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목 적 :연골 육종 및 다발성 골연골종의 이차적 악성 변화에 의한 연골육종에서의 변화된 p53과 MDM-2 단백의 발현 양상을 알아보고자 한다.
대상 및 방법 : 1984년 1월부터 2000년 4월까지 본원에서 치료를 받은 다발성 골연골종 환자 18명을 I군으로, 다발성 골연골종의 이차적 악성 변화에 의한 연골육종 환자 6명을 II군으로, 그리고 원발성 연골육종 환자 9명을 III군으로 분류하여 각 군의 p53과 MDM-2 유전자 단백질의 발현 양상을 관찰하였다. 본 원에 보관된 파라핀 포배 조직을 실험에 사용하였으며, 실험 방법은 단클론성 항체로 anti-p53 antibody, DOA7과 anti-MDM-2 antibody IF2를 이용한 Strep- tavidin-Biotin peroxidase방법을 이용하였으며, 각각의 환자 군에서의 p53과 MDM-2 단백질의 변화와 악성 군에서의 조직학적 등급과의 관계 등을 비교 분 석하였다.
결 과 : p53 유전자의 변화는 각 군간에 통계학적으로 유의성(p<0.005)이 있는 차이를 보였다. MDM-2 단백질의 변화는 I군과 II, III군간에서는 유의한 차 이를 보였으나, II군과 III군간의 비교에서는 통계학적 유의성은 없었다. p53과 MDM-2 유전자 단백질의 동시 발현은 III군에서 가장 흔하였으며, 각 군간에 유의한 차이를 보였으며, 또한 이러한 변화는 조직학적으로 등급이 높은 경우에 더 흔하게 발현이 되는 것으로 나타나 밀접한 연관성이 있는 것으로 나타 났다. 악성 종양 환자중 추시가 가능하였던 환자들의 5년 생존율은 약 70%로 나타났다. 특히 사망의 예는 두 유전자의 단백질 발현이 모두 나타났으며 조 직학적 등급은 Grade III였다. 따라서 p53과 MDM-2 유전자 단백질의 변화 유무가 예후와 관계가 있음을 알 수 있었다.
결 론 :다발성 골연골종 환자에서 p53과 MDM-2 단백의 동시 변화는 관찰할 수 없었으나 각각의 발현은 일부 예에서 관찰되어 향후 추시 검사 및 연구가 필요할 것으로 사료되며 이러한 연구자료가 다발성 골연골종에서 이차적으로 발생하는 악성변화를 보다 조기에 감지하여 완전 악성변화 이전에 적극적인 치료 방법 등의 개발에 기초자료로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
색인 단어 : 연골육종, p53단백, MDM-2단백
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원발성 연골육종과 다발성 골연골종의 이차적 악성변화에 의한 연골육종에서 p53과 MDM-2 단백질의 변화
양준영∙이광진∙이준규∙김영모∙강 찬∙안성환∙유천환
충남대학교 의과대학 정형외과학교실
763 763 통신저자 : 양 준 영
대전광역시 중구 대사동 640 충남대학교병원 정형외과학교실
TEL: 042-220-7351∙FAX: 042-252-7098 E-mail: [email protected]
Expressions of the p53 and MDM-2 Genes in Primary Chondrosarcoma and Secondary Chondrosarcoma from Osteochondromatosis
Jun-Young Yang, M.D., Kwang-Jin Rhee, M.D., June-Kyu Lee, M.D., Young-Mo Kim, M.D., Chan Kang, M.D., Sung-Hwan Ahn, M.D., and Cheon-Hwan Ryou, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon, Korea
Purpose:To evaluate the relationships between mutations of the p53 and MDM-2 proteins in human primary chondrosarcoma and in sec- ondary chondrosarcoma from osteochondromatosis.
Materials and Methods:From January, 1984 to April, 2000, 33 cases were grouped into three categories: Group I, osteochondromatosis (18 cases), group II, secondary chondrosarcoma (6 cases), group III, primary chondrosarcoma (9 cases). We analysed the expressions of the p53 and MDM-2 proteins. All specimens were embedded in paraffin and stained using the Streptavidin-Biotin peroxidase method with anti-p53 antibody, and DO7 anti-MDM-2 antibody IF2 as monoclonal antibody.
Results: The expressions of the p53 and MDM-2 proteins, the pathologic grade of each group, and clinical outcomes were compared and analysed. The expressions of the p53 and MDM-2 proteins in each group were significantly different (p<0.05). However, MDM-2 protein expression was similar between group II and III. Both p53 and MDM-2 protein were expressed most frequently in group III and this was significant. There was an increased manifestation of the p53 and MDM-2 protein in the higher pathologic grade. The 5-year survival rate of patients with a malignant tumor was about 70%. In expired patients, the histologic grade was grade III, and both proteins were expressed, which enabled a relationship to be established between p53 and MDM-2 protein expression and a poorer prognosis.
Conclusion:In osteochondromatosis, the coexpression of the p53 and MDM-2 proteins was not observed, but isolated p53 or MDM-2 expression was observed in some cases. According to this study, it is helpful as a basic study for early detection of malignant translation of osteochondromatosis. In conclusion, we suggest that the expressions of the p53 and MDM-2 proteins are useful indicators of prognosis.
Key Words: Chondrosarcoma, p53, MDM-2 protein
Address reprint requests to Jun-Young Yang, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, College of Medicine, Chungnam National University, 640 Daesa-dong, Jung-gu, Daejeon 301-721, Korea
Tel: +82.42-220-7351, Fax: +82.42-252-7098 E-mail: [email protected]
최근 정형외과 영역에서도 골 및 연부조직 육종에서의 생물학 적 표지자에 대한 연구가 많이 시행되고 있다. 그 중 암 형성 억 제 유전자 p53은 17번 염색체에 존재하는 것으로 정상 세포의 성장과 분화에 필수적인 요소이며, 이 유전자의 변이는 종양 형 성의 마지막 단계에서 발생되는 것으로 다양한 종양에서 발견되 나 골육종이나 연골육종에서 약 30%에서 p53 단백의 변화와 p53 단백질의 과표현이 있는 것으로 보고되고 있다1,4,13,19,25). 또 한 연골육종에서의 변화된 p53 유전자의 존재는 전이와 생존율 에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다3,5,18). 그리고 p53의 변 이는 murine double minute-2 (MDM-2) 유전자의 증폭을 유 발하는 것으로 알려져 있으나14,26,27,30,31,33), 현재까지 p53 유전자 의 변화에 대한 연구는 주로 골육종에서 이루어져 왔으며, 연골 육종을 대상으로 p53과 MDM-2 유전자의 변화에 대한 연구는 미약한 실정이다. 다발성 골연골종은 약 5 내지 25%에서 악성 변화를 일으키는 것으로 보고되고 있으나1,5,23,27), 이차적으로 악 성변화에 의한 연골육종에서 p53과 MDM-2 유전자의 변화에 대한 연구는 현재까지 많지 않다7,26). 저자들은 원발성 연골육종 과 다발성 골연골종의 속발성 연골육종에서 p53과 MDM-2 유 전자의 변화와 연관성을 찾아보고, 이들 유전자의 변화가 환자 의 예후에 어떠한 연관이 있는가를 알아보고자 한다. 또한 다발 성 골연골종 환자에서의 두 유전자의 변화 유무를 알아봄으로써 임상적 유용성이 있는지를 파악하고자 본 연구를 시행하였다.
연구 대상 및 방법 1.
연구대상1984년 1월부터 2000년 4월까지 본원에서 다발성 골연골종으 로 진단 받고 절제술을 시행한 환자 18명과 다발성 골연골종의 이 차적 악성 변화에 의한 연골육종으로 진단된 환자 6명, 그리고 원 발성 연골육종 환자 9명을 대상으로 하였다. 원발성 연골육종의 평균 나이는 43.3세였으며 성비는 남자:여자에서 3:6으로 나타났 고, 골연골종의 이차적 악성변화에 의한 연골 육종의 평균나이는 31.3세로 남녀 발생 비는 3:3로 조사되었다. 연골육종으로 진단 되었던 환자 15명의 평균 추시기간은 약 23개월이었다. 대상환자 는 세 군으로 분류하여 I군은 다발성 골연골종, II군은 속발성 연
골육종, III군은 원발성 연골육종으로 구분하여 조직 검사와 수술 후에 파라핀으로 포매하여 보관 중이던 조직을 이용하여 각 군 의 p53과 MDM-2 단백의 발현을 관찰하였으며, 연골육종의 환 자들은 조직학적 등급과 현재까지 치료 경과 등을 분석하여 위의 두 유전자의 변화 유무와 상관관계가 있는 지를 알아보았다.
2.
연구방법조직학적 등급의 분류는 절제술 후 보관되고 있던 파라핀 포 매 조직을 실험에 사용하였으며, Hematoxylin와 Eosin (H-E) 으로 염색되어진 종양 조직들은 병리 전문의에게 재관찰을 의뢰 하여 정확히 재 진단한 후 이용하였다. 연골육종의 조직학적 분 류는 Table 1의 분류에 따랐다.
면역조직화학 검사의 실험 방법은 단클론성 항체로 anti-p53 antibody, DO7 (dilution 1/80; Oncogene Science-biodynam- ic, GR)과 anti-MDM-2 antibody IF2 (dilution 1/80; Onco- gene Science-biodynamic, GR)를 이용한 Streptavidin-Biotin peroxidase방법을 이용하였다. 각각의 환자 군에서의 p53과 MDM-2 단백질의 발현과 악성 군에서의 조직학적 등급과의 관 계 등을 비교 분석하였다.
면역조직화학 검사의 평가는 p53과 MDM-2의 양성 면역 반 응은 핵 염색으로 표시되었고, 임상적 정보가 없는 병리 전문의 3인의 판정으로 평가하였으며, 양성 핵의 분포 양상으로 등급을 평가하였다(Table 2, Fig. 1).
통계학적 검사는 SPSS 통계방법을 이용한 Matched T-test 를 실시하였으며, 연골육종으로 진단된 15명 중 추시가 가능하 였던 환자는 9명으로 이들의 치료 결과만을 바탕으로 Kaplan-
Grade I two or more cells per lacuna myxoid and cystic changes cartilage lobules persent endochondral ossification Grade II increased cellularity
myxoid and cystic changes lobules still present ossification still present Grade III great increase in cellularity
cartilage lobules sheetlike growth spindle tumor cells Table 1.Histologic grade of chondrosarcoma
1+ 1-5% of tumor cells positive
2+ 6-10% of tumor cells positive
3+ 11-40% of tumor cells positive
4+ over 40% of tumor cells positive Table 2.Immunohistochemical grade
Fig. 1.Photomicrograph of immunohistochemical staining for p53 in chondrosarcoma (Grade 4+ original magnification ×200).
Meier방법으로 생존율을 계산하였다.
조직학적 등급과 유전자의 변화와의 관계와 조직학적 등급과 생존율과의 관계, 그리고 유전자의 변화와 생존율과의 관계를 알 아보았다.
결 과 1.
연골육종의 조직학적 등급조직학적 검사 상, II군에서는 grade I이 3예, grade II가 2예, 그리고 grade III가 1예였으며, III군에서는 grade I이 2예, grade II가 3예, grade III가 4예였다(Table 3).
2.
각 군에서의p53
유전자의 변화I군 18명의 환자 중 p53유전자의 변화는 2예에서, II군에서도 2예에서 양성 소견을 보였으며, III군에서는 5예에서 양성 소견 을 보였으며 각 군간에 통계학적으로 유의성이 있는 차이를 보 였다(p<0.05)(Table 3).
3. MDM-2
유전자의 변화I군에서는 MDM-2 유전자의 변화는 총 8예에서 관찰되었으 며, 면역조직학적 평가는 (++)로 나타난 환자가 2예, 나머지 환 자는 (+)였다. II군에서의 변화는 4예에서 양성 소견을 보였으 며, 2예에서 2+ 이상이었고 2예는 1+로 나타났다. III군에서는 5예에서 양성 소견을 보였으며 1예에서는 1+였으나 나머지 환 자는 2+ 이상이었으며 I군과 II, III군간에서는 통계학적으로 유
의성이 있는 차이를 보였으나 II군과 III군간의 통계학적 검사에 서는 유의성이 없었다(Table 3).
4. p53
과MDM-2
단백의 동시 발현각 군에서 p53과 MDM-2 유전자 검사에서 두 가지 모두 양 성으로 관찰된 예는 I군에서는 1예도 없었으며, II군에서는 2예, III군에서는 5예에서 관찰되었으며, 세 군간에는 통계학적으로 유의한 차이를 보였고, 1예를 제외한 나머지에서 두 유전자 모 두 2+ 이상으로 관찰되었다.
5.
조직학적 등급과p53/MDM-2
유전자 변화와의 관계 II군과 III군에서 연골육종의 조직학적 등급이 III 이상인 5예 모두에서 p53/MDM-2 유전자의 변화가 있었으며, 각 군에서 grade II의 환자에서 1예씩 모두 2예에서 p53/MDM-2 유전자 의 변화가 관찰되었다.6.
연골육종환자의 치료 결과II군에서는 총 6명 중 3명, III군에서는 9명 중 6명만이 1년 이 상 추시가 되었으며, 사망 2예, 생존 5예, 그리고 추시 도중 내원 하지 않은 예는 2예였다. Kaplan-Meier 방법에 따른 5년 생존 율은 약 70%로 나타났으며(Fig. 2), 사망의 2예는 조직학적 등 급이 III이었고, 2예 모두 p53과 MDM-2 유전자의 변화가 있었 으며 1예는 3+, 나머지 1예는 4+로 나타났다. 생존하고 있는 5 예는 조직학적 등급이 I군에서 2예, II군에서 2예, III군에서 1예 였으며, 5명 중 3명에서 p53과 MDM-2 유전자의 변화가 관찰 되었다.
고 찰
연골육종은 골육종 다음으로 흔하게 발생되는 골종양으로 주 로 중년이상의 연령에서 발견되며 연골을 형성하는 악성 종양이 다. 원인 없이 발생하는 경우를 원발성, 그리고 이미 존재하던 양 성 연골 종양의 악성 변화에 의한 속발성 연골육종으로 크게 분 류할 수 있다. 속발성으로 악성 변화를 일으킬 수 있는 질환 중 다발성 골연골종에서는 그 악성변화를 일으키는 기전과 과연 어 떠한 경우, 언제 변화를 일으키는지는 규명되지 않았으며 이러한 점이 실제 임상에서 진단과 향후 치료결정에 어려운 점이다.
p53 종양 억제 유전자의 변화는 악성 종양에서 가장 흔한 유 전자 변화이다6,33). p53은 chromosome 17의 short arm에 위치 하고 53-KDa 인산화로 암호화되어 있고 세포주기 조절에 중요
Categories
Histologic grade of chondrosarcoma
Change of p53 gene
Change of MDM-2 protein
I II III + ++
Both expression of p53 & MDM-2
protein
Group I - - - 2 8 2 -
Group II 3 2 1 2 2 2 2
Group III 2 3 4 5 1 4 5
Table 3.Histologic grade and changes of p53 and MDM-2 protein
Survival (%)
Month 100
90
80
70
60
50
10 20 30 40 50 60
Fig. 2.Life-table survival curve for chondrosarcoma by Kaplan- Meiyer method.
한 역할을 한다2,28). p53의 변이는 상피성 악성종양 환자의 50%
이상에서 관찰되며, 정형외과 영역에서는 골육종과 연골 육종에 서 흔하게 변이가 관찰되나13), 아직까지 이 유전자의 변이가 어 떠한 임상적 중요성을 갖는지는 완전히 규명되지 않은 실정이다.
Stefanou 등26)은 mutant p53핵염색은 섬유육종이 1예중 1예에 서 발견되었고(100%), 횡문근육종이 100%, 분류되지 않은 육종 이 100%, 유잉육종이 50%, 지방육종이 40%, 그리고 평활근육 종이 11.11%로 나타났다고 하였으며, Irie 등10)에 의하면 연구대 상 환자의 32.3%에서 p53이 발견되었으며 악성 신경초종에서 100%, 횡문근육종에서 71.4%, 활막육종에서 50%, 지방육종에 서 13.6%, 섬유육종에서 0%가 발견되었다고 보고하였으며, Os- hiro 등22)에 의하면 158명의 연골육종 환자중 38.1%에서 p53이 양성이었다고 하였다. 저자들의 예에서는 원발성 연골육종에서 는 약 56%, 속발성 연골육종에서는 약 34%에서 관찰되어 원발 성의 경우에서 보다 흔하게 관찰되는 것으로 나타났다. 그러나 원발성과 속발성 연골육종간의 p53 발현율의 차이는 대상 개체 수의 부족으로 통계분석은 실시하지 못하였다.
MDM-2는 암 형성 가능성을 가진 유전자로써 p53과 retino- blastoma protein (Rb)과 결합하는 인산화로 암호화되어 있으며 p53 활성화 영역을 숨김으로써 p53의 전사능력을 억제한다3,4,16,33). 세포내 MDM-2/P53 비율은 자가조절 피드백회로에 의해 조절 되며 이는 세포 증식 조절에 중요한 역할을 한다3,4,21,32). p53의 기 능을 조절하기 위해서 MDM-2와의 상호작용이 필요하며 퇴화를 통해 p53의 안정성에 관여한다3,4,21,33). p53과 MDM-2간의 세밀 하게 조절되는 균형의 붕괴는 곧 이상세포 형성과 이것의 발전, 분화를 유발하며 이는 암 형성으로 이어진다. P53 유전자의 변이 가 MDM-2 유전자의 증폭과 관계된다는 보고도 있으며17,29,30,33), 이러한 MDM-2 유전자의 증폭은 전이성 골육종에서 가장 흔한 것으로 알려져 있다11). 저자의 예에서는 원발성 연골 육종의 경우 약 56%, 속발성의 경우는 약 67%의 발현율을 보이고 있으며 이 는 원발성의 경우는 p53과 발현율이 같으나 속발성의 경우에는 p53보다 더 흔하게 관찰되었다. 또한 본 실험 결과, 유전자의 변 화는 동시에 증폭되는 것으로 나타나 연골육종의 생성 기전에 p53과 MDM-2의 정상적인 조절기전의 붕괴가 하나의 원인일 수 있을 것으로 유추해 볼 수 있다. 그러나 MDM-2 단백질에 대해 서는 아직 논란이 끊이지 않고 있다. MDM-2 단백질의 과표현이 전이성 종양이나 재발성 종양과 연관성이 있으며 조직학적으로 고도의 등급과 생존율과 연관성이 있다는 보고가 있으며8,11,15,18)
또한 이와는 정반대인 큰 연관성이 없다는 보고도 있으며26), Sz- adowska 등27)은 MDM-2가 모든 연부 종양의 조직등급에는 영 향이 있으나 MDM-2와 연부조직 종양의 증식과는 연관이 없다 고 보고하고 있다. 또한 Stefanou 등26)에 의하면 p53과 MDM- 2의 경로가 여러 육종의 아형에서 종양 형성에 관여한다고 사료 되나 이러한 유전자의 과표현이 예후 인자로 작용되는지는 의문 이라고 하였다. 저자의 결과로는 p53과 MDM-2 모두 조직학적 등급과 밀접한 관계를 보이고 있는 것으로 나타났다. 즉 연골육
종의 조직학적 등급 III 이상인 경우는 모든 예에서 p53과 MDM- 2 유전자의 변화는 연골육종 환자의 예후에 관련이 있는 것으로 유추할 수 있을 것이다. 그러나 이 두 유전자의 동시변화와 각각 의 변화만이 있을 때의 차이는 본 연구에서는 알 수 없었다. 저자 는 또한 다발성 골연골종의 환자에서 절제술 후 얻어진 조직으로 두 유전자에 대한 면역조직학적 검사를 시행하였다. 하지만 다발 성 골연골종 환자 중 보다 악성 변화의 가능성이 큰 환자를 선별 할 수 있다면 환자의 추시나 관찰에 있어 큰 도움이 될 수 있을 것이다. 본 연구에서 p53과 MDM-2 유전자의 변화가 연골육종 의 예에서는 의미 있게 변화하는 것을 알 수 있어 다발성 골연골 종 환자 중 임의로 선택한 18예에서 p53과 MDM-2 유전자의 변 화를 검사한 바 두 가지 유전자의 동시 변화의 예는 하나도 없었 으나 p53은 11%, 그리고 MDM-2는 44%에서 변화가 관찰되어 MDM-2의 변화가 더 흔하였으나 과연 이 변화가 추후 악성 변 화와 어떠한 관계가 있는지는 변화를 보인 다발성 골연골종 환자 를 지속적으로 추시함과 동시에 이 부분에 대한 지속적인 면역학 적 검사가 필요할 것으로 사료되는 바이다.
결 론
다발성 골연골종의 이차적 악성 변화에 의한 연골육종과 원발 성 연골육종과의 p53과 MDM-2 유전자의 변화는 원발성에서 보다 많은 변화를 보였으며, 조직학적 등급에서도 악성도가 높 을수록 p53과 MDM-2 단백질의 발현이 증가함을 알 수 있었 고, 대상수가 적어 정확한 통계분석에 의한 결론은 내릴 수 없 지만 연골육종의 환자 중 사망한 예에서 조직학적 등급이 고도 이고 또한 두 유전자의 변화가 모두 관찰되어, p53과 MDM-2 유전자의 변화 유무가 예후와 관계가 있을 것으로 생각된다. 다 발성 골연골종 환자에서 p53과 MDM-2 유전자의 동시 변화는 관찰할 수 없었으나 각각의 변화는 일부 예에서 관찰되어 향후 추시 검사 및 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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