항원충성 식물 추출물이 반추위 발효특성, 미생물 성장 및 메탄 발생에 미치는 영향

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이신자^1†・이수경^2†・이상민³・김도형⁴・문여황⁵・이성실^1*

경상대학교 농업생명과학연구원&중점연구소¹, 경상대학교 농업생명과학연구원²,

㈜이지바이오³, 경북도립대학교 축산과⁴, 경남과학기술대학교 동물생명과학과⁵

Effects of Antiprotozoal Plant Extracts on Rumen Fermentation Characteristics, Microbial Growth and Methane Emission

Shin Ja Lee^1†,Su Kyoung Lee^2†, Sang Min Lee³, Do Hyung Kim⁴, Yea Hwang Moon⁵ and Sung Sill Lee^1*

1

Institute of Agriculture and Life Science & University-Centered Labs, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea,

2

Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea,

3

EASY BIO, INC., Seoul 06253, Korea,

4

Department of Animal Science, GyeongBuk Provincial College, Yecheon 36830, Korea,

5

Department of Animal Science & Biotechnology, Gyeongnam National University of Science and Technology, Jinju 52725, Korea

ABSTRACT¹⁾

This study was conducted to investigate the effects of antiprotozoal plant extracts on in vitro ruminal fermentation and methane emission. Ruminal contents were collected from two ruminally-fistulated steers (Average BW: 450±30 kg) consuming 60% Timothy hay and 40% concentrate with free access to water and mineral block. Plant extracts, Lonicera japonica, Torreya nucifera, Zanthoxylum schinifolium, Poncirus trifoliate and Citrus junos, which have been known to have antiprotozoal and antiparasitic effects were added (5% of substrate) to thein vitro ruminal fermentation bottles containing the mixture of rumen fluid and McDougall’s buffer. The McDougall buffer (1000 ml) and ruminal inoculums (500 ml) were combined and 20 ml added to the 50 ml fermentation vessels containing 300 mg of substrate (DM basis). The fermentation vessels were placed in an incubator at 39°C for 3, 6, 9, 12, 24, 48 and 72 h with shaking. Plant extracts addition was decreased (p<0.05) acetate:propionate compared with control except with T. nucifera addition. Total gas production was increased (p<0.05), whereas methane emission was decreased (p<0.05) by all plant extracts compared with control at 12 h incubation. Methane emission at 24 h incubation was decreased for Lonicera japonica, Torreya nucifera, and Zanthoxylum schinifolium compared with control as well. In addition, methanogenic archaea was decreased (p<0.05) by all plant extracts at the 12 h incubation. These results indicate that the plant extracts may decrease methane emission by inhibiting methanogenesis without the decrease of total gas production in 12 h in vitro ruminal fermentation. Therefore, plant extracts which have the antiprotozoal effect may be promising feed additives for ruminants as a methane inhibitor.

(Key words: Antiprotozoal plants extracts, Methane emission, Microbial growth, Real-Time PCR, Rumen fermentation)

* Correspondig author: Lee Sung Sill, Institute of Agriculture and Life Science & University-Centered Labs, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea, Tel: +82-55-772-1883, E-mail: [email protected], [email protected]

†

These authors made an equal contribution to this paper.

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.ko), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. The moral rights of the named author(s) have been asserted.

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Ⅰ. 서론

인류의 산업화가 급격히 진행된 1970 년부터 2000 년까 지 탄소 배출량은 연간 약 0.7%씩 꾸준히 증가하였고, 메 탄과 이산화탄소와 같은 온실가스로 인해 대기 온도가 해 마다 증가되는 등 온실효과가 심각한 상태이다. 지구는 이 미 스스로를 제어하고 방어 할 수 있는 재생 능력이 한계 에 부딪혔다. 해일, 태풍, 가뭄, 지진, 해수면상승, 아열대현 상 등 대자연 재해는 해마다 증가하고 이것은 지구의 자동 온도조절 능력 및 지구의 재생조절 능력의 저하로 나타난 결과이다. 인류의 무분별한 생산과 소비로 인한 파괴는 더 이상 지구 자체재생능력에만 맡기기엔 역부족이 되었다. 또한 역습과도 같이 이러한 기상 이변은 생태계와 사회 경 제 분야에서 지대한 영향을 끼치고 있다.

메탄은 지구온난화에 두 번째로 크게 작용하는 온실가 스로 적외선 흡수율이 높아 이산화탄소의 21 배에 달하는 지구온난화 지수를 가진다. 또한 메탄은 전체 온실가스의 18%를 차지하며, 메탄가스의 40%에 달하는 양은 농업분야 와 반추동물의 장내 발효에 의해 발생된다(IPCC, 2007). 반 추동물의 장내 발효 시 생성되는 메탄의 양을 줄이기 위한 많은 연구가 있었고, 최근에는 식물추출물을 이용하여 메 탄저감 효과를 증명한 연구들도 있다(Guo et al., 2008; Ok et al., 2011).

인동초(Lonicera japonica Thunb.)는 민간 치료로 사용해 왔던 약재로써 항바이러스, 항염, 발열, 해독, 이뇨, 구충 등에 효과가 있다(Yoon, 1998; Lee, 2009). 주요 성분은 cholorogenic acid, isochlorogenic acid 이며, 그 외에도 saponin 과 flavonoid 등이 함유되어 있다(Choi, 2009).

비자나무(Torreya nucifera (L.) Siebold & Zucc.)는 ‘중약 대사전’에 처방이 나올 정도로 구충의 효과가 탁월한 것으 로 알려져 있다. 볶은 비자 나무를 1 개월 가량 매일 150~250g 섭취하면 구충 효과가 있고, 부작용이 없으며 마 늘과 함께 달여 복용하면 효과가 탁월 하다고 한다(Kim, 1998).

산초나무(Zanthoxylum schinifolium Siebold & Zucc.)는 운향과(Rutaceae)의 초피나무 또는 동속 식물의 과피로서 씨를 제거하여 약재로 사용한다(Lee, 1998). 아시아 서부에 주로 서식하는 자생식물로 한국, 일본, 중국 등에서 식품의 향신료로 사용되고 있다. 특유의 향이 있으며 맛은 맵고 성질은 따뜻하여 예로부터 감기, 복통, 설사, 치통, 천식, 요통 등에 쓰여 왔으며 살충작용, 항균작용, 소화불량 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kim, 2003; Lim et al.,

2003). 이전 연구에서는 산초 열매의 항암활성(Han et al., 2011), 항진균 활성(Kim et al., 2008), 산초 뿌리, 줄기 및 잎 추출물의 항산화 및 항혈전 효과(Jang et al., 2005) 등이 밝혀진 바 있다.

탱자나무(Poncirus trifoliata L. Raf.)는 운향과(Rutaceae) 에 속하며 해충에 대한 잠재적 성장억제제로 알려져 있고, 버섯파리 방제효과가 있다는 연구결과가 있다(Lee et al., 2011). 탱자에는 flavonone 성분이 있으며, 장내 세균에 대 한 항균 및 항암, 항염증, 항과민증 항산화 활성, 지질저하 효과가 있다(Yi et al., 2004).

유자나무(Citrus junos Siebold ex Tanaka)는 탱자와 같이 운향과(Rutaceae)에 속하며 열매는 식용이나 조미료로 사 용한다. 유자는 구토, 기침, 담, 두통, 발한, 소화불량, 신경 통, 오심, 요통, 주독, 진통, 진해, 해독, 해수, 행열 등에 효 과가 있다(Kwon, 2014). 유자나무는 운향과인 탱자와 같이 지질저하 효과가 증명되기도 하였는데 지방세포의 분화를 35%이상 억제시켰다는 보고도 있다(Choi et al., 2010).

위에 언급한 5 가지 식물 추출물은 공통적으로 항산화, 항균 및 항원충성 효과를 가지고 있다. 식물 추출물을 이 용하여 반추위내 메탄 저감 효과를 증명한 연구(Guo et al., 2008; Ok et al., 2011)에서도 식물체가 갖는 항균 효과 에 주목하고 있다. 본 시험은 식물 추출물이 항원충성 효 과, 즉 protozoa 등과 같은 메탄을 생성하는 미생물의 성장 을 억제시키거나 사멸하여 메탄 저감을 할 수 있다는 전제 하에 수행되었다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시동물 사양관리 및 시험위액

국립 경상대학교 야생동물보호센터에서 사육중인 반추 위 cannula가 장착된 한우(체중 450kg±30kg)로부터 in vitro 반추위 발효 시험에 필요한 위액을 채취하였다. 공시 동물은 농후사료와 조사료(timothy)를 40:60의 비율로 체 중의 2%를 1일 2회(09:00시 및 17:00시) 분할 급여하였고, 물과 미네랄 블록은 자유 섭취토록 하였다.

시험용 위액은 오전 사료 급여 시간 전에 반추위에 장착 된 cannula를 통하여 채취하였고, 4겹의 cheese cloth에 걸 러서 O2-free-N2가 충진 된 보온용기에 담아 실험실로 운반 하였다. 반추위액은 시험에 사용하기 전 잔여 사료 입자를 제거하기 위하여 2겹의 cheese cloth로 다시 걸러냈다.

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2. 식물추출물 및

in vitro

^시험설계

식물추출물 5종(Table 1)은 한국식물추출물은행(충청북 도 청주시 청원구 오창읍 연구단지로 30)에서 methyl alcohol 99.9%로 추출하여 동결건조 된 상태로 20mg씩 분 양 받았다. 기질인 timothy는 65℃ dry oven에서 24시간 건조시킨 다음 2mm screen으로 분쇄 한 후 3cm×3.5cm 크 기로 자체 제작한 nylon bag(Ankom forage bag: R1020)에 넣어 heat sealing하였다. AOAC법(2012)으로 분석한 timothy의 화학적 조성은 수분 8.87(%), 조단백질 13.37(%

DM), 조지방 2.25(% DM), 조섬유 21.87(% DM), 조회분 8.62(% DM), NDF 53.18(% DM), ADF 30.57(% DM) 및 hemicellulose 22.61(% DM)였다. 혐기상태를 유지하기 위 해 in vitro 시험 내내 질소 가스를 계속 주입하였다. 50ml serum bottle에 질소로 bubbling한 McDougall’s buffer(1948)와 반추위액을 2:1 비율로 섞은 용액 20ml, timothy 0.3g을 각각 넣고 대조구를 제외한 첨가구에 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA) 1ml로 희석한 인동초(L. japonica), 비자나무 잎(T.

nucifera), 산초나무 잎(Z. schinifolium), 탱자(P. trifoliata), 유자나무 잎(C. junos) 추출물(20mg/ml)을 기질의 5%(v/w)씩 첨가한 후 butyl rubber stopper와 aluminum cap으로 밀봉하였다. 각 처리구별 배양은 39℃의 shaking incubator(Jeio Tech, SI-900R, Daejeon, Korea; 120rpm)에 서 시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72 시간)로 3반복으로 수 행하였다.

3. 조사 항목 및 조사 방법

3.1. pH

Weaton decapper(Weaton, USA)를 이용하여 serum bottle의 aluminum cap 및 butyl rubber를 제거 한 후, 배 양액의 pH를 pH meter(Mettler Toledo, MP230,

Columbus, OH, USA)를 이용하여 측정하였다.

3.2. 건물 소화율

물을 채운 수조에 50ml serum bottle에서 수거한 nylon bag을 넣고 Heidolphs rotamax 120(Heidolph Instrument, Germany)를 이용하여 100rpm으로 20분씩 3 회 세척하였다. 세척한 nylon bag은 65℃ dry oven (Jeio Tech, Daejeon, Korea)에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량 을 측정하였다.

3.3. Ammonia-N

Chaney와 Marbach(1962)의 방법에 따라 phenol color reagent와 alkali-hypochlorite reagent로 배양액의 ammonia -N를 발색한 후 spectrophotometer(Bio-Rad Model 680, CA, USA)를 이용하여 630nm에서 O.D. (Optical density) 값을 측정하였다.

3.4. 미생물 성장량

배양액을 1.5ml E-tube에 1ml 채취한 후 3,000rpm에서 3분간 원심분리 하여 사료입자를 제거하였다. 원심분리한 상등액을 새로운 E-tube에 채취하여 미생물 pellet 침전을 위해 14,000rpm에서 3분간 재원심분리하였다. 재원심분 리한 E-tube에 상등액을 제거한 후 sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 1ml 첨가하여 vortex로 교반시키는 세척 과정을 3회 반복 한 후 spectrophotometer (Bio- Rad)를 이용하여 550nm에서 O.D. 값을 측정하였다.

3.5. 휘발성지방산(VFA)

배양액을 1.5ml E-tube에 1ml 채취한 후 12,000rpm 에서 3분간 원심 분리하여 사료입자를 제거하고, 상등 액을 0.20㎛ syringe filter로 여과 후 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, Agilent-1200, Germany)로 분석하였다. 시료의 주입량은 20였고, 이

Table 1. The information regarding antiprotozoal plant extracts used in the experiment

1)

Plant extracts were obtained from Plant Extract Bank (PEB) at Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.

2)

Botanical name refer to Korean Plant Names Index Committee (http://www.nature.go.kr/kpni/index.do).

KRIBB number

¹⁾

Botanical name

²⁾

Scientific name Family name Part

002-074 Japanese honeysuckle Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae Leaf 002-049 Japanese torreya Torreya nucifera (L.) Siebold & Zucc. Taxaceae Leaf 008-058 Mastic-leaf prickly ash Zanthoxylum schinifolium Siebold & Zucc. Rutaceae Leaf

012-096 Trifoliate Orange Poncirus trifoliata (L.) Raf. Rutaceae Fruit

023-082 Fragrant Citrus Citrus junos Siebold ex Tanaka Rutaceae Leaf

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동상 용액은 0.0085N H2SO4을 사용하였으며, 유속은 0.6ml/min이었다. Column은 300mm×7.8mm I.d.

MetaCarb 87H(Varian, Palo Alto, San Francisco, USA) 를 사용하였으며, column 온도는 35℃에서 사용하였다.

3.6. 총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량

총 가스 발생량은 serum bottle의 head space에 있는 가스를 detachable pressure transducer 및 digital read-out voltmeter(Laurel Electronics, CA, USA)를 이 용하여 측정하였고(Theodorou et al., 1994), 메탄 및 이 산화탄소 함량은 GC(HP 5890 Gas Chromatography, Wilmington, Delaware, USA)를 이용하여 분석하였다.

시료의 주입량은 1ml였고, TCD detector를 사용하였으 며 column은 30m×0.53mm(Carboxen 1006 Plot Capillary, Sigma-Aldrich Chemical St. Louis, MO, USA)을 사용하였다.

3.7. Real-Time PCR

배양액 1ml을 E-tube에 채취하고, 3,000rpm, 3분간 원심 분리하여 사료 입자를 제거한 후, Soil Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany)를 이용하여 DNA 를 추출하였다. 추출한 DNA의 농도를 측정하기 위하여 nano-drop(Thermo Scientific, Wilmington, Delaware USA)을 사용하였다. 사용한 primer는 Table 2와 같으 며, 시험에 사용하기 전 10pmol로 희석하였다. 0.2ml PCR tube(PCR-0208-FCP-C, Corning Axygen, New York, USA)에 10mg/㎕로 보정한 DNA와 증류수를 섞

어 9㎕ 분주하고, primer 1㎕와 SYBR Green(Code:

QPK-201, Toyobo, Japan) 10㎕를 섞은 pre-mixture 를 11㎕ 분주하여 총 20㎕가 되게 하였다. Real-Time PCR(CFX96TM, BIO　RAD)을 이용하여 Ct 값을 구하 였고, total bacteria를 reference gene으로, 섬유소 박테 테리아(Ruminococcus albus, Ruminocuccus flavfaciens, Fibrobacter succinogenes)와 Methanogenic archaea 및 Ciliate associated methanogen을 target gene으로 하였고,

2-△Ct(Target)-△Ct(Control) 계산법으로 미생물 군집변화를 비

교하였다.

4. 통계처리

통계처리는 SAS package program(1996)의 General linear model(GLM) procedure에 따라 처리하였으며, 각 처리구간의 유의성 검증을 위해 분산분석을 실시 후, Duncan’s multiple range test로 5% 수준에서 유의 성을 검정하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 발효성상 및 미생물 성장량

항원충성 식물 추출물을 첨가한 시험에서 배양시간 대에 따른 발효성상(pH, 건물소화율, 암모니아 농도) 및 미생물 성장량은 Table 3과 같다.

Table 2. PCR primers for Real-Time PCR assay

1)

Forward primer

²⁾

Reverse primer.

Target group Primers Reference

Total bacteria FW

¹⁾

: CGG CAA CGA GCG CAA CCC

Denman and McSweeney, 2006 RV

²⁾

: CCA TTG TAG CAC GTG TGT AGC C

Fibrobacter succinogenes FW: GTT CGG AAT TAC TGG GCG TAA A RV: CGC CTG CCC CTG AAC TAT C

Ruminocuccus flavfaciens FW: CGA ACG GAG ATA ATT TGA GTT TAC TTA GG RV: CGG TCT CTG TAT GTT ATG AGG TAT TAC C

Ruminococcus albus FW: CCC TAA AAG CAG TCT TAG TTC G Koike and

Kobayashi, 2001 RV: CCT CCT TGC GGT TAG AAC A

Methanogenic archaea FW: TTC GGT GGA TCD CAR AGR GC Denman et al.,

RV: GBA RGT CGW AWC CGT AGA ATC C 2007 Ciliate associated

methanogen

FW: GAG CTA ATA CAT GCT AAG GC Skillman et al.,

RV: CCC TCA CTA CAA TCG AGA TTT AAG G 2006

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Table 3. Effect of antiprotozoal plant extracts on ruminal fermentation characteristics in in vitro incubation

a,b,c,dMeans with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

pH는 배양 시간이 지날수록 점점 감소하고 있다. pH는 배양 3시간대, 6시간대, 48시간대, 72시간대에 탱자 추출물 첨가구와 유자나무 잎 추출물 첨가구에서 유의적(p<0.05) 으로 높았으며, 배양 24시간대에 인동초 추출물 첨가구를 제외한 전 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 높았다. 반추위내 적정 pH는 5.0~7.5 사이로, 반추위내 pH가 너무 낮거나 반대로 너무 높으면 반추위

미생물 활력이 저하되어 소화장애가 나타날 수 있다 (Ørskov and Frasr, 1975; Stewart, 1997)고 한다. 본 연구에 서 측정된 초기 pH가 식물 추출물을 첨가한 다른 연구 (Lee et al., 2011; Ok et al., 2001; Piya et al., 2001)에 비해 다소 높게 측정되었는데, 시간이 지날수록 pH는 떨어지고 있고, 측정된 pH 범위가 6.03~7.42로 적정 pH 범위에 속 하기 때문에 발효가 정상적으로 이루어지고 있는 것으로

Incubation

(hr) Control

Treatments Lonicera SEM

japonica Torreya

nucifera Zanthoxylum

6.14

^a

^a

판단된다.

건물소화율은 배양 시간이 지날수록 점차 증가하고 있 다. 건물소화율은 배양 48시간대에 비자나무 잎 추출물 첨 가구가 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으나, 그 외 배양시간대에서는 첨가구와 대조구간에 유의적인 차이는 없었다. 본 연구에 사용된 식물 추출물은 flavonoid와 같은 polyphenol 성분들을 포함하고 있으며(Choi, 2009; Kim et al., 2000; Kim and Bea, 2001; Jang et al., 2005; Yi et al., 2004), 이러한 성분들은 반추위내 섬유소 분해에는 영향을 미치지 않는다고 한다(Becker et al., 2013). 본 연구에서는 항원충성 식물추출물의 첨가가 건물소화율에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 평가되었다.

암모니아(Ammonia-N) 농도는 배양 3시간대 비자나무 잎 추출물 첨가구, 산초나무 잎 추출물 첨가구 및 탱자 추 출물 첨가구에서, 배양 48시간대 산초나무 잎 추출물 첨가 구, 유자나무 잎 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮았다. 반면 배양 12시간대 암모니아 농도는 유자나무 잎 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 높았으며 그 외 배양 6시간대, 9시간대, 24시 간대 그리고 72시간대에서는 첨가구와 대조구간 유의적인 차이는 없었다. 반추위내 암모니아 농도는 사료 중 조단백 질의 분해 정도를 나타내며(Chamberlain and Thomas, 1979), 건물 섭취량과 소화율은 암모니아 농도가 20mg/100ml로 높게 유지될 경우 최대가 된다(Mehrez et al., 1977). 그러나 반추위 내 암모니아 농도가 84mg/100ml 이상이 될 경우 간에서 처리할 능력이 한계치에 도달하여 중독증상이 나타나기도 한다(Stiles et al., 1970). 본 시험에 서 암모니아 농도는 배양 12시간대에 잠깐 떨어진 이후 지 속적으로 증가하다 배양 48시간대에 급격히 증가한다. 본 시험에서 배양 48시간대에 암모니아태 질소의 농도가 급 격히 증가하는 것은 미생물 사멸에 의한 세포의 용해 때문 이라 생각되며(Van Soest, 1994), 본 시험의 암모니아 최대 농도가 30.66mg/100ml인 것으로 보아 중독 증상은 나타나 지 않을 것으로 판단된다.

미생물 성장량은 배양 3시간대에 탱자 추출물 첨가구와 유자나무 잎 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮았으며, 배양 6시간대에 산초나무 잎 추출 물 첨가구와 탱자 추출물구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮았다. 그 외 시간대에서 첨가구와 대조구간 유의적인 차이는 없었다. 반추위 박테리아는 유도기, 대수 생장기, 정지기 및 사멸기 등으로 성장 곡선을 그릴 수 있 다. 본 시험에서는 배양 24시간대에 미생물 성장량이 최대 가 되었다가 이 후 감소하는 경향을 나타내고 있는데, 이

는 반추위 박테리아의 성장곡선과 일치 하였다. 앞서 언급 했듯 첨가한 항원충성 식물 추출물에는 flavonoid와 같은 polyphenol 성분들을 포함하고 있고, 이러한 성분들은 장 내 균총 개선(Day, 2000) 및 그람 양성균에 항균 작용을 한 다(Mirzoeva et al., 1997)고 알려져 있다. 또한 flavonoid와 같은 polyphenol 성분들은 protozoa 및 methanogens 등을 억제하여 메탄 생성을 억제하기도 한다(Patra and Saxena, 2010). 본 시험에서 첨가구와 대조구간 유의적인 차이가 없 었던 것으로 보아 항원충성 식물 추출물은 미생물 성장에 는 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

2. 휘발성지방산(VFA)

항원충성 식물 추출물을 첨가한 시험에서 배양시간대에 따른 휘발성지방산의 결과는 Table 4와 같다. Acetic acid 농도는 배양 3시간대 인동초 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 배양 6시간대 산초나무 잎 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 다른 시간대에서는 첨가구와 대조구간 유의적인 차이는 없었다. Propionic acid 농도는 배양 3시간대 전 추 출물 첨가구에서 대조구 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다.

반면, 배양 9시간대에 탱자 추출물 첨가구와 유자나무 잎 추출물 첨가구에서 유의적(p<0.05)으로 낮았으며, 배양 24 시간대에서는 첨가구(인동초 추출물 첨가구, 비자나무 잎 추출물)에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 그 외 다른 배양 시간대에서는 유의적인 차이는 없었다. 탄수화 물이 반추위내 유입되면 미생물에 의해 휘발성지방산이 생 성되는데, 생산된 휘발성지방산은 주로 acetate, propionate, butyrate 등이며 이들은 곧바로 제 1위로 흡수되어 숙주동 물의 주된 에너지원으로 이용된다(Casper et al., 1990). 반 추위내 휘발성지방산의 생산량과 생성비율은 사료조성, 급 여방법, 급여량에 따라 달라지며(DePeters and Taylor, 1985; McCarthy et al., 1989), 농후사료를 다량 급여할 경 우 propionate와 lactate가 다량 생성되어 반추위내 pH가 낮아져 미생물 균형에 이상이 생길 수도 있다(Hungate, 1966; Nagaraja et al., 1986). 본 시험에서 배양 3시간대를 제외한 전 시간대의 A/P 비율은 1.36~1.94 사이였으며, 배 양 24시간대에서는 전 추출물 처리구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 그 이유는 propionate의 농도 가 acetate의 농도보다 높기 때문이며, propionate 농도가 높으면 반추위 내 수소 농도를 감소시켜 간접적으로 메탄 발생량을 저감시킨다(Jouany and Morgavi, 2007). 본 시험 에서 항원충 식물 추출물은 propionate의 생성비율을 증가

(7)

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Table 4. Effects of antiprotozoal plant extracts on the concentration of total and individual VFAs in in vitro incubation

a,b,c

Means with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

시키는 것으로 판단되며, 더불어 메탄 저감효과가 있을 것 이라 기대된다.

3. 총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량

항원충성 식물 추출물을 첨가한 시험에서 배양시간대에 따른 총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량의 결과는 Table 5과 같다. 총 가스 발생량은 배양 시간이 늘어날수록 점점 증가하고 있으며, 배양 3시간대와 6시간대에서 유자나무 잎 추출물 첨가구가 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮 았다. 그러나 배양 24시간대에 탱자 추출물 첨가구, 배양

48시간대에 유자나무 잎 추출물 첨가구를 제외한 전 첨가 구 그리고 배양 72시간대 전 첨가구에서 총 가스 발생량이 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 메탄 발생량은 배양 9시간대 유자나무 잎 추출물 첨가구에서, 배양 12시 간대에 전 첨가구에서, 배양 24시간대에 인동초 추출물 첨 가구, 비자나무 잎 추출물 첨가구, 산초나무 추출물 첨가구 에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 이산화탄 소 발생량은 배양 9시간대 비자나무 잎 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 배양 12시간대 에 전 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았 으며, 다른 배양시간대에서는 첨가구와 대조구간 유의적인

Incubation

(hr) Control

Treatments Lonicera SEM

japonica Torreya

nucifera Zanthoxylum

schinifolium Poncirus

1.79

^ab

1.86

^a

0.59 0.44 0.02 0.11 0.07 0.04 0.06

(8)

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Table 5. Effect of antiprotozoal plant extracts on cumulative gas productions in in vitro incubation

a,b,c

Means with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

차이는 없었다. 반추동물이 사료를 섭취하면 반추위 미생 물에 의해 휘발성지방산과 이산화탄소로 분해되며, 섭취한 사료 에너지의 약 3~15%가 메탄으로 전변된다(IPCC, 2007). 반추위내 이산화탄소는 전체 가스량의 65.5% 정도 로 가장 많은 비율을 차지하고 있으며, 메탄은 26.8%, 그 외 질소 7.0%, 산소 0.5%, 수소 0.2% 정도 차지한다(Ishler, 2010). 그러나 본 연구에서 총 가스 발생량 중 이산화탄소 및 메탄의 발생 비율이 문헌에 비해 낮았는데, 이는 혐기 상태를 유지하기 위해 사용한 가스가 이산화탄소가 아닌 질소로 충진 했기 때문이라 사료된다. 발효과정 중 생성된 상당량의 가스는 트림을 통해 체외로 배출되고, 이로 인해 사료 에너지의 손실이 발생한다(Moss et al., 2000). 따라서 사료비 절감 및 에너지 효율을 위해 반추동물에게 메탄 억 제는 꼭 필요할 것으로 생각된다.

본 연구에서 메탄 발생량은 배양 12시간대와 24시간대 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 감소하였 다. 우선 배양 12시간대를 보면 총 가스 발생량에는 첨가 구와 대조구간 유의적인 차이는 없으나, 이산화탄소 발생 량은 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 감소

하였음을 알 수 있다. 따라서 배양 12시간대에 메탄이 감 소한 것은 메탄의 기질인 이산화탄소의 감소로 인한 것으 로 판단된다. 다음으로 배양 24시간대를 보면 총 가스 발 생량과 이산화탄소 발생량은 첨가구와 대조구간 유의적인 차이가 없으나, 메탄 발생량은 인동초 추출물 첨가구, 비자 나무 잎 추출물 첨가구 그리고 산초나무 추출물 첨가구에 서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 배양 24시간 대 인동초 추출물 첨가구, 비자나무 잎 추출물 첨가구, 산 초나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05) 으로 메탄 발생량이 감소한 이유는 크게 두 가지로 추정되 는데, 한 가지는 앞서 언급했듯 A/P 비율이 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았기 때문이며(Table 5) 또 다른 한가지는 항원충성 식물 추출물에 포함되어 있 는 flavonoid 등과 같은 polyphenol 성분이 반추위내 수소 를 흡수하는 hydrogen sink로써 이용되었기 때문(Becker et al., 2013)이라 판단된다. 항원충성 식물 추출물 5종은 배 양 12시간대와 24시간대에 인동초 추출물 첨가구, 비자나 무 잎 추출물 첨가구 그리고 산초나무 잎 추출물 첨가구에 서 메탄을 억제하는 효과가 있었다. 그러나 배양 48시간대

Incubation

(hr) Control Treatments

SEM Lonicera

japonica Torreya

nucifera Zanthoxylum

292.23

^a

^a

^a

16.43

(9)

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이후부터는 메탄 억제효과가 나타나지 않았는데, 그 이유 는 반추위 미생물이 식물추출물에 내성이 생겨 환경에 적 응함으로써 더 이상의 영향을 나타내지 않기 때문이다 (Cardozo et al., 2004). 지속적인 메탄 억제를 위해 또 다른 연구가 필요할 것으로 판단된다.

4. Real-Time PCR

항원충성 식물 추출물을 첨가한 시험에서 배양시간대에 따른 real-time PCR 결과는 Figure 1, 2와 같다. 배양 12시 간대에 미생물 군집변화를 보면,R. albus의 경우 유자나무 잎 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮게 발현되었으며, M. archea와 Ciliated associated methanogen(CAM)은 전 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮게 발현되었다. R. flavefaciens와 F.

succinogenes은 첨가구와 대조구간 유의적인 차이는 없었 다. 배양 24시간대에 미생물 군집변화는 R. albus와 R.

flavefaciens의 경우 전 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮게 발현 되었고, F. succinogenes는 산초나무 잎 추출물 첨가구와 탱자 추출물 첨가구 그리고 유자나무 추출물 첨가구에서 유의적(p<0.05)으로 높게 발현 되었다.

M. archea는 첨가구와 대조구간 유의적인 차이는 없었으며, 오히려 CAM은 탱자 추출물구와 유자나무 추출물구에서 유의적(p<0.05)으로 높게 발현 되었다.

반추위 내 섬유소를 분해하는 미생물로는 bacteria, protozoa, fungi 등이 있으며, 그 중에서도 cellulolytic bacteria의 역할이 가장 크다. R. albus, R. flavefaciens, F.

succinogenes는 가장 대표적인 cellulolytic bacteria

(Hungate, 1963)로써 섬유소를 분해하여 메탄의 기질인 이 산화탄소와 수소를 생성하며(Latham and Wollin, 1977;

Ntaikou et al., 2008), M. archea는 cellulolytic bacteria에 의해 생성된 이산화탄소와 수소를 전구물질로 하여 메탄 을 생성한다(Shima et al., 2002).

본 시험에서 배양 12시간대에 메탄 발생량이 전 첨가구 에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 감소하였는데, 이 는 메탄생성박테리아인 M. archea와 CAM의 감소 때문이 며, 배양 12시간대의 항원충성 식물 추출물은 메탄생성박 테리아를 억제하는 효과가 있는 것으로 판단된다. 배양 24 시간대에 메탄 발생량은 인동초 추출물 처리구, 비자나무 추출물 처리구, 산초나무 추출물 처리구에서 대조구에 비 해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 이는 cellulolytic bacteria인 R. albus와 R. flavefaciens가 감소하여 메탄생성에 필요한 수 소를 억제했기 때문이라 생각된다. 한편, cellulolytic bacteria가 감소하였음에도 불구하고 건물소화율에는 유의 적인 차이가 없었는데(Table 4), 이는 반추위내 cellulolytic bacteria가 R. albus, R. flavefaciens, F. succinogenes 뿐만 아 니라 Butyrivirio fibrisolvens, Clostridium longisporium, Clostridium locbeadii 등과 같은 cellulolytic bacteria이 반추 위내 서식하기 때문이라 생각된다(Ntaikou et al., 2008).

본 연구는 항원충성 식물 추출물이 반추위 발효 성상과 메탄 발생에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 첨가한 5 종의 추출물은 반추위 발효에는 악영향을 미치지 않았으 며 배양 12 시간과 24 시간에 인동초 추출물 첨가구, 비자 나무 잎 추출물 첨가구 그리고 산초나무 잎 추출물 첨가구 에서 메탄을 억제하는 효과가 있었다. 그러나 본 결과에서 볼 수 있듯 반추위 미생물이 항원충성 식물 추출물에 대한

Fig. 1. Relative quantification analysis of microbial populations in vitro ruminal fermentation by the addition of different antiprotozoal plant extracts at 12 h incubation (Control, no addition; Lonicera japonica ; Torreya nucifera; Zanthoxylum schinifolium ; Poncirus trifoliate; Citrus junos as 5% of substrate).

^a,b,c

Means with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

(10)

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Fig. 2. Relative quantification analysis of microbial populations in vitro ruminal fermentation by the addition of different antiprotozoal plant extracts at 24 h incubation (Control, no addition; Lonicera japonica ; Torreya nucifera; Zanthoxylum schinifolium ; Poncirus trifoliate; Citrus junos as 5% of substrate).

^a,b,c,d

Means with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

적응력이 뛰어나 48 시간 이후부터는 메탄 억제효과가 나 타나지 않았는데, 단일 식물 추출물보다는 여러 추출물을 혼합하여 첨가하는 등 메탄 억제효과가 지속적으로 유지 될 수 있게 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Ⅳ. 요약

본 연구는 항원충성 식물 추출물의 첨가가 in vitro 발효 특성과 반추위내 메탄 생성량 및 protozoa의 성장에 미치 는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 조사료 timothy와 농후사료를 60:40의 비율로 급여한 반추위 cannula가 장착 된 한우에서 반추위액을 채취하였다. 본 실험에 사용한 식 물 추출물은 항원충효과와 항기생충효과가 있다고 알려진 인동(Lonicera japonica Thunb.), 비자나무(Torreya nucifera (L.) Siebold & Zucc.), 산초나무(Zanthoxylum schinifolium (L.) Siebold & Zucc.), 탱자나무(Poncirus trifoliata (L.) Raf.), 유자나무(Citrus junos Siebold ex Tanaka)이며 반추 위액과 McDougall's buffer를 1:2 비율로 혼합한 배양액을 0.3g timothy와 식물 추출물(기질의 5%)이 담긴 50ml serum bottle에 혐기상태를 유지하며 20ml 분주하였다.

Serum bottle은 39℃에서 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72 시간 배 양시켰다. 항원충성 식물추출물의 첨가효과에서 배양 3시 간대를 기준으로 비자나무 잎 추출물 첨가구를 제외한 모 든 첨가구의 acetate:propionate 비가 대조구에 비하여 유 의적(p<0.05)으로 낮았다. 총 가스 발생량은 전 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았고, 메탄발생량은

배양 12시간에 전 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮았으며, 배양 24시간대 인동 추출물 첨가 구, 비자나무 추출물 첨가구, 산초나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 또한, real-time PCR의 결과에서 보면 항원충성 식물추출물의 첨가로 인 하여 메탄발생에 영향을 주는 Methanogenic archaea가 유 의적(p<0.05)으로 그 발현비율이 매우 낮았다. 항원충성 추 출물은 반추위 내에서 프로토조아의 성장을 억제시켜 메 탄발생량을 저감시킬 수 있는 잠재력이 있는 물질로서 사 료 첨가제로서의 개발 가능성이 있는 것으로 평가되었다.

사사

이 논문은 2015년 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재 단의 지원을 받아 수행된 연구임(NRF-2015R1A6A1A0303 1413).

Ⅴ. REFERENCES

1. AOAC. 2012. Official Methods of Analysis of AOAC International, 19th ed. Gaithersburg, Maryland, U.S.A., pp. 1-44.

2. Becker, P. M., van Wikselaar, P. G., Franssen, M. C. R., de Vos, R. C. H., Hall, R. D. and Beekwilder, J. 2013.