자연폐경 한국여성에서 종양괴사인자 유전자 다형성과 호르몬치료 후 골밀도 변화 사이의 연관성에 관한 연구
인제대학교 의과대학 산부인과학교실, 서울대학교 의과대학 산부인과학교실1
전성욱․김정구1
The Relationship between Polymorphisms in Tumor Necrosis Factor (TNF) Genes and Changes in Bone Mineral Density after Hormone Therapy in
Postmenopausal Korean Women
Sungwook Chun, Jung Gu Kim1
Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, Inje University, Seoul National University1
Objectives: To determine the association between polymorphisms in tumor necrosis factor-α (TNF-α), and TNF-β genes, and changes in bone mineral density (BMD) after hormone therapy (HT) in postmenopausal Korean women.
Materials & Methods: The TNF-α G(-308)A, C(-857)T, C(-863)A, T(-1031)C, and TNF-β A252G polymorphisms were analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) or Taqman assay in 218 postmenopausal Korean women receiving sequential HT for 1 year. Bone mineral density (BMD) at the lumbar spine and femoral neck was examined by dual energy X-ray absorptiometry.
Serum levels of bone specific alkaline phosphatase (BAP), osteocalcin (OST), type I C-telopeptide breakdown products (CTX), parathyroid hormone (PTH), calcium, and phosphorus were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoassay, and atomic absorptiometry, respectively.
Results: No significant associations were found between single genotypes of TNF-α, or TNF-β polymor- phisms and the annual percentage changes of BMD at the lumbar spine and femoral neck after HT.
Haplotype analysis of 4 TNF-α polymorphisms did not show any significant association with the annual percentage changes of BMD at the lumbar spine and femoral neck after HT. The changes in serum levels of bone markers 6 months after HT were not related with single genotypes or haplotype genotypes of TNF polymorphisms. The distribution of these single or haplotype genotypes were not different between HT responders and HT non-responders (women who lose >3% of bone mass per year).
Conclusions: The TNF-α G(-308)A, C(-857)T, C(-863)A, T(-1031)C, and TNF-β A252G polymorphisms are not associated with changes in BMD after HT in postmenopausal Korean women.
Key Words: Korean postmenopausal women, TNF, Gene polymorphism, Hormone therapy, BMD
Received: May 3, 2010 Revised: June 1, 2010 Accepted: June 22, 2010
Corresponding Author: Jung Gu Kim, Department of Obstetrics and Gynecology, Seoul National University Hospital, 28 Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seoul 110-744, Korea
Tel: +82-2-2072-3256, Fax: +82-2-762-3599, E-mail: [email protected]
* 본 연구는 2005년도 보건의료기술연구개발사업(#A050005)의 지원에 의해 이루어진 것임.
골다공증은 가장 흔한 대사성 골질환의 하나로 골 강도의 손상으로 골절의 위험이 증가하는 전신성 골 격계 질환으로 정의될 수 있다.1 골다공증은 만성 통 증과 장애, 골절로 인한 사망 등으로 이어질 수 있는 질환으로 주로 노인층, 특히 폐경 여성에서 폐경 후 급격한 골소실로 인해 발생하며, 특히 최근의 한국 과 같이 고령화 추세에 있는 사회에서 문제가 되므 로 이와 관련하여 골다공증의 병인을 찾기 위한 노 력이 경주되고 있다.
골다공증성 골절은 주로 고령 여성에서 발생하나, 그 소인은 유전적 및 환경적 요인들로 인하여 어려 서부터 내재되어 존재하는 것으로 알려져 있다. 골 강도의 70% 정도가 골밀도로 설명이 가능하며, 그 러한 골밀도 변이의 70%가 유전적 요인에 의해 좌 우된다는 것이 쌍생아 가계 연구 결과 알려져 있다.2 또한 다른 연구들에서도 골다공증 발생에 있어서 유 전성 요인이 중요한 요소로 작용하는 것으로 알려져 있어,3,4 이에 대한 유전적 인자를 찾으려는 노력이 진행되고 있다.
골다공증 병인에 대한 유전적 요인을 찾으려는 노 력과 관련하여 골다공증의 유전적 기전을 표적유전 자(target gene)의 DNA 유전자 다형성(gene polymor- phism)을 연구함으로써 밝히고자 하는 연구들이 가장 널리 이용되고 있다. Morrison 등이 비타민 D 수용체 (VitaminD receptor, VDR) 내 유전자 다형성이 골밀도 와 밀접한 상관관계를 보인다는 연구를 발표하여 전 세계적으로 주목을 받은 이래,5 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor: ER) 내 유전자 다형성,6 골기질 단 백인 1형 교원질(type I collagen)의 유전자 다형성7을 포함하여 골밀도와 관련된 표적유전자를 찾기 위한 수많은 연구가 시행되어 왔으나, 연구 디자인 및 연 구 대상의 인종적 차이 등으로 그 결과에 상당한 차 이를 보여왔다.8 김 등은 한국여성에서 특이적인 골 다공증 유전자를 검색하는 연구를 진행하여 ER 유전 자 PvuII와 XbaI 다형성,9 VDR 유전자 BsmI과 TaqI 다형성 양상10 및 poly (A) microsatellite,11 인슐린 유사 성장인자 유전자(CA) 다형성 양상12이 골밀도를 조절 하는 유전인자라는 것을 보고한 바 있으며, 최근에는 OPG 유전자 내 G1181C 유전자 다형성이 골밀도와 연관이 있음을 보고한 바 있다.13
폐경 여성에서 에스트로겐의 결핍은 골 흡수(bone resorption)를 촉진하여 골다공증의 위험을 증가시키 므로, 폐경 후 호르몬 치료가 골다공증의 발생을 억 제한다는 것은 알려진 사실이다. 2002년 Women's Health Initiative (WHI)의 에스트로겐-프로게스토겐 치료 연구가 조기 종결된 이후 폐경 여성의 호르몬 치료에 대하여 논란이 있었던 것이 사실이나, 2007년 국제폐경학회(International Menopause Society)에서는 호르몬 치료의 폐경과 연관된 골량 감소를 방지함으 로써 골다공증 관련 골절 발생을 경감시키는 효과에 주목하여, 특히 60세 이하의 골절 위험이 증가된 폐 경 여성에서는 1차적인 치료로 고려할 수 있다고 권 고한 바 있다.14 또한 WHI 연구에서도 호르몬 치료가 골반 골절 및 척추 골절을 33∼39%까지 의미 있게 감 소시키는 효과를 보였다고 이미 언급한 바 있다.15,16 그러나 호르몬치료에도 불구하고 계속적으로 골소실 이 발생하는 경우처럼17 치료에 대한 개인적 차이가 유전적 요인에 기인될 가능성이 있으므로, 골다공증 의 예방에 있어서 그 반응도를 예측하고 더 나아가 맞춤 치료까지도 가능하게 할 수 있을 것으로 여겨지 는 유전인자를 규명하는 것은 호르몬 치료의 근간이 될 수 있으나, 아직 이러한 유전인자가 정확히 규명 된 바가 없어 이에 대한 연구가 필요하다.
현재까지 호르몬 치료에 대한 골반응도와 유전인 자와의 연관성에 대한 연구는 골밀도와의 연관성에 대한 연구에 비해 상대적으로 적은 것으로 알려져 있다. 일본 여성에서 VDR Taq I 다형성,18 코카시안 여성에서 VDR 유전자 BsmI 및 에스트로겐 수용체 (ER)와 TaqI 다형성 양상, 에스트로겐 수용체(ER) 유 전자 PvuII와 XbaI 다형성 양상 등이 호르몬 치료에 대한 골반응도에 영향을 미칠 수 있는 인자로 제기 된 바 있으며,19 TGF-β1 TC 유전자 다형성의 경우 일본 폐경여성에서 활성 비타민 D 투여에 대한 골 반응도와 연관성이 있다고 보고하였다.20 서울대학 교 산부인과학교실에서는 한국폐경여성에 대한 연 구를 진행하여 VDR bT haplotype 대립인자가 호르 몬 치료 후 요추 골밀도변화와 연관이 있다고 보고 한 바 있으며,21 그 외 calcitonin (CA) 유전자 다형성 과 인슐린 유사성장인자-I (IGF-I) 유전자 다형성의 일부 유전자형 역시 호르몬치료 후 골밀도 변화에
영향을 줄 수 있다고 보고한 바 있다.22,23
T 세포에서 분비되는 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 골다공증의 병인에 있어 중요한 인자 중 하나로 간주된다. TNF는 특히 골 흡수 촉진과 연 관이 있는 시토카인으로 알려져 있으며, 이 과정에서 에스트로겐의 결핍이 중요한 작용을 하는 것으로 알 려져 있다.24-26 이러한 TNF의 골다공증에서의 역할과 관련하여 TNF의 유전자 다형성과 골밀도 및 골다공 증과의 연관성에 관한 연구들이 꾸준히 진행되어 왔 으나, 아직까진 그 결론이 명확하지 않다. Ota 등27과 Furuta 등28은 일본 폐경여성에서 TNF-α C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C 유전자 다형성과 골밀도와의 연관성에 대해 연구하여 일부 유전자 다형성의 대립 유전자 빈도가 요골 및 척추 골밀도와 연관성이 있었 다고 보고하였으며, Lee 등29은 크론병을 가진 호주 인에서 TNF-α G (-308)A, C (-857)T 유전자 다형성 의 일부 haplotype 유전자형이 요추와 엉덩이뼈에서 의 골밀도와 상관관계가 있다고 보고한 바 있다. 그 외 민족 및 인종에 따라 TNF 유전자 다형성과 골밀 도와의 연관성에 대한 다양한 연구 결과들이 보고되 고 있는데, 일부 유전자 다형성의 유전자형에서의 연 관성을 보고한 연구들도 있으나,30,31 반면 그 연관성 을 입증할 수 없었다고 보고한 연구들도 있다.32-34 그러나, 현재까지 TNF-α 및 -β 유전자 다형성과 호르몬 치료 후의 골밀도와의 연관성에 대한 연구는 발표된 적이 없으므로, 이에 본 연구자들은 최초로 인종학적으로 순수한 한국 자연폐경여성에서 TNF- α, TNF-β 유전자 다형성과 에스트로겐-프로게스토 겐 치료 후의 골밀도 변화 및 혈청 골교체 인자 변 화 사이의 연관성에 관해 분석해 보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 연구 대상(Subjects) 1) 연구 대상
서울대학교병원 폐경 클리닉에 호르몬치료와 골 밀도 측정을 목적으로 방문한 폐경 여성 중 본 연구 의 목적을 충분히 이해하고 동의한 여성 250명을 대 상으로 하였다. 폐경은 양측 난소절제술의 과거력 없이 마지막 생리가 있은 지 적어도 1년이 경과된 여
성 중 혈청 난포자극호르몬이 40 mIU/ml 이상인 경 우로 하였다. 이러한 연구대상자에서 당뇨병, 간질 환, 신장질환, 갑상선 질환, 부신 피질 호르몬 사용자 및 루푸스나 류마티스성 관절염 등 급성, 만성질환 이 있었고 호르몬, 활성 비타민 D, 칼시토닌 같이 골 대사에 영향을 준다고 알려진 약제를 복용한 여성 및 에스트로겐 제제 사용의 절대적 금기사항, 즉 원 인이 확실치 않은 비정상 질출혈, 급성 혈관질환, 유 방암 등이 있는 환자는 제외하였다. 250명의 대상자 에게 호르몬치료를 시행하였는데 호르몬은 경구용 접합 마 에스트로겐(conjugated equine estrogen)인 premarin 0.30 mg/일과 함께 medroxyprogesterone acetate (MPA) 5 mg을 매달 1일에서 12일까지 1일 1 회, 취침 전에 복용하게 하였고 칼슘 1 g을 병행 투 여하였다. 1년간 호르몬치료를 하였고, 1년 후 골밀 도를 측정한 최종 대상자는 218명이었다. 또한 본 연 구는 서울대학교병원 임상실험윤리위원회에서 승인 되었다.
2) 혈액 채취 및 체질량 지표 측정
연구대상자들로부터 호르몬치료 전 혈액을 hepa- rin이 들어 있는 튜브에 채취하고 연막(buffy coat)을 제조 후 냉장 보관하였다가 DNA 추출에 사용하였 다. 일부 혈액은 항응고제가 들어 있지 않은 튜브에 채취하여 각각 원심분리하여 혈청을 모아서 -70oC 에 보관하였다가 골대사의 생화학적 인자 등 측정에 사용하였다. 일부 여성에서는 호르몬 치료 후 6개월 에 혈액을 채취하여 혈청을 분리하여 골대사의 생화 학적 인자 측정에 사용하였다.
키와 체중을 측정하여 체질량지표(body mass index: kg/m2)를 계산하였다.
3) 골밀도 측정
모든 연구대상자들은 호르몬치료 전과 치료 후 1 년에 골밀도를 측정하였다. 연구대상자에서 척추, 대퇴골경부의 골밀도 측정에 Lunar사(Lunar PPX-L, Medison, Wisconsin, USA)의 이중에너지 엑스레이 흡수계측기(dual energy X-ray absorptiometry; DXA) 를 이용하였다. 이 측정기의 요추 골밀도 측정에서 의 체내 변이계수(in vivo coefficient of variation)는
Fig. 1. Typical pattern of Taqman assay of G (-308)A SNP in TNF-α gene.
1.4%, 대퇴골경부 2.1%였다.
4) 혈청 parathyroid hormone (PTH), 칼슘, 인 측정 PTH는 미국의 Nichols Institute Diagnostics 사의 intact PTH 측정 키트를 사용하여 측정하였으며, 그 민감도는 1 pg/mL였고, 측정 간 변이는 5.6%, 측정 내 변이는 3.4%였다. 칼슘과 인은 원자흡광광도계를 사용하여 측정하였다.
5) 혈청 골교체 인자 측정
혈청 osteocalcin (OST)은 ELSA-OSTEO 키트(CIS bio international, France)를 이용하여 면역방사선 측 정법으로 측정하였다. 측정 민감도는 0.4 ng/mL였고 측정 간의 변이는 5.2%, 측정 내 변이는 3.8%였다.
혈청 bone alkaline phosphatase (BAP)는 미국 Metra Biosystems 사의 Alkphase-B 키트를 사용하여 면역측 정법으로 측정하였다. 측정 민감도는 0.7 U/L였고 측정 간의 변이는 5.2%, 측정 내 변이는 3.9%였다.
혈청 CrossLaps (CTX)는 덴마크 Osteometer 사의 혈청 CTX 키트를 사용하여 측정하였다. 측정 민감 도는 94 pM이었고 측정간의 변이는 5.4%, 측정 내 변이는 5.0%였다.
6) 혈액에서 DNA 추출
상술한 냉장보관 하였던 연막에 적혈구 용해 완충 용액(lysis buffer; 1M Tris pH 7.6 10 mL, 1M MgCl2
5 mL, 1M NaCl 10 mL, 3차 증류수 975 mL로 제조) 을 혼합하여 1,500 rpm으로 5분 원심분리한 다음 상 층액을 제거하였다. 다시 적혈구 용해 완충용액을 넣고 원심분리한 후 200 μl만 남겨놓고 상층액을 제 거한 후, QIAamp 혈액 키트(QIAGEN Inc., Santa Clarita, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다
7) TNF 유전자 다형성 측정
a) TNF-α G (-308)A 유전자 다형성 측정 TNF-α G (-308)A 유전자 다형성을 측정하기 위 하여 Taqman assay를 시행하였다. Table 1에서와 같 은 primer를 제조하고 FAM dye와 VIC형광 dye를 붙 인 probe를 Applied Biosystems 사에서 제조하였다.
96구멍 PCR판에 Taqman universal master mix, primer 및 probe를 넣은 후 ABI prism 7000을 이용하여 PCR
를 시행하였다. PCR 조건은 50 °C에서 가열하고 95
°C 10분, 95 °C 10초, 60 °C 1분에서 40주기 시행하였 다. 각 구멍에서의 형광의 강도를 읽어 이러한 자료 를 SDS 2.1. Applied Biosystems를 사용하여 분석하 였다(Fig 1).
b) TNF-α 유전자 C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C 다형성 측정
TNF-α C (-857)T 다형성을 측정하기 위하여 Table 1에 기술한 시발체를 사용하여 DNA를 증폭하였는데 PCR은 94oC에서 20초간 변성, 68oC에서 30초간 서냉 복원, 72oC에서 60초간 신장시키는 40주기를 시행하 였다. HincII에 65oC에서 1시간씩 반응시키고 2% 한 천 겔에서 전기영동하였다. 제한효소에 절단된 부위 가 없는 것을 T 대립인자, 절단된 부위가 있는 것을 C 대립인자로 하였다. 증폭된 DNA 염기크기는 133 bp였고 제한효소로 처리한 후에 절단이 되는 동형접 합 대립인자를 가진 경우에 106 bp, 27 bp의 2분절이 나타났으며 이형접합의 경우 133 bp, 106 bp, 27 bp의 3분절이 나타났다.
TNF-α C (-863)A 다형성의 경우에도 Table 1에 기 술한 시발체를 사용하여 DNA를 증폭하였는데, PCR
Sequence Alteration PCR primer Annealing Temp (oC) Fragment size (bp)
TNF-α Promotor G (-308)A F1: AGCCCACTCTTCCCTTTGTC 60
R1: CCACCGTGCCTGACCTG VIC primer: CTGCTGCCGCTGGT FAM reporter: CTGCTGCCACTGGT
C (-857)T F: AAGTCGAGTATGGGGACCCCCCGTTAA 68 133
R: CCCCAGTGTGTGGCCATACTTCTT
C (-863)A F: GGCTCTGAGGAATGGGTTAC 59 128
R: CCTCTACATGGCCCTGTCTTCACTAAG
T (-1031)C F: TATGTAGATGGACTCACCAGGT 59 265
R: CCTCTACATGGCCCTGTCTT
TNF-β Intron 1 A (252)G F: CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA 68 782
R: AGAGGGGTGGATGCTTGGGTTC
Table 1. Polymerase chain reaction (PCR) primers for tumor necrosis factor (TNF) single nucleotide polymorphisms (SNPs)
bp
128 → 105 →
23 →
M RE(-) CC CA AA M: DNA marker, RE: restriction enzyme
Fig. 2. Genotyping of C (-863)A SNP in TNF-α gene.
은 94oC에서 30초간 변성, 59oC에서 60초간 서냉복 원, 72oC에서 60초간 신장시키는 36주기를 시행하였 다. DraIII에 37 °C에서 4시간씩 반응시키고 2% 한천 겔에 전기영동시킨 후 폴라로이드 사진촬영을 하였 다. DraIlI에 절단된 부위가 없는 것을 C 대립인자, 절단된 부위가 있는 것을 A 대립인자로 하였다. 증 폭된 DNA 염기크기는 128 bp였고, 제한효소로 처리 한 후에 절단이 되는 동형접합 대립인자를 가진 경 우에 105 bp, 23 bp의 2분절이 나타나고 절단이 되지 않는 경우 128 bp 분절만 나타났으며, 이형접합의 경 우 128 bp, 105 bp, 23 bp의 3분절이 나타났다(Fig. 2).
TNF-α T(-1031)C 다형성의 경우에도 Table 1에 기 술한 시발체를 사용하여 DNA를 증폭하였는데 PCR 은 94oC에서 30초간 변성, 59oC에서 60초간 서냉복 원, 72oC에서 36초간 신장시키는 35주기를 시행하였 다. BbsI에 55°C에서 4시간씩 반응시키고 2% 한천 겔에 전기영동시킨 후 폴라로이드 사진촬영을 하였 다. BbsI에 절단된 부위가 없는 것을 A 대립인자, 절 단된 부위가 있는 것을 C 대립인자로 하였다. 증폭 된 DNA 염기크기는 265 bp였고 제한효소로 처리한 후에 절단이 되는 동형접합 대립인자를 가진 경우에 181 bp, 71 bp, 13 bp의 3분절이 나타나고 절단이 되 지 않는 경우 252 bp, 13 bp 분절만 나타났으며 이형 접합의 경우 252 bp, 181 bp, 71 bp, 13 bp의 4분절이 나타났다.
c) TNF-β A(252)G 유전자 다형성 측정
Table 1에 표시한 바와 같은 전방 시발체(forward primer)와 역시발체를 사용하여 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 1.5 mM MgCl2, 250 μM의 dNTP와 1 unit Taq DNA polymerase가 포함되어 있는 완충용액에서 100 ng의 genomic DNA를 PCR로 증폭하였는데 PCR은 94oC에서 20초간 변성, 68oC에서 30초간 서냉복원, 72oC에서 60초간 신장과정으로 40주기 반복하였다.
PCR로 얻은 산물은 NcoI에 37°C에서 3시간씩 반응 시켜 ethidium bromide가 포함되어있는 2% 한천 겔 에 전기영동시킨 후 폴라로이드 사진촬영을 하였고
bp
A
782 → 586 →
196 →
RE(-) AA AG GG M M: DNA marker, RE: restriction enzyme
Fig. 3. Genotyping of A (252)G SNP in TNF-β gene.
Polymorphic sites Genotype Count Frequency χ2 & P-value
TNF-α G (-308A) GG 196 (89.9%) G 0.95 χ2=1.0
GA 21 (9.6%) A 0.05 P=0.61
AA 1 (0.5%)
C (-857)T CC 151 (69.3%) C 0.83 χ2=0.09
CT 62 (28.4%) T 0.17 P=0.95
TT 5 (2.1%)
C (-863)A CC 160 (73.4%) C 0.86 χ2=0.82
CA 56 (25.7%) A 0.14 P=0.67
AA 2 (0.9%)
T (-1031)C TT 142 (65.1%) T 0.82 χ2=1.37
TC 72 (33.0%) C 0.18 P=0.50
CC 4 (1.8%)
TNF-β A (252)G AA 63 (28.9%) A 0.53 χ2=0.15
AG 105 (48.2%) G 0.47 P=0.93
GG 50 (22.9%)
Table 2. Genotype and allele frequencies at the TNF-α and TNF-β polymorphic sites (n=218) NcoI에 절단된 부위가 없는 것을 A 대립인자, 절단
된 부위가 있는 것을 G 대립인자로 하였다. 증폭된 DNA 염기 크기는 782 bp였는데 NcoI 제한효소로 처 리한 후에 절단이 되는 동형접합의 경우 196 bp와 586 bp의 2분절이 나타나며 이형접합인 경우 196
bp, 586 bp, 782 bp의 3분절이 나타났다(Fig. 3).
8) 통계분석
모든 자료는 평균±표준오차(standard error, SE)로 표시하였다. TNF계 유전자형에 따른 호르몬치료 후 요추, 대퇴골 경부에서의 연간 골밀도 변화율과 혈 중 골대사의 생화학적 인자의 농도 변화율의 비교에 는 student's t-test, ANOVA, ANCOVA 검사를 이용하 여 분석하였고, 호르몬치료 반응군과 비반응군에서 각 TNF계 유전자형의 분포양상 분석 및 Hardy- Weinberg 평형 일치 여부 분석에는 χ2 검사를 사용 하였다. 모든 통계학적 분석에서 P<0.05인 경우만 유의하게 판정하였다.
결 과
1. TNF계 유전자내 다형성양상
TNF-α G (-308)A, TNF-α C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C, TNF-β A (252)G 다형성의 유전자형은 Table 2와 같았고 이러한 유전자형의 빈도는 Hardy- Weinberg의 공식을 따르는 것으로 나타났다. 연쇄불
TNF-α G(-308)A TNF-α C(-857)T TNF-α C(-863)A
GG GA/AA
P CC CT TT
P* CC CA/AA
(n=196) (n=22) (n=151) (n=62) (n=5) (n=160) (n=58) P
Age (years) 58.7±0.5 58.0±1.4 0.68 58.8±0.5 58.4±0.8 56.6±3.3 0.72 58.5±0.5 59.0±1.0 0.64 Years since
menopause
10.0±0.5 9.9±1.3 0.92 10.2±0.7 9.9±0.8 7.0±2.1 0.65 9.8±0.6 10.5±1.1 0.61 Weight (kg) 58.3±0.5 59.2±1.3 0.55 58.3±0.5 58.2±0.9 61.3±1.6 0.60 58.4±0.5 58.1±0.9 0.79 Height (cm) 155.3±0.3 155.3±1.0 0.98 155.3±0.4 155.4±0.6 155.7±1.2 0.96 155.4±0.4 155.2±0.6 0.80 BMI (kg/m2) 24.1±0.2 24.6±0.6 0.47 24.2±0.2 24.1±0.3 25.3±0.4 0.63 24.2±0.2 24.1±0.3 0.82 BMD change (%)*
Lumbar spine 1.6±0.7 4.1±1.6 0.25 2.0±0.6 1.3±1.8 4.8±4.4 0.73 1.4±0.8 3.2±0.9 0.23 Femoral neck 0.8±0.1 4.1±2.4 0.24 0.6±0.7 3.1±2.2 5.9±4.5 0.23 1.3±1.0 1.7±1.2 0.84
TNF-α T(-1031)C TNF-β A252G
TT TC CC
P* AA AG GG
(n=142) (n=72) (n=4) (n=63) (n=105) (n=50) P*
Age (years) 58.5±0.5 58.7±0.8 60.8±5.7 0.80 57.8±0.9 58.8±0.6 59.1±0.9 0.55 Years since
menopause
10.1±0.6 9.7±0.9 13.8±6.3 0.57 9.0±0.9 9.7±0.6 12.0±1.4 0.10 Weight (kg) 58.1±0.5 58.8±0.9 60.9±3.3 0.58 59.0±0.9 58.7±0.7 56.9±0.8 0.19 Height (cm) 155.2±0.4 155.4±0.5 157.1±1.4 0.70 155.8±0.6 155.6±0.4 154.1±0.7 0.10 BMI (kg/m2) 24.1±0.2 24.3±0.3 24.7±1.3 0.83 24.3±0.3 24.2±0.3 24.0±0.4 0.81 BMD change (%)*
Lumbar spine 1.4±0.9 2.6±0.8 3.4±2.9 0.67 2.9±0.8 0.7±1.2 2.9±1.1 0.26 Femoral neck 0.9±0.6 2.6±2.0 -1.3±2.6 0.55 3.5±2.2 0.1±0.6 1.5±1.2 0.18 Values are mean±SE. *: Values adjusted for age, years since menopause, and body mass index (BMI).
P: student's t-test; P*: ANCOVA.
Table 3. Clinical characteristics and adjusted rates (% per year) of changes in bone mineral density (BMD) after hormone therapy (HT) in relation to TNF-α and TNF-β SNPs
Haplotype Frequencies
Genotype Frequencies
G (-308)A C (-857)T C (-863)A T (-1031)C Code No* % Code No** %
G C C T 1 262 60.1 GCCT-GCCT [1, 1] 77 35.3
G T C T 2 72 16.5 GCCT-GTCT [1, 2] 42 19.3
G C A C 3 60 13.8 GCCT-GCCC [1, 4] 10 4.6
G C C C 4 19 4.4 GCCT-ACCT [1, 5] 15 6.9
A C C T 5 23 5.3 GTCT-GTCT [2, 2] 5 2.3
GTCT-GCAC [2, 3] 11 5
GTCT-GCCC [2, 4] 6 2.8 GCAC-GCCT [3, 1] 41 18.8 GCAC-GCAC [3, 3] 2 0.9 GCAC-ACCT [3, 5] 2 0.9 GCCC-GCAC [4, 3] 2 0.9 ACCT-GTCT [5, 2] 3 1.4 ACCT-GCCC [5, 4] 1 0.5 ACCT-ACCT [5, 5] 1 0.5
Total 436 100 Total 218 100
*: Number of chromosomes, **: Number of women.
Table 4. TNF-α G (-308)A, C (-857)T, C (-863)A and T (-1031)C haplotype and genotype frequencies
Genotypes Responders (n=123) Non-responders (n=95) Cross-tabulation test
TNF-α G (-308)A GG 107 (87.0%) 89 (93.7%)
GA/AA 16 (13.0%) 6 (6.3%)
χ2=2.646, P=0.10
TNF-α C (-857)T CC 82 (66.7%) 69 (72.6%) χ2=0.896, P=0.34
CT 38 (30.9%) 24 (25.2%) χ2=0.835, P=0.36
TT 3 (2.4%) 2 (2.1%) χ2=0.027, P=0.87
χ2=0.899, P=0.64
TNF-α C (-863)A CC 86 (69.9%) 74 (77.9%)
CA/AA 37 (30.1%)
χ2=1.746, P=0.19
TNF-α T (-1031)C TT 77 (62.6%) 65 (68.4%) χ2=0.799, P=0.37
TC 44 (35.8%) 28 (29.5%) χ2=0.961, P=0.33
CC 2 (1.6%) 2 (2.1%) χ2=0.068, P=0.79
χ2=0.990, P=0.61
TNF-β A (252)G AA 37 (30.0%) 26 (26.3%) χ2=0.192, P=0.66
AG 58 (47.2%) 47 (49.5%) χ2=0.155, P=0.73
GG 28 (22.8%) 22 (23.2%) χ2=0.005, P=0.95
χ2=0.200, P=0.91
Table 6. Distribution of genotype of the TNF-α and TNF-β polymorphisms in HT-responders and -nonresponders TNF-α haplotype 2 genotype
[2, 2] (n=5) [2, others] (n=62) [others, others] (n=151) P
Age (years) 56.6±3.3 58.3±0.8 58.8±0.5 0.72
Years since 7.0±2.1 9.9±0.8 10.2±0.7 0.65
menopause
Weight (kg) 61.3±1.6 58.2±0.9 58.3±0.5 0.6
Hight (cm) 155.7±1.2 155.4±0.6 155.3±0.4 0.96
BMI (kg/m2) 25.3±0.4 24.1±0.3 24.2±0.2 0.63
BMD change (%)*
Lumbar spine 4.9±4.4 1.3±1.8 2.0±0.6 0.73
femoral neck 5.9±4.5 3.1±2.2 0.6±0.7 0.23
Values are mean±SE. *: Values adjusted for age, years since monopause, and BMI P: ANCOVA.
[2, 2]=[GTCT, GTCT], [2, others]=[GTCT, others].
Table 5. Clinical characteristics and adjusted rates (% per year) of changes in BMD after HT in relation to TNF-α haplotype 2
평형 분석(linkage disequilibrium analysis)을 시행하였 을 때 TNF-α 유전자 내 다형성끼리 연관성이 있는 것으로 나타났다.
2. TNF계 유전자내 다형성양상에 따른 호르몬치 료 후 골밀도의 변화
Table 3에서 보인 바와 같이 TNF-α 유전자 다형 성과 TNF-β 유전자 다형성의유전자형에 따른 호르 몬치료 후 1년에서의 요추 및 대퇴골 경부에서 골밀
도 변화율의 유의한 차이는 없었다. 각 유전자 다형 성에서의 호르몬 치료 전 요추 및 대퇴골 경부에서 의 골밀도 차이는 없었다.
TNF-α G (-308)A, C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C 다형성 양상에 의하여 5종류의 haplotype 이 존재하였는데, haplotype 1이 60.1%, haplotype 2가 16.5%, haplotype 3이 13.8% 순이었다. 이러한 haplo- type으로 구성된 유전자형에는 14가지가 있었는데 (Table 4), 각 haplotype 유전자형군에서 호르몬 치료
TNF-α haplotype genotypes Responders (n=123) Non-responders (n=95) Cross-tabulation test
[2, 2] 3 (2.4%) 2 (2.1%) χ2=0.027, P=0.87
[2, others] 38 (30.9%) 24 (25.3%) χ2=0.835, P=0.36
[others, others] 82 (66.7%) 69 (72.6%) χ2=0.896, P=0.34
χ2=0.90, P=0.64 [2, 2]=[GTCT, GTCT], [2, others]=[GTCT, others].
Table 7. Distribution of genotype of the TNF-α and TNF-β polymorphisms in HT-responders and -nonresponders
6 months changes (%) of biochemical
markers
TNF-α G (-308)A TNF-α C (-857)T TNF-α C (-863)A
GG GA P CC CT TT P* CC CA/AA P
(n=144) (n=14) (n=105) (n=49) (n=4) (n=107) (n=51)
BAP 49.5±12.1 47.4±19.1 0.96 58.4±16.2 34.5±11.2 8.2±6.2 0.52 57.8±15.1 25.8±4.5 0.22 OST -2.4±5.5 12.0±11.0 0.42 -5.3±5.8 9.0±10.6 -16.1±19.2 0.39 -0.2±5.9 -2.6±10.2 0.83 CTX 19.7±13.3 14.1±50.3 0.90 1.1±8.1 51.7±35.5 98.2±157.4 0.11 23.1±17.5 10.3±14.5 0.65 PTH 146.5±57.6 57.0±35.8 0.69 156.9±75.8 98.1±57.1 178.5±70.9 0.88 172.3±76.3 68.6±30.9 0.40 Ca -0.8±1.5 -6.3±5.3 0.31 -2.0±1.8 0.3±2.6 0.5±8.0 0.76 -0.9±1.4 -2.1±3.9 0.76 P 3.6±5.7 -3.7±9.0 0.72 6.4±7.3 -5.7±4.2 7.8±40.9 0.59 6.3±7.3 -4.2±4.6 0.38 6 months
changes (%) of biochemical
markers
TNF-α T(-1031)C TNF-β A252G TNF-α haplotype 2 genotype
TT TC/CC P AA AG GG P* [2, 2] [2, others] [others, others] P*
(n=97) (n=61) (n=50) (n=78) (n=30) (n=4) (n=49) (n=105)
BAP 55.0±16.5 39.1±9.4 0.50 33.0±8.5 46.4±7.9 94.8±65.0 0.19 20.7±4.0 34.5±11.2 58.4±16.2 0.52 OST 1.9±6.4 -4.7±8.6 0.54 -2.7±10.0 -0.7±4.9 0.4±17.1 0.98 -16.1±19.2 9.0±10.6 -5.3±5.8 0.39 CTX 24.4±19.6 11.1±11.8 0.62 22.5±16.4 25.3±23.0 -3.0±15.0 0.71 98.2±157.4 51.7±35.5 1.1±8.1 0.11 PTH 153.2±76.0 125.3±68.5 0.81 105.6±54.6 120.5±49.6 235.2±210.2 0.65 178.5±70.9 98.1±57.1 156.9±75.8 0.88 Ca -0.3±1.5 -2.9±3.3 0.40 -1.0±3.2 -1.9±1.9 -0.2±2.8 0.90 0.5±8.0 0.3±2.6 -2.0±1.8 0.76 P 8.2±7.8 -6.7±4.0 0.19 0.9±5.7 -1.5±3.9 16.1±21.6 0.43 7.8±40.9 -5.7±4.2 6.4±7.3 0.59 Values are mean±SE.
BAP: bone specific alkaline phosphatase, OST: osteocalcin, CTX: CrossLaps, PTH: parathyroid hormone, Ca: calcium, P: student's t-test, P*: ANCOVA.
Table 8. Changes in serum levels of biochemical markers at 6 months after HT in relation to TNF-α and TNF-β SNPs and TNF-α haplotype genotypes
전 요추 및 대퇴골 경부에서의 골밀도 차이는 없었 다. TNF-α의 haplotype 2 유전자형을 포함한 다른 haplotype 유전자형에 따른 호르몬치료 후 1년에서의 골밀도 변화율의 차이가 없었다(Table 5).
3. 호르몬치료 반응군과 비반응군에서 TNF계 유 전자내 다형성 유전자형의 분포
호르몬치료 1년 후 골밀도가 3% 이상 감소된 경우 를 비반응군(nonresponders)으로 하였을 때, TNF-α G (-308)A, TNF-α C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C,
TNF-β A (252) 다형성의 유전자형의 분포양상이 호 르몬치료 반응군과 비반응군 사이에 차이가 없었다 (Table 6). TNF-α의 haplotype 2 유전자형을 포함한 다 른 haplotype 유전자형도 반응군과 비반응군 사이에 차이가 없었다(Table 7).
4. TNF계 유전자내 다형성 양상에 따른 호르몬 치료 후 혈청 골교체 인자의 변화
TNF-α 유전자 다형성과 TNF-β 유전자 다형성의 유전자형에 따른 호르몬치료 후 6개월에서의 BAP,
OST, CTX, PTH, 칼슘, 인의 혈청 농도 변화율의 유 의한 차이는 없었고, TNF-α의 haplotype 2 유전자형 을 포함한 다른 haplotype 유전자형에 따른 호르몬치 료 후 6개월에서의 생화학적 인자의 혈청 변화율 또 한 차이가 없었다(Table 8).
고 찰
골다공증이 유전인자에 의하여 그 발생이 조절된 다고 한다면,2-4 예방 및 치료 면에서 약제에 대한 치 료반응도 유전인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 따 라서 이러한 유전인자의 발굴은 의료비 절감의 효과 를 가져올 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 유전적으로 순수하다고 생각되는 한국 폐경여성에서 TNF-α 및 TNF-β 유전자 다형성 양상과 호르몬치료 후 골밀도 변화 사이의 연관성에 관해 분석하여 호르 몬 치료에 대한 골반응도를 나타낼 수 있는 유전자를 규명하려고 하였으나, TNF-α 유전자 다형성과 그 haplotype 및 TNF-β 유전자 다형성의 유전자형에 따 른 에스트로겐-프로게스토겐 치료 후 1년에서의 요 추 및 대퇴골 경부에서의 골밀도 변화율에 있어서 어 떠한 유의한 연관성도 발견되지 않았다.
TNF는 특히 골 흡수 촉진과 연관되어 있는 것으로 알려진 시토카인이다. 골다공증은 골 흡수가 골 형성 (bone formation)보다 많은 경우에 발생하는데, TNF-α 는 receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)의 표현을 유도함으로써 파골세포(osteoclast) 의 골 흡수 능력을 증가시키고, 세포의 세포자멸사 (apoptosis)를 감소시키며, 조골세포(osteoblast)에 자극 을 주어 간접적으로 성숙 파골세포를 활성화 시킨 다. 이 과정에서 에스트로겐은 TNF-α의 생성에 있 어서 결정적인 조절자로서의 역할을 수행하는데, 에 스트로겐은 TNF-α를 생산하는 T 세포의 증식을 촉 진하는 IL-7의 분비를 억제하며, 따라서 에스트로겐 의 결핍으로 IL-7 억제가 소실되면 결과적으로 TNF- α 생성이 증가되어 골 소실이 증가되는 것으로 알 려져 있다.24-26 Pacifici 등35은 양측 난소절제술 후 말 초혈액 단핵구에서 TNF-α 생산이 증가하였고 4주 간 에스트로겐 치료를 시행한 군에서는 증가했던 TNF-α가 감소하였다고 보고하였으며, Vural 등36도
폐경 여성에서 폐경전보다 혈장 TNF-α가 증가하였 으며, 이후 2개월 동안의 호르몬치료 후 주기적 및 지속적 호르몬치료 모두에서 혈장 TNF-α가 유의하 게 감소하였다고 보고하였다.
TNF의 유전자 다형성과 골밀도와의 연관성에 대 해선 여러 가지 다양한 연구 결과들이 보고되고 있 는데, 인종 및 조사된 단일염기 다형성 유형에 따라 서로 다른 결과들이 주장되어 왔다. 특정 인종에서 그 연관성을 입증할 수 없다고 보고한 연구들도 있
으나,32-34 Lee 등29은 크론병을 가진 호주인에서 TNF-
α G (-308)A, C (-857)T 유전자 다형성의 GT haplo- type과 TNF-α C (-857)T 유전자 다형성의 CC 유전 자형이 요추와 엉덩이뼈에서의 골밀도와 상관관계 가 있다고 보고하였고, Wennberg 등31은 건강한 코카 시안 여성에서 TNF-α C (-863)A 유전자 다형성의 AA 또는 AC 유전자형이 CC 유전자형에 비해 더 높 은 골밀도를 보이며, TNF-α의 혈장 농도 역시 요추 골밀도와 독립적으로 연관성을 가진다고 보고하였 다. Fontova 등30도 골다공증이 있는 지중해 인근의 코카시안 여성에서 TNF-α 유전자 다형성의 G 유전 자형이 보다 높은 골량을 보인다고 하였다. Ota 등27 은 일본 폐경여성에서 TNF-α (-1031)T 대립유전자 의 존재가 낮은 요골(radius) 골밀도와 연관성이 있는 것으로 보고하였으며, Furuta 등28도 TNF-α (-863)A 대립유전자와 (-1031)C 대립유전자의 빈도가 골밀 도가 낮은 여성군에서 유의하게 높으며, TNF-α C (-857)T 유전자 다형성의 경우 TT유전자형에서 CC 나 CT 유전자형에 비해 유의하게 낮은 골밀도를 보 인다고 보고하였다.
한편, 치료에 대한 골반응도를 결정할 수 있는 유 전인자를 규명하려는 노력의 일환으로 치료 후 골밀 도 변화양상과 유전자 다형성간의 연관성에 대한 연 구가 진행되어 왔으나, 이러한 연구는 각 표적유전 자 다형성과 골밀도와의 연관성에 관한 연구에 비하 면 드문 편이다. 국외의 경우 VDR 유전자 내 BsmI, TaqI 다형성과 ER 유전자 내 PvuII와 XbaI 유전자 내 다형성이 일부 인종에서 호르몬치료 후 골밀도 변화와 연관성이 있는 것으로 보고된 바 있다.18,19 한 국폐경여성을 대상으로 한 연구에서는 VDR 유전자 내 BsmI, ApaI, TaqI 다형성과 poly (A) microsatellite
의 분석 결과, 주기적 호르몬 치료 후 요추에서의 VDR bT haplotype 대립인자의 동형접합여성에서 그 렇지 않은 여성보다 골밀도 변화율이 작았다고 보고 하였으며,21 반면 ER 유전자 내 PvuII와 XbaI 유전자 내 다형성은 호르몬치료 1년 후 골밀도 반응과 무관 하였다고 보고되었다.37 또한 김 등은 calcitonin (CA) 유전자 다형성에서 동형접합의 108 bp 대립인자를 가진 108/108 bp 유전자형 군에서의 호르몬치료 후 대퇴골경부에서의 연간 골밀도 변화율이 유의하게 높은 것을 발견하였으며,22 인슐린 유사성장인자-I (IGF-I) CA 반복 유전자 다형성 역시 호르몬치료 후 골밀도 변화에 영향을 주는 인자로 보고한 바 있다.23 본 연구에서는 이제까지 연구된 바가 없는 TNF-α 유전자 내 G (-308)A, C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C 다형성 및 TNF-β 유전자 내 A(252)G 다형성양상과 에스트로겐-프로게스토겐 치료 후 골반응도 사이의 관계를 분석하였으나 상호 연관성을 보이지 않았다.
또한 이러한 결과와 일치된 소견으로서 TNF 유전자 다형성에 따른 6개월간의 에스트로겐-프로게스토겐 치료 후의 혈청 골교체 인자의 변화 모두 유의한 차 이를 보이지 않았다. 이는 이전 본 연구자 등38이 한 국 폐경여성에서 TNF 유전자 다형성이 전혈세포에 서의 TNF 생산과 무관하였다고 보고한 결과 및 김 등39이 lipopolysaccharide로 자극한 전혈 세포에서의 TNF-α, TNF-β의 생산과 1년 동안 호르몬 치료 후 요추와 대퇴 근위부의 골밀도 변화 사이에는 연관성 이 없었다고 보고한 결과와 일부 상통하는 결과이다.
골다공증 병인에 대한 유전적 요인을 찾으려는 노 력과 관련하여 고려해야 할 사항으로는 첫째, 가장 많이 쓰이는 방법은 서론에서 언급한 대로 표적유전 자의 DNA 유전자다양성을 분석하는 것이나, 표적유 전자를 이용하는 연관분석으로 다유전성 질환을 대 상으로 원인유전자를 성공적으로 찾아내는 경우는 극히 드물다는 것이다. 따라서 대표적인 다유전성 질환인 골다공증의 위험에 기여하는 유전자를 효과 적으로 찾기 위해서는 다른 실험기법이 필요하다.
전 염색체에 비교적 일정한 간격을 두고 산재해 있 는 유전자 다형성 표지를 이용한 연계분석(linkage analysis)은 매우 효과적인 방법이 될 수 있으나, 이 수행에 있어서는 매우 까다로운 조건을 만족해야 하
는데, 우선 삼대 이상의 가족들의 DNA 검체가 필요 하며, 연구하고자 하는 표현형이 각 구성원에게 있 는지 정확히 파악해야 하고 각 구성원의 특성에 대 한 자료가 충분해야 한다.40 또한 그 발병이 드문 질 환일수록 보다 효과적으로 적용이 가능하므로, 골다 공증처럼 늦은 발병으로 인해 장기간 추적관찰이 필 요하고, 진단기준이 확실하지 않은 질병으로 구성원 간 특징이 모호할 수 있으며, 또한 임상에서 비교적 흔하게 접할 수 있는 질환의 경우 적용이 어렵다. 따 라서 아직까진 표적 유전자(target gene)의 DNA 유전 자 다양성(gene polymorphism)을 연구함으로써 그 연 관성을 밝히고자 하는 연구들이 가장 널리 이용되고 있으며, 골다공증처럼 적은 영향을 미치는 많은 유 전자들에 영향을 받고 멘델식 유전을 따르지 않는 다유전성 질환에서는 전통적 연계분석 방법보다는 보다 변이된 연계분석방법들이 고안되고 있는 중이 다.8 이러한 접근 방법은 또한 호르몬치료에 대한 골 반응도와 관련한 유전적 요인을 규명하고자 하는 노 력에 대해서도 유사하게 적용시킬 수 있을 것으로 생각된다. 둘째 유전자다형성은 인종과 민족에 따라 다르기 때문에 다른 인종의 환자군에서는 같은 결과 를 보이지 않을 수도 있다는 점으로, 따라서 여러 외 국의 결과를 한국인에 직접 적용하기는 어렵다는 사 실을 유념해야 한다.
결론적으로 한국 자연폐경여성에서 TNF-α G (-308)A, C (-857)T, C (-863)A, T (-1031)C 유전자 다 형성과 TNF-β A252G 유전자 다형성은 호르몬치료 후 골밀도 변화 양상은 연관성이 없으며, 따라서 호 르몬치료 후 그 반응도 예측에 이용하기 어려울 것 으로 사료된다. 향후 다른 인종 및 민족으로 대상을 바꾼 연구와 함께, 그 외 다른 표적유전자의 유전자 다양성에 대한 연구로 그 범위를 확대해야 할 것으 로 사료된다.
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