템 모두에서 병원체 불활화 후에도 PRP- PLT의 품질이 유지되는 것으로 판단된다.

요 약

배경: 병원체 불활화는 전향적인 기술로 현행 검사체계나 헌혈자 문진의 한계를 극복할 수 있 는 대안으로 제시되고 있다. 백혈구가 제거되지 않고 혈소판첨가제를 사용하지 않은 혈소판 풍부 혈장 유래 혈소판제제에 대한 병원체 불활화 영

향에 대한 검증자료가 없는 실정이다. 본 연구에 서는 병원체 불활화 처리 후 혈소판 풍부 혈장 유 래 혈소판제제의 품질 변화를 평가하고자 하였 다.

방법: Mirasol PRT System과 Intercept Blood System으로 처리한 혈소판제제에 대해 채혈 후 3 일, 5일 및 7일째 혈소판 수 및 혈액가스 검사와 혈소판 활성화 및 apoptosis에 대한 검사를 시행 하였다.

결과: 혈소판 수는 불활화 처리 전에 비해 감소 하였다. pH는 보관 5일째까지 유의한 차이가 없 었고, 보관 7일째 Mirasol 처리군의 pH가 6.5로 낮 은 값을 보였으나 품질관리기준은 만족시켰다.

Mirasol 처리군은 불활화 처리 전에 비해 낮은 pO2 값을 보였고 두 불활화 처리군간 보관일수에 따른 pO2는 유의한 차이를 보였다. pCO2는 불활 화 처리 후에 모두 감소하였으며 보관일수에 따 라 대조군과 유의한 차이를 보였다. P-selectin은 Mirasol 처리군에서 불활화 처리 후 증가하였으 나 대조군과는 보관일수에 따른 유의한 차이가 없었다. 반면 Intercept 처리군은 대조군 및 Mira- sol 처리군과 유의한 차이를 보였다. Annexin V는 Mirasol 처리군에서 불활화 처리 전에 비해 증가 하였고 보관일수에 따라 대조군 및 Intercept 처리 군과 유의한 차이가 있었다.

결론: 혈소판의 생체 내 생존율과 상관성이 높 고 혈액관리 업무에서 일반적으로 적용하고 있는 품질관리기준인 pH를 두 시스템 모두 만족시키 고 있어서 두 시스템 모두에서 병원체 불활화 후 에도 혈소판 풍부 혈장 유래 혈소판제제의 품질 이 유지되는 것으로 판단된다.

References

1. Schmidt M, Korn K, Nübling CM, Chudy M,

(11)

Kress J, Horst HA, et al. First transmission of human immunodeficiency virus Type 1 by a cellular blood product after mandatory nucleic acid screening in Germany. Transfusion 2009;

49:1836-44

2. Stramer SL, Hollinger FB, Katz LM, Kleinman S, Metzel PS, Gregory KR, et al. Emerging infectious disease agents and their potential threat to transfusion safety. Transfusion 2009;

49 Suppl 2:1S-29S

3. Dreier J, Störmer M, Pichl L, Schottstedt V, Grolle A, Bux J, et al. Sterility screening of platelet concentrates: questioning the optimal test strategy. Vox Sang 2008;95:181-8

4. Bryant BJ, Klein HG. Pathogen inactivation:

the definitive safeguard for the blood supply.

Arch Pathol Lab Med 2007;131:719-33 5. Webert KE, Cserti CM, Hannon J, Lin Y,

Pavenski K, Pendergrast JM, et al. Proceedings of a Consensus Conference: pathogen inactivation-making decisions about new technologies. Transfus Med Rev 2008;22:1-34 6. Ruane PH, Edrich R, Gampp D, Keil SD,

Leonard RL, Goodrich RP. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion 2004;44:877-85

7. Lin L, Hanson CV, Alter HJ, Jauvin V, Bernard KA, Murthy KK, et al. Inactivation of viruses in platelet concentrates by photochemical treatment with amotosalen and long- wavelength ultraviolet light. Transfusion 2005;

45:580-90

8. Cardo LJ, Salata J, Mendez J, Reddy H, Goodrich R. Pathogen inactivation of Trypa- nosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.

Transfus Apher Sci 2007;37:131-7

9. Grellier P, Benach J, Labaied M, Charneau S, Gil H, Monsalve G, et al. Photochemical

inactivation with amotosalen and long-wavelength ultraviolet light of Plasmodium and Babesia in platelet and plasma components.

Transfusion 2008;48:1676-84

10. AABB. Listing of countries in which pathogen reduction technology systems and products are in routine use. http://www.aabb.org/re- sources/bct/eid/Documents/prt-systems-in- use-country-listing.pdf [Online] (last visited on 25 June 2013)

11. Perez-Pujol S, Tonda R, Lozano M, Fuste B, Lopez-Vilchez I, Galan AM, et al. Effects of a new pathogen-reduction technology (Mirasol PRT) on functional aspects of platelet concentrates. Transfusion 2005;45:911-9

12. Isola H, Kientz D, Aleil B, Laeuffer P, Weil J, Wiesel ML, et al. In vitro evaluation of Haemonetics MCS+ apheresis platelet concentrates treated with photochemical pathogen inactivation following plasma volume reduction using the INTERCEPT Preparation Set.

Vox Sang 2006;90:128-30

13. Rinder HM, Snyder EL. Activation of platelet concentrate during preparation and storage.

Blood Cells 1992;18:445-56

14. Kilkson H, Holme S, Murphy S. Platelet metabolism during storage of platelet concentrates at 22 degrees C. Blood 1984;64:406-14 15. Goodrich RP, Li J, Pieters H, Crookes R, Roodt

J, Heyns Adu P. Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects. Vox Sang 2006;90:

279-85

16. Li J, Lockerbie O, de Korte D, Rice J, McLean R, Goodrich RP. Evaluation of platelet mito- chondria integrity after treatment with Mirasol pathogen reduction technology. Transfusion 2005;45:920-6

17. Picker SM, Schneider V, Oustianskaia L, Gathof BS. Cell viability during platelet stor-

(12)

age in correlation to cellular metabolism after different pathogen reduction technologies.

18. Berger G, Hartwell DW, Wagner DD. P- Selectin and platelet clearance. Blood 1998;92:

4446-52

19. Dumont LJ, AuBuchon JP, Whitley P, Herschel LH, Johnson A, McNeil D, et al. Seven-day storage of single-donor platelets: recovery and survival in an autologous transfusion study.

20. Picker SM, Speer R, Gathof BS. Functional characteristics of buffy-coat PLTs photoche- mically treated with amotosalen-HCl for

pathogen inactivation. Transfusion 2004;44:

320-9

21. Ministry of Health, Labor and Welfare.

http://www.mhlw.go.jp/shingi/2008/07/dl/

s0723-4g.pdf [Online] (last visited on 25 July 2013)

22. Metcalfe P, Williamson LM, Reutelingsperger CP, Swann I, Ouwehand WH, Goodall AH.

Activation during preparation of therapeutic platelets affects deterioration during storage: a comparative flow cytometric study of different production methods. Br J Haematol 1997;

98:86-95