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HFS
Original Article / 원저
네 가지 처방의 항산화 및 항암 효과 비교
김홍재
1,2#, 최은옥
2,3#, 김민영
4, 손다희
3, 정진우
2,3, 이상협
5, 박철
6, 최영현
2,3, 홍수현
3*1
부산대학교 약학대학 약학교실,
2동의대학교 항노화연구소,
3동의대학교 한의과대학 생화학교실,
4부산대학교 자연과학대학 생명시스템학과,
5
동의대학교 한의과대학 원전학교실,
6동의대학교 자연생활과학대학 분자생물학과
Comparison of Four Multi-herbal Formulas in Antioxidant and Anticancer Activities
Hong Jae Kim
1,2#, Eun Ok Choi
2,3#, Min Young Kim
4, Da Hee Son
3, Jin-Woo Jeong
2,3, Sang-hyup Lee
5, Cheol Park
6, Yung Hyun Choi
2,3, Su Hyun Hong
3*1
Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Pusan National University,
2Anti-Aging Research Center, Dong-eui University,
3
Department of Biochemistry, Dong-eui University College of Korean Medicine,
4Department of Biological Sciences, College of Natural Sciences, Pusan National University,
5Department of Korean Medical Classics, Dong-eui University College of Korean Medicine,
6Department
of Molecular Biology, College of Natural Sciences and Human Ecology, Dong-eui University
ⓒ 2016 The Korean Medicine Society For The Herbal Formula Study
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ABSTRACT
Objective : In this study, we compared the antioxidant and anticancer properties of four multi-herbal formulas which were recorded in ‘Dongeuibogam’: Gilgyung-tang (GGT), Mokdanpi-tang (MDPT), Samso-eum (SSE), Samchulbobi-tang (SCBBT).
Methods : We checked antioxidant properties of four multi-herbal formula through total phenolic content, radical scavenging activities, protective effects on genomic DNA oxidation. To investigate anticancer effects, we conducted MTT assay and analyzed morphologic change in A549 non-small lung cancer cells.
Results : Total phenolic contents of four multi-herbal formulas were in a rich order of MDPT > SSE > GGT >
SCBBT. Especially, MDPT revealed the highest activity than others in all antioxidant experiments. Our results indicated that treatment of those multi-herbal formulas induced growth retardation in A549 cells and MDPT also showed the highest anticancer effect (IC50=1.374mg/ml) among them.
Conclusions : Our data suggested that MDPT would be a powerful ingredient for lung cancer treatment.
Key words : Antioxidant activity, anticancer activity, multi-herbal formula, Mokdanpi-tang
Ⅰ. 서론
*산화적 스트레스(oxidative stress)는 세포의 증식과 사멸과 같은 다양한 정상적인 생리적 과정을 조절하는 역할을 한다. 또한, 산화적 스트레스는 노화, 퇴행성 질환, 염증 및 암을 포함한 많은 질병의 병리적인 상 황에서도 핵심적인 역할을 한다1,2). 특히 폐는 개개인 이 내인적 요인 뿐 아니라 대기오염, 흡연과 같은 외 인적인 원인으로 발생한 산화적 스트레스에 항상 노출 되어 있다. 이런 산화적 스트레스는 폐 세포의 DNA 손상을 유도하여 폐암의 발생과 진행을 촉진시킬 수 있는 것으로 알려져 있다3).
폐암은 우리나라 뿐 아니라 전 세계적으로 발생 빈 도가 높은 암으로 전체 암 환자 사망률의 약 25%를 차지한다. 70%에 가까운 폐암 환자들은 진단받을 당 시 광범위하게 진행된 병소를 가지고 있거나 전이 병 소(metastatic disease)를 가지고 있어 고식적인 화학 요법 밖에 못 받는 경우가 대부분이다. 이로 인해 폐암 환자는 낮은 생존율을 보이고 있어 새로운 효과적인 치 료제의 개발이 필요한 실정이다4,5). 최근의 여러 연구들 에서 multi-target molecules로 작용하는 천연물 및 여러 천연물이 들어
있는 처방들이 복합적인 기전에 의해 mono-target molecules로 작용하는 약물보다 암의 성장과 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀지고 있다6,7). 이에 본 연구에서는 「동의보감(東醫寶鑑)」 잡병편 (雜病篇) 권칠(券七)·옹저(癰疽) 부분에 기록되어 있 는 폐옹(肺癰)을 치료하는 처방을 항산화능을 통한 폐 암에서 항암 효과를 내는 최적의 후보로 판단하여 선 정하였다8,9). 폐옹은 폐농양과 같은 폐의 염증 상태에 가깝지만, 증상의 유사성으로 인해 폐적(肺積)·폐옹 의 중증(重症)은 폐암의 표현으로 생각되어 진다10). 폐 옹을 치료하는 처방으로는 모두 12가지가 기재되어 있 는데, 이 중 자가포식(autophagy)를 일으키는 것으로 알려진 길경11,12)이 포함된 4가지 처방-길경탕(桔梗湯, Gilgyung-tang. GGT), 목단피탕(牧丹皮湯, Mokdanpi-tang, MDPT), 삼소음(參蘇飮, Samso-eum, SSE), 삼출보비 탕(參朮補脾湯, Samchulbobi-tang, SCBBT)-을 선정 하여 산화적 스트레스를 억제하는 능력을 조사해보았 다. 이와 더불어 A549 비소세포폐암 세포주에서의 세 포성장 억제 효과를 비교하고, 자가포식 유도 여부를 관찰하여 의미 있는 결과를 얻었기를 이를 보고하는 바이다.
# Authors contributed equally.
* Corresponding Author : Su Hyun Hong, Department of Biochemistry, College of Korean Medicine, Dong-eui University, 52-57, Yangjeong-ro, Busanjin-gu, Busan, 47227, Republic of Korea.
Tel : +82-51-850-8664, Fax: +82-51-853-4036, E-mail: [email protected]
∙ Received : October 25, 2016 / Revised : November 11, 2016 / Accepted : November 13, 2016
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 시료 준비
4가지의 처방(길경탕, 목단피탕, 삼출보비탕 및 삼 소음)은 ㈜서경한방약업사(Busan, Korea)에서 각 처 방구성의 형태로 구입하였으며 이들의 구성 한약재는 Table 1에 나타내었다. 열수 추출물을 얻기 위하여 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수로 100℃에서
3시간 동안 추출하였다. 이후 열수 추출액을 여과지 (Whatman No. 3 filter paper, Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 거른 후 동결건조 하였 다. 동결 건조된 분말은 멸균 증류수에 100 mg/ml의 농도로 녹이고, MinisartR Syringe filter (0.2 μm, Sartorius AG, Weender Landstr. Germany)로 거른 후 적정 농도로 희석하여 사용하였으며, 사용 전까지 는 –20℃에서 보관하였다.
Table 1. Composition of four multi-herbal formulas used in this study
Name of Formula Herbal name Dose (g) Total
amount (g)
Gilgyung-tang
Platycodi Radix 4.8
38.8
Fritillariae Bulbus 4.8
Angelicae Gigantis Radix 4
Trichosanthis Semen 4
Coicis Semen 4
Ponciri Fructus Pericarpium 2.8
Mori Radicis Cortex 2.8
Saposhnikovia Radix 2.8
Astragali Radix 2.8
Armeniacae Semen 2
Lilii Bulbus 2
Glycyrrhizae Radix 2
Mokdanpi-tang
Moutan Cortex 5.2
41.6
Cimicifugae Rhizoma 5.2
Platycodi Radix 5.2
Coicis Semen 5.2
Sanguisorbae Radix 5.2
Scutellariae Radix 5.2
Paeoniae Radix 5.2
Glycyrrhizae Radix 5.2
Samchulbobi-tang
Astragali Radix 8
83.6
Ginseng Radix 6
Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 6
Fraxini Cortex 4
Angelicae Gigantis Radix 4
Hoelen cum Pini Radix 4
Ophiopogonis Radix 2.8
Platycodi Radix 2.4
Glycyrrhizae Radix 2
Schizandrae Fructus 1.6
Cimicifugae Rhizoma 1.2
Samso-eum
Ginseng Radix 4
36
Perillae Folium 4
Anthrisci Radix 4
Pinelliae Rhizoma 4
Puerariae Radix 4
Hoelen cum Pini Radix 4
Fraxini Cortex 3
Platycodi Radix 3
Ponciri Fructus Pericarpium 3
Glycyrrhizae Radix 3
2. 총 페놀 함량
각 처방 추출물들에 함유된 총 페놀 함량은 Folin- Ciocalteu reagent가 환원되면 molybdenum이 청색 으로 발색되는 원리를 이용한 Singleton 등의 방법
13,14)에 준하여 측정하였으며, gallic acid (Sigma-
Aldrich Chemical Co.)를 표준물질로 사용하였다. 이 를 위하여 적정 실험 농도로 희석한 시료 50 ㎕에 2%
의 Na2CO3 1 ml을 첨가하고 2분간 실온에 방치한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co. St. Louis, MO, USA)를 50 ㎕를 가하고 실온에 서 30분간 반응시킨 다음 750 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Gallic acid를 이용하여 검량선을 작성하였으 며, 총 페놀 함량은 mg gallic acid equivalents (GAE)/g of sample dry weight (DW)으로 나타내었 다.
3. FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 활성 측정
이 방법은 산성 pH 영역에서 ferric tripyridyltrizaine (Fe3+-TPTZ) 복합체가 환원성 물질에 의해 청색의 ferrous tripyridytriazine (Fe2+-TPTZ)으로 환원되어 593 nm에서 흡광도가 증가 하는 원리15)를 이용한 것 으로 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점 에 착안하여 고안된 실험방법이다. FRAP에 의한 처방 추출물들의 항산화력을 측정하기 위하여 300 mM acetatebuffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ, Sigma-Aldrich Chemical Co.)및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다.
적정 농도로 희석된 시료액 10 ㎕과 240 ㎕의 FRAP 시약을 혼합하고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군(positive control)은 trolox (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 결과는 mg trolox/g of sample DW로 나타내었다.
4. DPPH radical 소거능
처방 추출물들의 항산화력을 측정하기 위한 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazl (DPPH) radical에 대한 전자 공여능은 Blios16)의 방법에 준하여 조사하였다. 이 방 법은 DPPH radical에 전자를 공여함으로써 radical을 소거하는 효과를 측정하는 방법으로 0.4 mM의 DPPH
(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 150 ㎕에 처방 추출물이 적정 농도로 희석된 시료 100 ㎕을 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 518 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 그리고 반응물에 대한 흡광도 값을 대 조군에 대한 처방 추출물 시료의 DPPH radical 소거 활성으로 항산화 활성도를 나타내었으며, trolox를 양 성대조군으로 비교하였으며, 음성 대조군으로는 0.4 mM DPPH 용액 대신 메탄올을 이용한 아래 식에 준 하여 산출하였다.
DPPH radical scavenging activity (%) = 100－
[(OD of sample/ OD of control) × 100]
5. ABTS radical 소거능
추출물들의 항산화력을 측정하기 위한 2,2'-azino- bis(3-ethybenzothiazolin-6-sulphonic acid) (ABTS) radical 소거능은 Re et al.17)의 방법에 준하여 조사 하였다. 이 방법은 Potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 radical이 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법이 다. 7 mM의 ABTS (Sigma-Aldrich Chemical Co.) 와 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 혼합하여 실온, 암하에서 12-16시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 734 nm에 서 흡광도가 0.7 ± 0.02가 되도록 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. 적정농도로 희석한 시료 10 ㎕에 ABTS radical cation solution 190 ㎕ 를 가하여 실온에서 6분간 반응시켜 734 nm 에서 흡광도를 측정하였으며 trolox를 양성 대조군으 로 하여 다음 식에 준하여 항산화 효능을 비교하였다.
ABTS radical scavenging activity (%) = 100－
[(OD of sample/ OD of control) × 100]
6. 세포 배양
본 연구에 사용된 A549 인체 폐암세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)는 10% fetal bovine serum (Welgene, Daegu, Korea) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지 (Welgene)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양 하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하 기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여
적정수의 세포를 유지하였다.
7. genomic DNA (gDNA) 분리
gDNA는 AquaPure Genomic DNA isolation Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이 용하여 사용방법에 따라 A549 폐암 세포로부터 추출 하였다. 이를 위하여 A549 세포를 100 mm dish에 1×105 cells/ml로 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2
incubator에서 24시간 배양 후 세포를 모으고, gDNA lysis 용매를 이용하여 세포를 용해한 후 protein precipitation 용매 100 ㎕를 첨가하였다. 그 후 반응 액을 20초 동안 빠르게 vortex한 후 15,000 ×g에서 3분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 새 로운 튜브에 모으고 100% isopropanol 300 ㎕을 첨 가하였다. 혼합물은 1분 동안 15,000 ×g에서 원심분 리하고 상층액을 제거한 후 건조시켰다. 완전히 건조 후 70% ethanol 300 ㎕를 첨가하여 DNA pellet을 세 척하고, 다시 15,000 ×g에서 1분간 원심 분리하여 상 층액을 제거하고 15분 동안 튜브를 완전히 건조시 켰다. DNA pellet은 DNA hydration 용액에 용해시키 고 5분 동안 65℃에서 반응시킨 후, DNA 순도를 spectrophotometer (DU730, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용한 260/280 nm에서 측정하였다. 그 후 분리된 DNA는 1.5% agarose gel 전기영동으로 확 인하였다.
8. Radical에 의한 DNA 손상 측정
H2O2에 의한 DNA 산화는 Milne et al.18)의 방법에 준하여 실험하였다. 실험을 하기 전에 gDNA의 양은 여러 농도의 gDNA를 전기영동하여 적정 농도를 설정 한 후 FeSO4와 H2O2의 최종 농도는 각각 200 μM과 2 mM이 되게 하여 동량을 첨가하였으며, gDNA 반응액 은 물과 10 mM의 ethylenediaminetetraacetic acid (EDAT, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 4 ㎕를 혼합 하여 최종부피가 40 ㎕가 되게 각 반응액의 부피를 설정하였다. 각 반응액의 부피 설정 후 gDNA, 추출물 시료, FeSO4, H2O2와 물을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 그 후 산화 반응을 정지시키기 위하여 10 mM EDAT 4 ㎕를 첨가하고, 1.5% agarose gel에 100 V로 전기영동하였다. 30분 후 gel을 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염 색하고 AlphaEaseR gel image analysis software
(Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)을 이용하 여 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상의 회복 정도를 관찰하였다.
9. MTT assay
처방 추출물에 의한 세포의 성장억제 정도를 확인하 기 위하여 MTT assay를 이용하였다. 세포 배양용 6 well plate에 A549 세포를 1×105 cells/well로 분주 하여 안정화 시킨 후 각 처방 추출물을 적정농도로 처 리하였다. 24시간동안 배양한 후 희석된 0.5 mg/ml 농도의 MTT용액을 200 ㎕씩 분주하고 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양시킨 다음 배지와 MTT 시약 을 깨끗하게 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 2 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazan crystals을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 ㎕씩 옮겨서 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Versa max, Molecular Devices, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포에 대한 독성은 각각의 대조군의 평균 흡광도 값을 구하여 평균 흡광 도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
10. 도립 현미경을 이용한 세포 형태의 관찰
처방 추출물에 의한 A549 세포의 형태 변화 정도를 살펴보기 위하여 세포배양용 6 well plate에 세포를 1×105 cells/well로 분주하여 안정화 시킨 후 적정농 도로 처방 추출물을 처리하였다. 24시간동안 배양한 후 처방 추출물 처리농도에 따른 성장정도와 형태의 변화를 도립 현미경을 이용하여 50배의 배율로 관찰한 다음 사진 촬영을 하였다.
11. 통계처리
각각의 평가 분석은 3반복 이상으로 하였으며 시료 로부터 얻어진 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하 여 분산분석을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests를 실시하였다. 이때 사용한 모 든 통계분석은 SPSS 17.0 (IBM SPSS Inc, New York, USA) 통계 프로그램을 이용하여 처리하였다.
Ⅲ. 결과
1. 총 폴리페놀 함량
페놀계 물질들은 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic
hydroxyl (OH)기를 가진 방향족 화합물들을 가리키 며, 식물 특유의 색, 맛, 향을 부여한다. 또한 페놀계 물질들은 산화적 스트레스로부터 DNA 및 세포 수준 의 손상을 억제하는 능력이 있는 것으로 알려져 있다
19-21). 이에 여러 가지 한약재로 이루어진 4가지 처방
의 총 페놀 함량을 조사하였다. 4가지 처방의 총 폴리
페놀 함량을 gallic acid equivalents (GAE)으로 구하 였으며 그 값은 Table 2와 같다. 총 폴리페놀 함량은 목단피탕이 126.56±12.98 mg GAE/g으로 가장 높았 으며, 다음으로 삼소음, 길경탕, 삼출보비탕 순서로 함량이 낮아졌다.
Table 2. Total phenolic content and FRAP activity of four multi-herbal formulas. Results are mean±SD (n=3).
Name of formula TPC＊
(mg GAE†/g) FRAP‡
(mg Trolox/g)
GGT 46.35±4.28 21.61±4.27
MDPT 126.56±12.98 166.74±23.17
SSE 74.31±13.82 40.92±3.06
SCBBT 17.66±6.49 49.77±2.82
＊TPC: total phenolic content, †GAE: gallic acid equivalent, FRAP‡: Ferric reducing antioxidant power
2. FRAP 활성 측정
시료의 환원력은 전자공여를 통한 라디칼의 소거능 과 관련이 높은 것으로 알려져 있으므로20), 산화반응 의 촉매제로 작용하는 금속이온을 환원시키는 효력을 측정하는 방법인 FRAP 법을 이용하여 4가지의 처방 의 환원력을 측정하였다. 4가지 처방 중 가장 높은 환 원력을 보인 처방은 목단피탕으로 166.74±23.17 mg Trolox/g으로 가장 낮은 환원력을 보인 길경탕에 비 해 8배가량 높은 값을 나타내었다(Table 2). 이는 총 페놀 함량의 결과와 유사하였으며, 시료 중에 함유된 페놀 화합물의 함량이 높을수록 환원력이 높다는 기존 의 연구와도 일치하는 결과를 나타냈었다14,21).
3. DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH 라디칼에 대한 전자공여능은 비교적 간단하 면서 대량으로 측정이 가능한 항산화 측정법으로 여러 식물로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 활용되고 있다19). 짙은 보라색을 띄는 DPPH 라디칼이 페놀성 화합물, cysteine, glutathione, aromatic amine, ascorbic acid 등에 의해 전자를 얻고 환원되어 탈색 되는 정도를 측정하였다13). 본 연구의 결과에 의하면, 길경탕, 삼소음, 삼출보비탕은 DPPH radical 소거능 이 거의 없었으나, 목단피탕은 저농도부터 높은 소거능 을 보여 농도 의존적으로 소거능이 증가하였다(Fig. 1).
Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of four Korean multi-herbal formulas. Data values are expressed as mean ± SD (n=3).
4. ABTS radical 소거 활성
항산화능을 측정하기 위한 다른 방법으로 ABTS radical 소거능을 측정하였다. 이는 ABTS 자유 라디 칼이 항산화 물질로부터 수소를 받아 ABTS 라디칼 특 유의 청록색이 탈색되는 원리로 물질의 항산화능을 측
정하는 방법으로 DPPH radical 소거 활성과 더불어 널리 사용되는 방법이다22). 이번 실험에서도 목단피탕 이 가장 높은 radical 소거 활성을 보였으나, 나머지 세 가지 처방도 농도가 증가할수록 radical 소거활성이 증가되어 90% 내외의 높은 소거능을 보였다(Fig. 2).
Fig. 2. ABTS+ cation radical donation ability of 4 multi-herbal formulas. Results are the mean ± SD of triplicate date.
5. DNA 손상 억제능 평가
자유 라디칼에 의해 DNA를 비롯한 다양한 생물학 적 분자들에 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다23). 4가지 처방의 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상에 대한 방어 능력을 알아보기 위하여 A549 페암 세포로 부터 gDNA를 추출하여 DNA 밴드의 밀도로 평가하였 다. Fig. 5에 나타낸 바와 같이, H2O2로 손상되어 없
어진 밴드가 처방을 처리하였을 경우 모든 처방에서 밴드가 다시 나타났다. 특히 목단피탕은 저농도에서부 터 좋은 보호 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3). 이는 처방에 포함되어 있는 항산화제 역할 을 하는 화합물들이 H2O2를 비롯한 활성산소종에 의 한 세포 손상을 방어하는 능력이 있음을 보여주는 것 으로 앞선 다른 연구들과 유사하게 목단피탕이 가장 높은 항산화능을 가지고 있음을 알 수 있다.
Fig. 3. Protective effects of 4 multi-herb formulas on genomic DNA oxidation in A549 cells.
6. A549 세포의 생존율에 미치는 4가지 처방의 효과 A549 세포에서 길경탕, 목단피탕, 삼소음, 삼출보비 탕이 유발하는 세포 생존율 감소 현상을 알아보기 위 하여 각 처방을 2 mg/ml까지의 농도로 24시간 동안 처리한 후, MTT assay를 이용하여 조사하였다. Fig.
4에 나타낸 바와 같이 길경탕과 삼출보비탕은 세포 생 존율 억제 효과가 거의 없었으며, 삼출보비탕은 2
mg/ml 농도에서 약 20% 정도의 세포 성장 억제 효과 가 있었다. 하지만, 목단피탕은 저농도에서부터 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, IC50은 1.374 mg/ml으로 4가지 처방 중 가장 생존율 감소 효과가 크게 나타났다. 위의 모든 실험에서 가장 높은 항산화 효과를 보여준 목단피탕이 A549 폐암 세포의 성장 억제 효과도 가장 큼을 알 수 있었다.
Fig. 4. Comparison of four multi-herbal formulas on cell growth inhibition of A549 cells. A549 cells were seeded and stabilized for 24 h. The cells were treated with various concentrations of the indicated 4 prescriptions for 24 h. The alterations of cell viability were measured by MTT assay.
Columns represent the mean ± SD of three independent experiments.
7. A549 세포 형태에 미치는 4가지 처방의 영향 4가지 처방은 모두 공통적으로 길경이 포함되어 있 는데, 길경은 이전 연구에서 폐암과 대장암 세포에서 자가포식을 뚜렷하게 유도하는 것으로 알려져 있다
11,12). 또한 길경의 주요 생리활성 물질인 platycodin
D 역시 폐암을 비롯한 몇 가지 암에서 자가포식을 유 도함이 밝혀졌다6,24). 이러한 길경의 자가포식이 길경
이 포함 되어있는 4가지 처방에서도 유도되는 지를 알 아보기 위하여 세포의 형태를 도립 현미경으로 관찰하 였다. Fig. 5에 나타낸 바와 같이 각 처방마다 정도의 차이는 있지만 모든 처방에서 세포질에 뚜렷한 다수의 공포를 형성하는 것이 관찰되었다. 이는 다수의 실험 에서 길경 및 다른 약물에 의해 자가포식이 유도된 경 우의 형태 변화와 같아 자가포식이 유도되었다고 사료 된다.
Fig. 5. Analysis of morphologic changes in 4 multi-herb formulas-treated A549 lung cancer cells. A549 cells were seeded at 6-well and stabilized for 24 h. The cells were treated with various concentrations of the indicated four formulas for 24 h. Morphologic changes were directly photographed at the indicated times. Magnification, X50.
Ⅳ. 고찰
폐암은 우리나라 뿐 아니라 전 세계적으로 암으로 인한 사망의 중요한 원인이다. 우리나라와 미국에서 폐암으로 진단받는 환자의 85%는 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer)으로 진단받고 있으며, 15%는 소세포폐암(small lung cancer)이다4,7). 우리나 라에서 폐암 환자의 5년 생존율이 1993-1995년 사이 에 11.3%에서, 2008-2012년에는 21.9%로 다소 증가 되었지만, 미국에서의 5년 생존율은 여전히 15%에 불 과하다. 또한 5년 동안 생존하여 치료를 위해 지불하 는 비용이 같은 기간 동안의 1인당 국민 소득의 44.7%에 해당하여 환자와 가족의 경제적인 부담 역시 상당하다25). 광범위하게 진행되었거나 있거나 전이가 된 경우에 신생혈관형성억제제, tyrosine kinase 억제 제 등과 같은 항암화학요법 약물이 개발되고 있으나, 여전히 항암제의 내성 및 부작용 발생은 난제로 남아 있는 실정이다4).
최근의 여러 연구들에서 하나의 표적 분자를 치료
목표로 하는 화학요법제에 비해 여러 가지 성분들이 혼합되어 있는 한약재나 수 종의 한약재로 구성된 처 방들이 새로운 폐암 치료의 대안으로 떠오르고 있다6). 한약재나 처방들은 여러 활성 성분들의 상승 효과에 의하여 항암치료나 방사선 치료 시 암세포에 대한 치 료 효율은 높이면서 정상 세포를 보호, 악성 종양 주 의 조직에서 염증 감소, 면역력 증가 및 환자들의 삶 의 질을 높이고 생존기간을 연장하는 등의 다양한 효 과를 발휘한다26). 실제로 한의학적 이론과 오랜 임상 적 사용 경험을 바탕으로 한국, 중국, 일본 등 여러 나라에서는 전통적인 한약 처방을 단독 또는 항암치료 와 병용으로 널리 사용하고 있고, 이러한 임상적 시도 들이 폐암 치료에서 효과를 나타내는 것으로 알려져
있다27,28). 일례로, 이 등29)의 증례 보고에 의하면 비
소세포폐암 4기로 진단받은 79세 남성이 어떤 수술적 치료나 방사선 요법과 같은 양방적인 치료 없이 약침 과 한약 복용만으로 종양의 크기가 유의적으로 감소하 고 행동 평가에서도 점수가 호전되었다.
악성 종양의 발생에는 DNA의 손상이 매우 중요한 과정이고, 많은 종류의 악성 종양에서 산화적 스트레
스로 인한 DNA 손상이 높은 수준이다30). 특히 폐는 호흡을 주관하여 내부와 외부의 유해물질(대기오염, 흡연 등)에 의해 산화적 손상에 취약하고, 이는 폐암 을 비롯한 폐의 만성 질환 발생의 중요한 원인이 된다
3). 폐암의 경우 흡연자의 흡연의 양과 기간에 따라 질 병의 위험도가 달라지는데 이런 상관관계는 담배 연기 에 포함되어 있는 산화적 스트레스를 유발하는 물질들 에 의해 영향을 많이 받기 때문인 것과 관련이 있는 것으로 알려져 있다1). 항산화능은 지질, 단백질, 탄수 화물, DNA와 같은 여러 가지 생물학적 분자들에 손상 을 일으키는 free radical에 전자나 수소 원자를 공여 하여 안전한 상태로 전환시키는 능력을 의미한다22). 항산화능을 가지고 있는 항산화제는 세포를 보호하는 효과를 보이는데, 항산화제로 잘 알려진 vitamin C나 E의 높은 섭취가 폐암을 예방하는 효과가 있는 것으 로 조사된 것과 일맥상통한다31,32).
폐(肺)는 오장(五臟)의 화개(華蓋)로 훈증(熏蒸)에 처 하며, 기(氣)를 관장하며 그 상태는 피모(皮毛)에 반영 된다. 폐의 생리적 기능이 무너지면 폐옹(肺癰), 폐저 (肺疽), 폐적(肺積), 폐암(肺癌) 등의 질병이 발생한다.
문헌상에서 직접적으로 폐암이라는 용어는 찾아볼 수 없으나, 증상으로 미루어 보아 폐적·폐옹의 중증(重 症)은 폐암의 표현으로 생각된다10). 이에 본 연구에서 는 폐옹 치료 처방을 이용하여 항산화능과 폐암 세포 억제 효과를 조사해보았다. 선행 연구에 의하면, 길경 탕은 가미길경탕과 더불어 폐암에서의 항암 효과를 조 사한 결과, 동물 실험에서 암세포의 증식, 전이를 억 제시키고 면역 세포의 수는 증가시키는 효과를 보였다
33). 아울러 길경탕은 정상 세포에 손상을 주지 않으면 서 암세포의 형태 변화 및 독성 효과를 보였으나, 삼 소음은 정상 세포와 폐암 세포에 모두 독성을 나타내 었다34). 그리고 삼출보비탕은 기관지확장증과 폐렴이 병발한 환자를 폐옹으로 변증하여 육미지황탕, 가미진 해탕과 같이 투여하여 양방적인 약물치료 없이 한방치 료만으로 임상증상, 방사선 검사 및 임상병리 검사에 서 호전되는 효과를 얻었다35). 이상과 같이 길경탕, 삼소음, 삼출보비탕은 실험적 및 임상적 연구가 몇 편 있었지만, 목단피탕의 경우는 거의 연구가 이루어진 바 없다. 또한 4가지 처방의 항산화능과 항암 능력을 비교하여 관련성을 연구는 없는 실정이다. 이번 논문 에서 목단피탕은 총페놀함량이 가장 높았으며, 모든 항산화능을 가늠해보는 실험에서 가장 높은 활성을 나
타내었으며, 폐암 세포의 증식 억제 효과도 가장 좋았 다. 이는 항산화능을 가진 물질이 폐암 세포에서 강한 세포독성 효과를 나타내는 다른 논문들과 같은 결과이 다36).
Ⅳ. 결론
폐옹을 치료하는 처방 중 길경이 포함된 4가지 처방 인 길경탕, 목단피탕, 삼소음, 삼출보비탕의 항산화능 평가를 위하여, 총 페놀 함량, FRAP 활성, DPPH 라 디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, DNA 손상 억제능 을 조사한 결과 모든 항목에서 목단피탕이 가장 높은 효과를 나타내었다. 또한, A549 폐암 세포의 성장 억 제 효과를 비교해 보았을 때도 목단피탕이 역시 세포 성장을 가장 효과적으로 억제하면서, 4가지 처방 모두 에서 세포자식이 유도된 것으로 보이는 세포질 내 뚜 렷한 공포를 확인하였다. 이러한 결과는 항산화능이 가장 높은 목단피탕이 A549 폐암 세포에서의 항암 효 과도 가장 큼을 나타낸 결과로 목단피탕이 효과적인 폐암 치료제로의 가능성이 높을 수 있음을 시사하는 기초 연구로서 가치가 있을 것으로 생각된다.
감사의 글
이 논문은 2016학년도 동의대학교 교내연구비에 의해 연구되었음(과제번호: 201601030001).
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