Establishment and Validation of an Optimized Analytical Method for Sodium Copper Chlorophyllin in Food Using HPLC and LC/MS

(1)

HPLC 및 LC/MS를 이용한 식품 중 동 클로로필린 나트륨 최적 분석법 확립 및 타당성 평가

정희선¹․박현일¹․조성륜¹․Tokutaro Yamaguchi¹․이옥경¹ 박주희²․이 찬²․이근영³․윤상순³․임호수³․서희재¹

1선문대학교 식품과학과

2중앙대학교 식품공학부

3식품의약품안전평가원 첨가물포장과

Establishment and Validation of an Optimized Analytical Method for Sodium Copper Chlorophyllin in Food Using HPLC and LC/MS

Hee Sun Chong¹, Hyeon Il Park¹, Sung Ryun Cho¹, Tokutaro Yamaguchi¹, Ok Kyung Lee¹, Ju-Hee Park², Chan Lee², Gun-Young Lee³, Sang Soon Yun³, Ho-Soo Lim³, and Hee-Jae Suh¹

1Department of Food Science, Sun Moon University

2Advanced Food Safety Research Group, BrainKorea21 Plus, Department of Food Science and Technology, Chung-Ang University

3Food Additives and Packaging Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation

ABSTRACT An optimized analytical method for the SCC (sodium copper chlorophyllin) colorant using high-perform- ance liquid chromatography with a photodiode array detector (HPLC-PDA) was developed and validated. HPLC of SCC revealed one prominent peak and two small peaks. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry showed that SCC was composed mainly of Cu-isochlorine e4, and that Cu-chlorine p6 and Cu-chlorine e6 were composed of auxiliary components. The optimized analysis method of SCC showed a considerably high resolution, reproducibility, and adequate retention time (within 20 minutes). The linearity of the calibration curve was almost 1 (R²=0.9999), and the LOD (limit of detection) and the LOQ (limit of quantitation) were 0.1 mg/kg and 0.4 mg/kg, respectively.

Both the precision and accuracy of the inter-day and intra-day tests were 0.5∼8.1 and 89.2∼102.2%, respectively.

The recoveries of SCC in foods were 104∼109% for candy and beverages, and 104∼119% for oils.

Key words: sodium copper chlorophyllin, colorant, LC/MS, analytical method

Received 20 February 2018; Accepted 20 April 2018

Corresponding author: Hee-Jae Suh, Department of Food Science, Sun Moon University, Asan, Chungnam 31460, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-41-530-2267

서 론

동 클로로필린 나트륨(sodium copper chlorophyllin)은 식물의 엽록소를 용매로 추출한 후 4개의 피롤고리(four pyrrole rings) 중심부에 있는 마그네슘이온(Mg⁺⁺)을 구리 이온(Cu⁺⁺)으로 치환하고 나트륨염의 형태로 제조한 비 타 르계 합성 착색료이다(1). 진한 암녹색을 띤 이 색소는 물과 알코올, 에테르 등 유기용매에 잘 용해되는 특성을 갖고 있으 며, 우리나라를 비롯한 일본, 중국, 유럽연합(EU), 국제식품 규격(CODEX), 미국 등에서 착색료로 허용되어 있다(2-5).

동 클로로필린 나트륨은 주로 캔디류, 츄잉껌, 음료류, 과 일채소 가공품, 어육가공품, 시럽, 시즈닝(seasoning) 등에 녹색을 부여할 목적으로 사용되고 있으며, 사용대상 식품

및 사용량은 국가마다 조금씩 차이가 있다(2-4). 식품첨가 물공전에 의하면 우리나라에서는 다시마, 과실류 및 채소류 저장품, 츄잉껌, 캔디류, 완두콩 통조림 중의 한천에 식품 1 kg당 동(Cu)으로써 0.0004~0.15 g/kg의 범위로 사용하 도록 규정되어 있다(2). 이는 우리나라 식품의약품안전처에 서 공식적으로 식품 중에 함유된 동 클로로필린 나트륨 분석 법을 마련하지 못하였기 때문에 동 클로로필린 나트륨의 사 용량을 동(Cu)으로 설정하고 있는 것이다. 그러나 원래 식품 에 함유되어 있는 동(Cu)과 동 클로로필린 나트륨 첨가에 의한 동(Cu)을 구분하는 것은 매우 어렵기 때문에(6) 식품 중 동(Cu)의 양을 분석하여 간접적으로 동 클로로필린 나트 륨의 사용량을 추정하는 현 방법은 정확도가 떨어지는 방법 이다.

동 클로로필린 나트륨은 엽록소에 수산화나트륨(NaOH) 을 첨가하여 비누화하고 이 생성물에 동(Cu)을 붙여 화합물 을 만들기 때문에 상업적으로 시판되는 동 클로로필린 나트 륨은 단일물질이 아니라 여러 종류의 유도체로 구성되어 있

(2)

Fig. 1. Structure of copper chlorins (8). 1: R1=−CH2COOH, R2=

−COOH (Cu chlorin e6). 2: R=−COOCH3 (Cu pheophorbide a).

3: R1=−CH3, R2=−COOH (Cu chlorin e4). 4: R1=−CH2COOH, R2=−H (Cu isochlorin e4).

다(7). Fig. 1에서 보여주는 바와 같이 R, R₁, R₂의 위치에 존재하는 관능기에 따라 각기 다른 구조의 유도체를 형성한 다(Fig. 1). 동 클로로필린 나트륨을 이루는 유도체는 동 클 로린 e6(copper chlorin e6), 동 클로린 e4(copper chlorin e4), 동 페오포르바이드 a(copper pheophorbide a)가 주를 이루는데, 동 클로린 e6와 동 페오포르바이드 a는 식품 제조 과정 중 pH와 열처리 등으로 인해 분해가 일어나는 반면, 동 클로린 e4는 비교적 안정하기 때문에 동 클로로필린 나 트륨 분석의 지표물질(indicator)로 이용될 수 있다(8,9).

동 클로로필린 나트륨 분석에 대한 연구는 1990년대부터 역상 분배형 칼럼과 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용한 분석법이 보고되어 왔다(10-16).

Amakawa 등(13)은 메탄올, 물, 초산을 이동상으로 하여 C₁₈ 칼럼과 PDA 검출기가 부착된 HPLC를 이용하여 625 nm에 서 동 클로로필린 나트륨을 분석하였고, Inoue 등(10)은 1%

초산이 함유된 메탄올과 물을 이동상으로 하여 C18 칼럼 (Inertsil ODS-2)과 HPLC-PDA로 407 nm와 423 nm에서 분석하였다. 그러나 이들 연구에서는 HPLC 분석법만 보고 되었을 뿐 식품으로부터 동 클로로필린 나트륨을 추출하는 방법은 보고되지 않았다. Yasuda 등(14)은 삶은 고사리, 우 뭇가사리, 츄잉껌 등에 디에틸에테르(pH 3~4)를 첨가하여 녹색 물질을 추출한 후 Inoue(10)의 HPLC 조건과 유사한 방법으로 405 nm에서 동 클로로필린 나트륨을 분석하였으 며, Scotter 등(11)은 캔디, 젤리, 비스킷 등 시판 식품에 시 트르산/인산염 완충액(pH 2.6)과 에틸아세테이트 : 아세톤 (5:1 v/v)을 이용하여 동 클로로필린 나트륨을 추출한 후 C18

칼럼(Vydac 201TP54)과 HPLC-PDA 및 형광 검출기를 이용하여 메탄올, 0.1 M 암모늄아세테이트, 아세톤을 이동 상으로 650 nm에서 동 클로로필린 나트륨을 분석하였다 (11). 그러나 이들 연구에서는 동 클로로필린 나트륨을 이루 는 주된 유도체에 대한 연구가 미흡하며 HPLC 분석법에 대 한 타당성 검증(method validation)이 보고되지 않아서 동

클로로필린 나트륨 분석법의 정확도를 판단하기 어려운 상 태이다.

이에 본 연구에서는 기존에 보고된 동 클로로필린 나트륨 의 전처리 방법, 기기분석 방법 등을 검토 및 수정･보완하여 최적의 기기분석 조건 및 전처리 방법을 확립하고, 확립된 분석법의 타당성을 검증하여 우리나라의 일선 분석 기관에 서 사용할 수 있는 공인 분석법을 마련하고자 하였다.

재료 및 방법

시약 및 시액

현재 시판되고 있는 동 클로로필린 나트륨 시약을 Sigma (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 식품첨가물 공전 (17) 및 국제식품첨가물 전문가 위원회(JECFA)(18)의 권고 에 따라 순도를 보정하여 표준품으로 사용하였다. HPLC 이 동상 제조를 위해서 인산버퍼(phosphate buffer)는 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였고, 물, 메 탄올, 에틸아세테이트, 0.1 N 염산은 Samchun Chemical Co.(Seoul, Korea), 아세톤은 Daejung Chemical Co.(Go- ryeong, Korea), 초산은 Avantor(Center Valley, PA, USA) 로부터 구매하여 사용하였다. 또한, 동 클로로필린 나트륨의 전처리를 위해 Oasis HLB 6 cc(200 mg) 카트리지(Waters, Dublin, Ireland)와 0.2 μm PVDF filter(Whatman, Maid- stone, UK)를 사용하였다.

분석 장비 및 기기

동 클로로필린 나트륨의 정량 분석을 위해서 HPLC Agi- lent Technologies 1260 infinity(Agilent, Santa Clara, CA, USA), Inertsil ODS-2 column(5 μm 4.6×250 mm, GL Sciences, Tokyo, Japan), Agilent 1260 photodiode- array(PDA)(Agilent)를 사용하였다. 동 클로로필린 나트륨 의 유도체를 확인하기 위해 UPLC-MS(Synapt G2-S, Acquity UPLC, Waters, Milford, MA, USA), UPLC^® BEH C₁₈ column(1.7 μm, 2.1 i.d.×100 mm, Waters, Milford) 을 사용하였다.

동 클로로필린 나트륨 standard calibration

현재 시판되는 동 클로로필린 나트륨은 표준품이 아닌 시 약급(commercial grade)으로 판매되기 때문에 Sigma로부 터 동 클로로필린 나트륨(commercial grade)을 구매한 후, 식품첨가물공전(17) 방법에 따라 동 클로로필린 나트륨 1 g을 취해 pH 7.5로 맞춘 1 M 인산버퍼로 10,000 또는 100,000배 희석하고 분광광도계(Vision, Seoul, Korea)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 순도를 계산하였 다. 순도 계산을 위해서는 식 (1)을 이용하였으며 이와 같이 산출된 순도를 이용하여 동 클로로필린 나트륨의 농도를 표 준화(calibration)하여 표준품(standard)으로 사용하였다 (17,18).

(3)

Table 1. HPLC operating conditions for sodium copper chlor- ophyllin analysis

Instrument Agilent 1260 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA) Column

Inertsil ODS-2 (4.6 mm×250 mm, GL Sciences,

Tokyo, Japan) Mobile phase Methanol : Water (97:3)

including 1% acetic acid Flow rate 1.0 mL/min

Temperature 35°C

Detector Agilent 1260 Diode array detector (405 nm)

Injection volume 10 μL Running time 20 min

Table 2. The LC-MS conditions for determining sodium copper chlorophyllin Instrument

Column Ionization mode Detection mode

LC-MS (liquid chromatograph-mass spectrometer, Waters SYNAPT G2-S, Acquity UPLC, Waters, Milford, MA, USA)

Acquity UPLC^® BEH C 18 (1.7 μm, 2.1 i.d.×100 mm) ESI-LC-MS

TOF (Time of Flight)

Mobile phase

A: Water, B: Acetonitrile A : B=62.5:37.5

Time (min) %A %B Curve

Initial 4.00 7.00 9.60 9.60 12.00

62.5 40.0 0.0 0.0 62.5 62.5

37.5 60.0 100.0 100.0 37.5 37.5

7 5 6 6 6 6 Column temp.

Flow rate Injection volume

Run time

35°C 0.35 mL/min

5.0 μL 12 min 함량(%)＝ 흡광도×희석배수

565×검체의 채취량(g) 식 (1) (동 클로로필린 나트륨 비 흡광도 565: E1cm%)

동 클로로필린 나트륨 HPLC 분석법 검토

동 클로로필린 나트륨 분석법에 대한 EU, CODEX, 일본, 중국의 연구(10-16)를 검토하여 분석 기기로는 HPLC- PDA(Agilent)를 이용하였고, 칼럼은 예비 실험 결과 가장 분리능이 좋았던 Inertsil ODS-2(4.6 mm×250, GL Sci- ences)를 선정하였다. 동 클로로필린 나트륨을 분리할 수 있는 이동상으로는 기존의 연구(9,13,14)에서 이용된 메탄 올, 물, 아세톤, 암모늄 아세테이트, 초산 등을 이용하여 예 비실험을 한 결과 가장 감도가 우수하였던 1% 초산을 함유 한 메탄올과 물(97:3)을 이용하여 Table 1의 조건으로 분석 하였다. 또한, 최대 흡수파장을 확인하기 위하여 HPLC- PDA를 이용하여 전 파장의 흡수스펙트럼을 측정하였다.

LC-MS를 이용한 동 클로로필린 나트륨의 유도체 확인 동 클로로필린 나트륨 분석을 위해 LC-MS(Waters)와 LC^® BEH C₁₈ column(2.1 i.d.×100 mm, Waters)을 이용 하여 Table 2의 조건으로 분석하고 동 클로로필린 나트륨의 주요 유도체 및 그 구조를 확인하였다.

시료 전처리방법 확립

캔디, 음료 등 수용성 식품에 함유된 동 클로로필린 나트 륨 추출을 위해서 기존의 동 클로로필린 전처리법에 대한 연구(10-16)를 검토한 후 예비실험을 거쳐 Scotter 등(11) 의 방법을 변형한 전처리법 1, Yasuda 등(14)의 방법을 변 형한 전처리법 2, 본 연구에서 개발한 전처리법 3을 비교하 였다. 전처리법 1은 시료 5 g에 10 mL 에틸아세테이트 : 아세톤＝5:1(v/v)과 15 mL 인산버퍼를 첨가하여 균질화한 후 10,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 상층액을 0.2 μm membrane filter(Whatman)로 여과한 액을 HPLC 분석용 시험용액으로 하였다. 전처리법 2는 시료 10 g을 칭량하여 50 mL 50°C의 온수를 가해 균질화한 후 0.1 N 염산 5 mL를 첨가하여 진탕 혼합하고 상층액을 0.2 μm membrane filter(Whatman)로 여과한 액을 HPLC 분석용 시험용액으로 하였다. 본 연구에서 개발한 전처리법 3은 시료를 잘게 부수 어(액상식품은 그대로) 5 g을 정밀히 취한 후 0.1 N 염산 5 mL를 가해 50°C에서 10분간 초음파 추출하고 메탄올을 첨가하여 20 mL로 정용한 후 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리 하고 상등액을 취하여 0.2 μm membrane filter로 여 과한 액을 HPLC 분석용 시험용액으로 하였다. 이때 시험용 액이 연하게 착색된 경우에는 질소농축을 하여 분석하였다.

유지 시료(샐러드드레싱)의 경우에는 유지를 제거하기 위 한 유기용매로 디에틸에테르, 석유에테르, 헥산, 클로로포름 을 이용하여 예비실험 후 가장 추출 효율이 높은 유기용매를 선택하였다. 전처리법 4는 코티티시험연구원에 의해 보고된 방법(5)을 변형한 방법으로 시료 5 g을 디에틸에테르 5 mL

(4)

에 녹인 후 HLB 6 cc(200 mg) 카트리지에 주입하고 디에틸 에테르 5 mL를 흘려서 유지를 제거한 다음 메탄올 10 mL로 카트리지에 흡착된 동 클로로필린을 추출하여 HPLC에 주 입하는 방법이며, 전처리법 5는 전처리법 4와 동일하게 분 석하되 디에틸에테르 대신 헥산을 이용하여 유지를 제거하 는 방법을 이용하였다. 전처리법 6은 본 연구에 의해 개발된 방법으로서 헥산을 이용하여 지방을 제거하되 카트리지를 사용하지 않고 전처리 단계를 최소화한 방법이다. 시료 5 g을 정밀히 취하여 물 5 mL와 헥산 5 mL를 넣어 진탕 혼합한 후 헥산층에 지방을 용출해서 제거하였다. 지방층을 추출하 는 조작을 3회 반복하여 지방층을 완전히 추출, 제거한 후 물층의 색소 추출액을 메탄올로 희석하여 20 mL로 정용한 다음 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하고 0.2 μm membrane filter로 여과한 액을 HPLC 분석용 시험용액으로 하 였다. 시험용액이 연하게 착색된 경우에는 질소농축을 하여 분석하였다.

최적 분석법 타당성 검증

직선성, 검출한계, 정량한계: 표준용액을 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL 농도로 제조하여 HPLC로 분석 후 얻어진 피크면적으로부터 검량선을 작성하였다. 표준용액 농도는 순도실험 결과를 반영하여 제조하였고, HPLC 분석으로부 터 얻은 면적과 농도와의 상관성을 측정하여 직선성을 검토 하였다. 저농도(5, 10, 25 μg/mL)로 제조된 표준용액의 검 량선 기울기와 중간농도를 7회 분석하여 얻은 값을 이용하여 ICH Harmonised Tripartite Guideline(19)에서 제안한 식 (2)에 의해 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)를 산출하였다.

LOD＝3.3×σ/S 식 (2) LOQ＝10×σ/S

σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기

정밀도, 정확도: 정밀도는 HPLC를 이용하여 하루 동안 (일내분석) 또는 3일에 걸쳐(일간분석) 반복 분석한 결과들 의 표준편차로 산출하였고, 정확도는 이론값과 실측값을 비 교하여 산출하였다. 일간분석을 위해 직선성에 해당하는 검 량 농도 6 point(10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL)를 지정 하여 하루에 1회씩 3일 동안 측정한 후 이 결과들을 합산하 여 정밀도와 정확도를 산출하였다. 일내분석은 검량 농도와 는 다른 4 point(30, 60, 120, 180 μg/mL)를 제조하여 하루 에 5반복으로 분석한 결과로 산출하였다. 서로 다른 2개의 식품 매트릭스(캔디, 샐러드드레싱)에 최종농도가 10, 50, 100 μg/mL가 되도록 동 클로로필린 나트륨 표준용액을 첨 가하여 5회 반복 측정으로 회수율을 측정하였다.

실험실 간 교차검증: 최적 분석법의 타당성을 확보하기 위하여 서로 다른 3개의 실험실에서 동일한 농도 조건으로 조제된 시료들을 실험하여 실험실 간 교차검증을 하였다.

3개 실험실에서 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL를 3반복 측정하여 검량선을 작성하고, R²값을 산출해 직선성을 확인

하였다. 동 클로로필린 나트륨을 가장 많이 사용하고 있는 캔디류에 300, 500, 700 μg/mL가 되도록 동 클로로필린 나트륨 표준용액을 첨가한 후 본 연구에서 개발한 최적의 전처리법으로 전처리하고 Table 1의 조건으로 분석하여 회 수율 분석을 실시하였다. 각 실험실에서 분석된 검량선의 직선성과 회수율을 구한 후 실험실 간 RSD(%) 값을 산출하 여 비교하였다.

통계분석

본 연구에서 진행한 동 클로로필린 나트륨 분석은 모두 3반 복 이상 수행되었으며, 엑셀 시트(Excel 2010, Microsoft, Redmond, WA, USA)를 이용하여 산술 평균, 표준오차, 표 준편차, 상대 표준편차(RSD, %)를 계산하였다.

결과 및 고찰

동 클로로필린 나트륨 standard calibration

시판 동 클로로필린 나트륨 1 g을 pH 7.5로 맞춘 1 M 인산 버퍼로 10,000 또는 100,000배 희석하여 405 nm에서 10 회 반복으로 흡광도를 측정한 후 식 (1)을 이용하여 동 클로 로필린 나트륨의 순도를 계산한 결과 89.7%로 나타났다.

따라서 이 값으로 시판 동 클로로필린 나트륨 시약을 표준화 하여 이후의 동 클로로필린 나트륨 분석에 이용하였다.

동 클로로필린 나트륨의 HPLC 분석법 확립

동 클로로필린 나트륨의 기존 분석법들(10-16)을 중심으 로 칼럼, 이동상, 최대흡수파장 등의 조건을 달리하며 분석법 을 검토해본 결과 HPLC-PDA를 이용하여 Table 1의 조건 으로 분석할 때 가장 우수한 크로마토그램을 나타내었다.

이동상으로 사용한 메탄올 : 물(97:3)에 1% 초산을 넣는 이 유는 카르복실 그룹(carboxyl group)에서 전자 이탈을 방 지함으로 적절한 머무름 시간을 확보하기 위한 것으로 선행 연구(9)에서도 보고된 바 있다. 검출파장은 405 nm에서 최 대 흡수부를 나타내는 것으로 나타났으며, Inertsil ODS-2 칼럼을 이용하여 Table 1의 조건으로 동 클로로필린 나트륨 을 분석한 크로마토그램은 Fig. 2A와 같이 나타났다.

LC-MS 이용한 동 클로로필린 나트륨의 유도체 분석 동 클로로필린 나트륨 표준품을 메탄올에 녹인 후 LC- MS를 이용하여 Table 2의 조건으로 분석한 결과 Fig. 2B~

2E의 크로마토그램을 얻었다. Fig. 2B의 크로마토그램 중 2.8분에 검출되는 피크인 동 클로린 e6(Cu chlorin e6)는 Fig. 1에 나타낸 동 클로로필린 기본 구조에 R₁=-CH₂COOH, R2=-COOH가 결합된 구조를 갖고 있으며 분자량은 658.18 이고 최대흡수파장은 407 nm였다(Fig. 2C). 두 번째 3.0분 대에 검출되는 피크인 동 클로린 p6(Cu chlorin p6)는 동 클로로필린 기본 구조의 R₁과 R₂ 모두 -COOH가 결합된 구 조로 분자량은 643.16으로 최대흡수파장은 406 nm로 나타

(5)

A

B

C

D

E

Fig. 2. HPLC and UPLC-MS/MS chromatogram of sodium copper chlorophyllin.

(6)

Table 3. Comparison of various pretreatment methods of sodium copper chlorophyllin in foods Water soluble food

Method Concentration (mg/kg) Mean±SD Recovery (%) RSD (%) 1

10 50 100

12.6±0.79 74.4±1.70 118.3±0.84

126.3 148.8 118.3

7.9 3.4 0.8 2

10 50 100

7.6±0.15 41.5±0.68 98.9±0.28

75.8 82.9 98.9

1.5 1.4 0.3 3

10 50 100

10.4±0.29 52.8±1.95 108.9±1.37

103.9 105.5 108.9

2.9 3.9 1.4 Fat-containing food

Method Concentration (mg/kg) Mean±SD Recovery (%) RSD (%) 4

10 50 100

<LOQ

－

－ 5

10 50 100

6.3±0.04 24.6±0.95 38.8±3.40

62.6 49.3 38.8

0.4 1.9 3.4

6

10 50 100

10.4±0.68 59.6±1.85 113.9±3.94

103.8 119.2 113.9

6.8 3.7 3.9

1: modified pretreatment of proposed method by Scotter et al (11). 2: modified pretreatment of proposed method by Yasuda et al (14). 3: optimal pretreatment by present study. 4: modified pretreatment 1 of proposed method by KOTITI (6). 5: modified pretreatment 2 of proposed method by KOTITI (6). 6: optimal pretreatment by present study.

났으며(Fig. 2D), 4.3분에 제일 크게 나타나는 피크는 동 클 로로필린 나트륨의 주 피크로서 R₁=-CH₂COOH, R₂=-H로 결합된 구조인 동 이소클로린 e4(Cu isochlorin e4)이고 분 자량은 613.19, 최대흡수파장은 405 nm인 것으로 나타났 다(Fig. 2E). 또한, 4.3분 이후에 나타나는 작은 피크들은 동을 함유하지 않는 클로린 유도체인 것으로 확인되었다.

이는 Mortensen과 Geppel(9)의 연구에서 5종류의 시판 동 클로로필린 샘플을 분석한 결과 동 클로로필린을 구성하고 있는 유도체가 동 클로린 e6, 동 클로린 p6 및 동 이소클로린 e4였다는 연구 결과와 일치하는 결과였다.

동 클로로필린 나트륨의 전처리법 확립

캔디, 음료 등 수용성 식품 중에 함유되어 있는 동 클로로 필린 나트륨을 추출하기 위해 시료에 10, 50, 100 mg/kg이 되도록 동 클로로필린 나트륨을 첨가한 후 Scotter 등(11)의 방법을 변형한 전처리법 1, Yasuda 등(14)의 방법을 변형한 전처리법 2, 본 연구에서 개발한 전처리법 3을 이용하여 동 클로로필린 나트륨의 회수율을 비교한 결과는 Table 3과 같이 나타났다. 전처리법 1(Scotter 변형법)은 농도별로 118.3~148.8%의 회수율을 나타내었고(RSD 0.8~7.9%), 전처리법 2(Yasuda 변형법)는 농도별로 75.8~98.9%의 회 수율을 나타내었다(RSD 0.3~1.5%). 본 연구에서 개발한 전처리법 3은 농도별로 103.9~108.9%(RSD 1.4~3.9%)로 나타나 국제표준화기구(ISO)에서 제시한 95~105%에 가장

근접한 결과를 나타내었다(20). 동 클로로필린 나트륨을 추 출하기 위해서는 추출액을 달리하며 여러 단계를 거치는 것 보다 묽은 염산(0.1 N)을 사용하여 시료를 녹인 후 메탄올을 첨가하여 초음파 추출을 하고 당 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 μm membrane filter로 여과하는 전처리법 3이 추출률 을 가장 높일 수 있는 방법임을 알 수 있었다. 시료에 묽은 염산(0.1 N)을 가하지 않는 경우는 시료가 잘 녹지 않아서 추출률이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 유지류(샐러드드레싱)에 함유되어 있는 동 클로로 필린 나트륨을 추출하기 위해 상기와 동일한 방법으로 시료 에 동 클로로필린 나트륨을 첨가한 후 코티티시험연구원에 의해 보고된 방법(6)을 변형한 전처리법 4와 전처리법 5, 본 연구에서 개발한 전처리법 6을 비교한 결과 Table 3과 같이 나타났다. 디에틸에테르로 유지를 제거하는 방법(전처 리법 4)으로는 동 클로로필린이 전혀 검출되지 않는 것을 알 수 있었는데, 이는 디에틸에테르에 동 클로로필린 나트륨 이 용해되어 유출되기 때문이었다. 한편 헥산으로 유지를 제 거하는 전처리법 5와 전처리법 6은 각각 38.8~62.6%(RSD 0.4~3.4%), 103.8~119.2%(RSD 3.7~6.8%)의 회수율을 나타내었다. 전처리법 5와 전처리법 6 모두 헥산으로 유지 를 제거하는 방법이었으나, HLB 카트리지를 이용한 전처리 법 5의 경우 층 분리에 의해 헥산층을 제거한 전처리법 6보 다 색소 손실이 크다는 것을 알 수 있었다. 따라서 유지류에 함유되어 있는 동 클로로필린 나트륨을 추출하기 위해서는

(7)

Table 4. Results of method validation of sodium copper chlorophyllin by HPLC analytical method Method validation

R²

(correlation coefficient) Limit of detection

(mg/kg) Limit of quantification

(mg/kg) Resolution Selectivity

Calculation 0.9999 0.1 0.4 10.0 2.0

Inter-day test Concentration (mg/kg, n=3)

10 25 50 100 300 500

Mean Precision Accuracy (%)

8.9±0.81 8.10 89.18

23.9±0.78 3.10 95.57

47.2±0.78 1.55 94.43

98.7±1.80 1.80 98.66

303.1±9.20 3.07 101.04

510.9±21.84 4.37 102.18 Intra-day

Concentration (mg/kg, n=4)

30 60 120 240

Mean Precision Accuracy (%)

27.13±0.79 2.62 90.44

56.60±0.53 0.88 94.32

115.66±1.45 1.20 96.38

241.19±1.10 0.46 100.49

Table 5. Recoveries of sodium copper chlorophyllin in foods by optimal analytical method Food category Conc.

(mg/kg)

Recoveries (%)

Mean SD Recovery RSD

Water soluble food (candy, drink)

10 50 100

10.39 52.77 108.92

0.29 1.95 1.37

103.9 105.5 108.9

2.9 3.9 1.4 Fat-containing food

(salad dressing)

10 50 100

10.38 59.58 113.85

0.68 1.85 3.94

103.8 119.2 113.9

6.8 3.7 3.9

Table 6. Results of inter laboratory test of sodium copper chlorophyllin in foods using optimal analytical method Recoveries

Lab 1 Lab 2 Lab 3 RSD (%)

Concentration (mg/kg)

300 500 700

97.6±1.41 102.3±0.07 96.1±0.42

90.90±2.68 88.03±1.43 89.27±1.07

121.4±0.02 105.4±0.37 83.8±0.06

16.04 9.26 6.15 R² (correlation coefficient) 0.9998 0.9995 0.9978

유지 시료에 물과 헥산을 각각 5 mL씩 첨가하여 유지를 헥 산에 녹여 제거한 후 물층에 동 클로로필린 나트륨을 추출하 는 방법이 최적의 방법임을 알 수 있었다.

최적 분석법의 타당성 평가

동 클로로필린 나트륨의 HPLC 최적 방법을 확인하기 위 하여 Table 1의 조건으로 동 클로로필린 나트륨 표준품을 분석하고, 얻어진 피크의 높이와 면적으로부터 검량선을 작 성한 결과 검량선의 상관계수(R²)는 0.9999로서 매우 우수 한 직선성을 나타내었다. 또한, 검출한계와 정량한계는 각각 0.1 mg/kg과 0.4 mg/kg으로 나타났으며, 분리능(resolution)과 선택성(selectivity)은 각각 10.0과 2.0으로 나타났 다(Table 4). 확립된 동 클로로필린 나트륨 분석법의 정밀도 (precision)와 정확도(accuracy)는 일간 및 일내 반복실험

을 통해 산출하였다(Table 4). 일간분석의 경우 정밀도는 농도별로 1.6~8.1로 나타났고, 정확도는 농도별로 89.2~

102.2%로 나타났다. 일내분석의 경우 정밀도는 0.5~2.6이 고 정확도는 90.4~100.5%로 나타나 국제표준화기구에서 설정한(20) 이상적인 측정값인 정밀도 1, 정확도 95~105%

기준에 근접하는 결과를 보였다.

동 클로로필린 나트륨 표준용액을 10, 50, 100 mg/kg의 농도로 시료에 첨가하여 최적의 전처리법(전처리법 3)과 HPLC 방법을 이용하여 회수율을 측정한 결과 농도별로 약 간의 차이를 보였으나, 수용성 식품(캔디류, 음료)의 경우는 104~109%, 유지류(샐러드드레싱)의 경우 농도별로 104~

119%로 나타나 식품 매트릭스별 회수율 평균이 95% 이상 의 좋은 회수율을 나타내었다(Table 5).

(8)

실험실 간 교차검증(inter-laboratory test)

서로 다른 3개의 실험실에서 동 클로로필린 나트륨 검량 선의 R²값을 산출해 직선성을 확인하였고 동 클로로필린 나 트륨을 가장 많이 사용하고 있는 식품군을 선정하여 회수율 과 실험실 간 RSD 값을 산출한 결과는 Table 6과 같이 나타 났다. 세 기관의 R²값은 모두 0.998 이상으로 좋았으며, 각 실험실 회수율은 3개 농도에서 84~121%(RSD 값은 6~16

%)로 나타나 유럽연합(EU Directive SANCO/2007/3131) 의 권장 허용범위인 70~120%에 거의 부합하였으며(21), 향후 공인 분석 방법으로 활용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

요 약

본 연구는 우리나라에서 식품 착색료로 이용되고 있는 동 클로로필린 나트륨의 최적 분석법을 개발하기 위하여 수행 되었다. 제외국의 동 클로로필린 나트륨 분석법을 검토하여 식품 중 동 클로로필린 나트륨 추출방법, HPLC-PDA를 이 용한 기기분석 조건, LC/MS를 이용한 동 클로로필린 나트 륨 유도체 분석을 통하여 동 클로로필린 나트륨 최적 분석법 을 확립하고 분석법의 타당성을 검토한 결과는 다음과 같다.

동 클로로필린 나트륨은 Inertsil ODS-2 column과 1% 초 산을 함유한 메탄올-물(97:3, v/v)을 이동상으로 HPLC- PDA를 이용하여 405 nm에서 분석할 때 우수한 분리능과 머무름 시간, 재현성이 확보된 피크를 얻을 수 있었다. LC/

MS를 이용하여 동 클로로필린 나트륨을 이루는 피크를 분 석한 결과 동 이소클로린 e4가 주 피크의 구성성분임을 확 인할 수 있었다. 확립된 분석법의 타당성을 검증하기 위해 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀도, 정확도, 회수율 및 실 험실 간 교차검증을 실시한 결과, 직선성은 0~700 mg/kg 범위에서 R²=0.9999로 나타났고, 검출한계와 정량한계는 각각 0.1 mg/kg과 0.4 mg/kg으로 나타났다. 정밀도는 일간 분석과 일내분석이 각각 1.6~8.1과 0.5~2.6으로 나타났고, 정확도는 일간분석과 일내분석이 각각 89.2~102.2%와 90.4~100.5%로 나타나 국제표준화기구의 기준에 근접하 였다. 또한, 본 연구에서 개발한 전처리법으로 식품 중 함유 된 동 클로로필린 나트륨 회수율 분석을 실시한 결과 수용성 식품(캔디류)의 경우는 104~109%, 유지류(샐러드드레싱) 의 경우 농도별로 104~119%로 나타나 식품 매트릭스별 회수율 평균이 95% 이상으로 매우 우수하였다. 실험실 간 교차검증을 실시한 결과 세 기관의 R²값은 모두 0.998 이상 으로 좋았으며, 각 실험실 회수율에 대한 RSD 값이 농도별 로 6~16%로 나타나 향후 공인 분석 방법으로 활용 가능하 다는 것을 확인할 수 있었다.

감사의 글

본 연구는 2017년도 식품의약품안전처의 연구개발비(17162

MFDS021)로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

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