Moxi-tar Herbal Acupuncture of BL25 Acupoint Ameliorates TNBS-Induced Colitis<br /> in Mice

⋅교신저자 : 손인철, 전북 익산시 신용동 344-2 원광대학교 한의과대 학 경혈학교실, Tel. 063-850-6448, Fax. 063-857-6458, E-mail:[email protected]

⋅본 연구는 뇌질환한방연구센터(03-PJ9-PG6-SO02-0001) 지원으 로 수행되었음.

⋅투고 : 2007/08/30 심사 : 2007/09/04 채택 : 2007/09/10

TNBS로 유도된 만성 염증성 대장염에 대한 大腸兪 灸津 藥鍼의 효과

백대봉

⋅권오상

⋅최원종

⋅김재효

⋅전희영

⋅김경식

⋅손인철

1원광대학교 한의과대학 경혈학교실

Moxi-tar Herbal Acupuncture of BL25 Acupoint Ameliorates TNBS-Induced Colitis in Mice

Dae-Bong Baek

, Oh-Sang Kwon

, Won-Jong Choi

, Jae-Hyo Kim

, Hee-Young Jeon

, Kyung-Sik Kim

, In-Chul Sohn

1

Department of Meridian & Acupoint, Wonkwang University College of Korean Oriental Medicine Abstract

Objectives : Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic relapsing inflammatory disease in the gas- trointestinal tract. The sources and pathologic mechanisms of IBD are still unknown. Moreover conventional therapies for IBD are not always effective, and they often have serious side effects. The purpose of this study is to examine the effect of Moxi-tar herbal acupuncture in IBD affected mice.

Methods : Mice were treated with 5 % 2, 4, 6 - trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) on day 1 and day 7. To assume the preemptive effect and therapeutic effect, herbal acupuncture was practiced with Moxi-tar at BL25 (Daejangsu) on day 0, day 3, and day 6. The end of day in treatment with Moxi-tar herbal acupuncture, the mortality and the inflammatory factors of the colon were measured by the various methods.

Results : TNBS induced high mortality but herbal acupuncture with Moxi-tar at BL25 suppressed the mortality caused by TNBS. TNBS induced infiltration of immune cells in all layers of the colon and increased myeloperoxygenase (MPO) activity, while the treatment with Moxi-tar herbal acupuncture at BL25 suppressed the infiltration of immune cells and the increase of MPO activity caused by TNBS to normal levels. Herbal acupuncture with Moxi-tar regulated NF-κB activity, which is an important factor for the pathogenesis of chronic colitis, and reduced the expressions of TNF-⍺, IL-1β, and ICAM-1 in the colons of TNBS treated mice. Furthermore herbal acupuncture suppressed macro- and micro- colonic damages caused by TNBS.

Conclusions : This study demonstrates that herbal acupuncture with Moxi-tar at BL25 is a potential preemptive and/or therapeutic method targeting the chronic IBD.

Key words : BL25, trinitrobenzenesulfonic acid, Inflammatory bowel disease, Moxi-tar, herbal acupuncture

Ⅰ. 서 론 만성 염증성 대장염은 소화관을 침범하는

원인 미상의 만성 염증성 질환에 대해 일반

적으로 일컫는 용어로서

, 한의학에서 泄瀉,

下痢, 腸澼의 범주로 인식되는데

만성으로

지속되며 관해와 악화를 되풀이 하면서 장

암, 천공, 폐색, 출혈 등 각종 합병증을 초래 하는 질병으로

여러 가지 학설이 있지만 아직도 그 원인을 규명하지 못한 질환이다.

대장에 염증을 일으키는 질환인 특발성 염 증성 장질환은 임상적 양상, 내시경을 통한 현상 그리고 형태학적 양상을 통해서 궤양 성 대장염(ulcerative colitis)과 크론씨 병 (Crohn's disease)으로 구분하고 있다

.

최근 50% ethanol에 녹인 trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS)를 마우스의 직장에 주입하면 급성 및 만성 대장염이 유발된다 고 보고되면서, 만성 염증성 대장염의 치료 에 대한 연구가 활발해지고 있다

.

김 등

은 TNBS로 대장염을 유발시킨 흰 쥐에게 애엽의 추출물이 sulfasalazine의 효 과에 상응하는 치료효과를 보인다는 사실을 보고하였고, 애엽의 추출물 중 flavonoids계 eupatilin 유도체(DA-6034)가 적정농도에서 TNBS로 유발한 흰쥐의 대장염에 유의한 치료효과가 있으며 이는 arachinodic acid 대 사에 억제적으로 작용한다고 보고되었다

.

鍼治療는 다양한 위장관 염증성 질환을 완화하고 치료하는데 유용하다는 것이 임상 적으로 알려져 있는데

, 최근의 연구결과에 서 TNBS로 야기된 急 · 慢性 大腸炎 실험 동물에서 合谷에 대한 艾葉

또는 灸津

藥鍼이 大腸炎의 증상을 완화하고 염증을 억제하였다는 결과가 보고되었다.

大腸兪(BL25)는 足太陽膀胱經에 屬하는 大腸의 背兪穴로서 腰陽關 兩傍 1.5寸에 위 치하며, 疏調二腸, 理氣化滯하는 穴性으로 腸炎, 腸痙攣, 泄瀉, 腹痛 等의 大腸疾患과 大小便不利 等을 主治하는 穴位이다

.

이에 본 연구에서는 염증성 장질환에 대 한 灸津藥鍼의 치료효과를 검증하기 위해 TNBS로 만성 염증성 대장염을 유발한 후 大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 시행하여 myeloperoxidase (MPO)활성도, NF-κB 활 성에 대한 IκB-α의 발현 정도 및 cytokine 의 변화 등을 관찰하여 유의한 결과를 얻었 기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 실험재료 및 방법 1. 灸津 약침의 제조 및 주입

灸津(구진, Moxi-tar)은 애융의 연소생성 물로서 安의 방법

에 근거하여 취득하였다.

약술하면, 삼각 플라스크 입구에 링을 올려 놓고, 뜸쑥(봉래구관, 서울) 5g을 뜸 절구를 이용하여 원뿔모양인 애융을 만든다. 애융을 연소한 후 플라스크 바닥으로 흐르는 연소 생성물을 모은다. 플라스크 바닥에 모인 연 소생성물을 methanol 100%로 녹이고 column 을 이용하여 재 등의 불순물을 제거하고 40±2℃로 중탕증류기를 이용하여 methanol 을 90% 증발시킨다. 남은 연소생성물(구진) 과 methanol 혼합물을 -70℃로 냉동동결건 조기를 이용하여 72시간 건조시킨후, 250㎍

의 구진을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 용해하고 phosphate buffered saline (PBS) 으로 10배 희석하여 최종적으로 25㎍/100

㎕의 농도로 마우스에 피하 주사 하였다.

2. 실험동물

실험동물은 연령 4-5주이고 20-25g의 무게

를 가진 BALB/c 수컷 마우스(다물사이언

스, 대전)를 사용하였다.

3. 대장염 유발 및 약침시술

대장염을 유발하기 위하여 trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)를 존대를 사 용하여 항문으로부터 5㎝ 깊이로 주입하였 다. 1회 주입 시 0.1㎖의 TNBS를 주입하였 으며 주입 후 1분간 꼬리를 위로 세워서 정

치시켰다. TNBS의 주입 시기는 제 1일째와 제 7일째이며 이때 TNBS를 주입하지 않는 처리군에는 25% 에탄올 100㎕를 주입하였 다. 灸津藥鍼의 효과를 살펴보기 위해서 灸 津(25㎍/100㎕/mouse)을 실험 시작일과 제3 일째, 제6일째 총 3회에 걸쳐 大腸兪 상응부 위에 주입하였으며 TNBS 처리할 때와 마 찬가지로 비처리군에는 25%의 에탄올 100

㎕를 주입하였다(Fig. 1).

Fig. 1. The schematic drawing to show a schedule in vivo study. MT : Moxi-tar, TNBS : trinitrobenzene sulphonic acid.

4. 육안 및 조직학적 측정

5% TNBS를 단독처리한 군과 灸津을 같 이 처리한 군을 9일째에 희생시켜 대장의 말단에서 5㎝까지 세로로 절개하고 각각의 처리 조건에 따른 손상정도를 측정하였다.

Macroscopic 측정 후 각각의 대장의 항문 부위 1㎝를 절개하여 4% formaldehyde에 고정시켰다. 고정된 조직을 microtome으로 4㎛ 간격으로 잘라서 슬라이드 위에 놓은 다음 H&E (hematoxylin-eosin) 염색을 하 였다. 조직학적 분석은 광학 현미경을 통하

여 Vilaseca 등

이 제안한 방법을 사용하였 으며 각각의 조건에 따른 마우스는 10마리 로 하였다.

5. Myeloperoxidase (MPO) 활성도 측정

마우스를 희생시켜 바로 항문에서 1㎝부 위를 적출하여 차가운 PBS(pH 7.4)에서 혈 액과 불순물들을 제거한 후 무게를 측정하 였다. 대장의 150-300㎎의 조각을 0.5%

hexadecyltrimethylammonium bromide가 첨

가된 50mM phosphate buffer (pH6.0)에 넣

고 homogenizer (OMNI GLH-2017;

Yamato Scientific Co. Ltd, Tokyo, Japan) 를 이용하여 30초 동안 3번 분쇄하였다. 분 쇄가 끝나면 -70℃에 냉동을 3시간시킨 후 다시 37℃에서 해동을 하고 이와 같은 과정 을 3번 반복 시행하였다. 냉동과 해동과정을 거친 후 초음파를 이용하여 다시 한 번 분 쇄한 후 12,000g에서 15분 동안 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액으로 MPO를 측정하 기 위해서 0.2㎎/㎖ ο-dianisidine hydrochloride (Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA)가 첨 가된 60 mM phosphate buffer 2.4㎖에 0.1㎖

의 상등액을 혼합한 후 10분 동안 반응시켰 다. 반응이 끝나면 0.1% sodium azide 0.5㎖

을 넣어주어 반응을 멈추게 한 후 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 흡광계 (DU-640 ; Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) 를 이용하여 460nm에서 측정하였다. MPO 활성도는 25℃에서 1분 동안 물에서 과산화 수소 1μM이 환원되는 수치를 의미하며 이것 을 대장조직의 무게로 환산하여 계산하였다.

6. 대장조직의 western blotting

대장조직을 모아서 Lysis buffer (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 100mM Tris pH 7.4, 5mM EDTA pH 8.0, 10mM PMSF)에 넣은 다음 homogenizer를 이용하여 분쇄한 다음 초음파를 이용하여 다시 한 번 분쇄하 였다. 14,000g에서 10분 동안 원심분리를 하 여 상등액을 취한 후 -20℃에서 보관하여 실험에 이용하였다. 동량의 단백질을 10%

SDS-polyacrylamide gels에서 전기영동한 다 음 nitrocellulose membrane으로 단백질을 이

동시켰다. 단백질이 이동된 membrane은 5%

skim milk가 첨가된 blocking 용액(10 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 100mM/L NaCl, 0.1% Tween 20)에 넣고 1시간 동안 방치하 였다. 0.05% Tween20이 첨가된 PBS (PBST)로 3번 세척한 후에 일차 항체를 처 리하여 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 3번 세척하였다. 항체에 horseradish peroxidase가 결합된 이차 항체를 처리하여 1시간 반응시 킨 후 PBST로 세척한 다음 X-ray 필름을 통하여 특정 단백질을 검출하였다.

7. Immunohistochemistry

대장조직을 1cm 적출한 후 10%

formaldehyde에서 고정한 다음 paraffin에 담가 고정시켰다. poly-L-lysine이 코팅되어 있는 현미경 슬라이드 위에 4㎛ 두께로 조 각내어 올려놓았다. Paraffin을 제거한 후 탈 수시킨 다음 PBS로 세척하고 1% bovine serum albumin과 2% normal goat serum이 첨가된 PBS에 담가서 실온에서 1시간동안 방치시킨 후 일차항체를 2시간 동안 반응시 켰다. 일차 항체반응이 끝나면 PBS로 세척 한 후 1:500으로 희석된 2차 항체를 반응시킨 후, alkalse phospatate labelled streptoavidin (DAKO kit)으로 반응시켰다. 그리고 substrate chromogen solution으로 붉게 발색된 단백질 발현을 관찰하였다.

8. RNA isolation and RT-PCR

Mouse 대장 조직을 easy-Blue

(인트론

사, 서울, 한국)를 이용해 제조자의 방법에

때라 total RNA를 분리해 사용하였다.

AccuPower® RT premix (바이오니아사, 대 전, 한국)를 이용해 역전사 반응을 시켜 cDNA를 얻어내었고, 20㎕의 cDNA 산물 중 2~5㎕를 template로 하여, AccuPower®

PCR premix (바이오니아사, 대전, 한국)를 이용하여 증폭시켰다. TNF-⍺, ICAM-1 그 리고 β-actin의 PCR 조건은 94℃에서 30초 간 denaturation, 62℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초간 extension 시켰다. TNF-⍺, ICAM-1 그리고 β-actin의 oligonucleotide 염기 서열은 다음과 같다.

TNF-⍺, 5‘-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3' (sense)와 5'-TCCACTTGGTGGTTTGCTACG-3' (antisense); ICAM-1, 5'-TGCGTTTTGGA GCTAGCGGA CCA-3' (sense)와 5'-CGAG GACCTA CAGCACGTGCCAG-3' (antisense);

β -actin, 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCAT GAAC-3' (sense)와 5'-TAAAACGCAG CTCAGTAACAGTCCG-3' (antisense).

TNF-⍺, ICAM-1 그리고 β-actin의 최종 산물은 305bp, 326bp 그리고 349bp였다. 중 합연쇄반응 산물은 1.5% 아가로스 겔의 전 기영동으로 확인하였다.

9. 통계처리

컴퓨터 통계프로그램인 SigmaStat 3.0 (SPSS Inc., U.S.A.)을 이용하였으며, 실험 결과는 means±S.E.M.로 나타내었고, 통계검 사는 Duncan's muliple comparison post-hoc test에 의한 ANOVA를 사용하였다. p값이 0.05보다 작으면 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

Ⅲ. 실험 결과

1. 灸津 약침이 TNBS로 인한 치사율에 미치는 영향

TNBS를 항문으로 주입하여 대장염을 유 발시켰을 때에 신체의 활동성이 크게 저하되 었을 뿐만 아니라 심한 손상을 받았을 경우, 사망에 까지 이르게 되는데 TNBS를 처리한 후 9일째까지의 생존률은 TNBS를 단독으로 처리한 군에서는 61%로 39%가 사망한 반면 大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 처리 한 군은 생존률이 89%로 灸津藥鍼이 TNBS에 의한 치사율을 현저히 억제하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Mice were given with nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT into intra-rectum. The survival rate is expressed as a percentage of nothing treated mice on day 9. Cont, the colon of control mice (n=10); MT, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25 (n=10); TNBS, the colon of TNBS treated mice (n=10); TNBS/MT, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25 (n=10); *, p<0.05.

2. 조직학적 손상에 대한 灸津 약침의 효과

조직학적 소견을 살펴보기 위해서 각 처

리군에서 적출한 장의 말단 부분 1cm를 잘 라내어 H&E 염색을 통하여 살펴 본 결과 TNBS 단독 처리군에서는 점막, 점막 고유 판, 점막하조직, 근육층 및 장막층까지 대장 의 전 층에 걸쳐 염증세포의 침착이 유도되 었는데 大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 처리한 군에서는 TNBS에 의한 염증세포의 침착이 대조군 수준으로 현저히 억제되었다(Fig. 3).

Fig. 3. Microscopic appearance of colon in control, TNBS alone, MT alone, and TNBS/MT treated mice on day 9. A, the colon of control mice;

B, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25; C, the colon of TNBS alone treated mice; D, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25.

3. 대장에서 MPO 활성도에 대한 灸津 약침의 효과

MPO (Myeloperoxidase)는 호중구의 과립 에서 주로 발견되는 효소로서 호중구 침윤 에 대한 지표가 되며, 이는 염증활성의 지표 로써 염증성 대장염에 의한 장손상 수치와 상관성을 갖는다. 염증의 severity에 대한 지 표로서 염증세포의 침윤정도를 알아보기 위 하여 MPO활성을 측정하는데 TNBS에 의한

염증세포의 침윤을 구진이 얼마만큼 억제하 는지 알아보기 위하여 대장에서 MPO 활성 도를 측정하였다. TNBS에 의해 유도된 염 증성 대장염 모델에서 장점막의 MPO 활성 도는 8.5U/g으로 정상 대장의 점막 1.2U/g 에 비해 약 7배 증가하였으나 大腸兪 상응 부위에 灸津藥鍼을 처리한 군에서의 MPO 활성도는 2.83U/g으로 정상 대장점막의 약 2.4배 수준에 머물렀다. 이는 大腸兪 상응부 위에 대한 灸津藥鍼이 MPO의 활성을 현저 히 억제하였음을 보여준다(Fig. 4).

Fig. 4. Mice were given with nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT into intra-rectum. MPO activities of the distal 5 cm colon portions were analyzed at day 9.

Cont, the colon of control mice (n=10); MT, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25 (n=10);

TNBS, the colon of TNBS treated mice (n=10); TNBS /MT, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25 (n=10); *, p<0.05.

4. 灸津 약침이 NF-κB 활성에 미치는 영향

Nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성은 대 장염증에서 cytokine을 증가시키는 중요한 역할을 한다. NF-κB는 평상시에는 세포질 내에 존재하고 있는데 염증이 유발되면 NF-κB에 붙어 있는 IκB가 인산화되고 홀 로 남은 NF-κB는 핵으로 이동하게 된다.

NF-κB가 핵으로 이전되면 핵에서 다양한 단

백질들을 발현시키는 신호들을 보내게 되어 접합 분자들 (adhesion molecules), chemokines 또는 TNF-⍺, IL-1, IL-6, IL-8 그리고 IL-12와 같은 cytokine을 발현시킨다.

이러한 이유로 NF-κB의 활성은 대장 염 증에서 cytokine을 증가시키는 역할을 하므 로 만성 염증성 대장염의 병리과정 중에서 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 TNBS에 의하여 유발된 염증성 대장염 모델인 마우 스의 대장에서 구진이 NF-κB의 활성에 미 치는 영향을 살펴보았다. 우선 5% TNBS (100㎕/마우스)를 단독 처리한 군과 大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 처리한 군을 9일째 에 대장 조직을 적출하여 IκB-⍺의 분해 유 무를 western blotting으로 확인하였다. 그 결과 TNBS 단독 처리군에서 IκB-⍺의 감 소가 확연히 나타났으나 大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 처리한 군에서는 TNBS에 의해 유도된 IκB-⍺의 감소를 현저히 억제시켰 다(Fig. 5).

Fig. 5. To identify NF-κB activation, IκB degradation was checked in colons of nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT treated mice on day 9. A, the colon of control mice; B, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25; C, the colon of TNBS alone treated mice; D, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25.

5. 염증을 유발하는 cytokine에 대한 灸

津 약침의 효과

TNF-⍺나 IL-1β는 대장의 상피세포의 apoptosis를 조절할 뿐만 아니라 염증 매개 물질의 발현과 매우 밀접한 관계가 있으며, 염증세포의 침착은 ICAM-1의 발현과 매우 밀접하게 관계되어 있다. Leukocyte의 부착 과 이동은 ICAM-1, VCAM-1 및 MadCAM-1 을 포함하는 세포의 표면에 glycoprotein 수 용체를 갖고 있는 그룹과의 상호작용에 의 해 이루어진다. 특히 궤양성 대장염과 크론 병 환자의 대장 점막에서 ICAM-1의 발현 이 현저히 증가되어 있다.

염증 반응이 진행되면서 지속적인 leukocyte 와 내피 세포간의 상호작용으로 leukocyte의 rolling, activation, firm adhesion 그리고 조 직 주위로의 migration을 유도하게 된다. 이 러한 leukocyte의 변화는 다양한 cell adhesion molecules (CAMs)에 의해서 진행 된다.

TNBS에 의해 염증이 유발된 마우스의 대

장조직에서 TNF-⍺ (Fig. 6), IL-1β (Fig. 7)

및 ICAM-1 (Fig. 8)의 발현양상을 면역조

직 화학적 염색방법에 의해 관찰한 결과

TNBS를 단독으로 처리한 군에서는 점막,

점막 고유판, 점막하조직, 근육층 및 장막층

까지 대장의 전 층에 걸쳐 TNF-⍺, IL-1β

및 ICAM-1이 발현되었으나, 大腸兪 상응부

위에 灸津藥鍼을 처리한 마우스의 대장에서

는 현저하게 이들 염증 매개물질들의 발현

이 억제된 것을 볼 수 있었다.

Fig. 6. The immunohistochemical staining against TNF-⍺ was carried out with colons of nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT treated mice on day 9.

A, the colon of control mice; B, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25; C, the colon of TNBS alone treated mice; D, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25.

Fig. 7. The immunohistochemical staining against IL-1β was carried out with colons of nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT treated mice on day 9. A, the colon of control mice; B, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25; C, the colon of TNBS alone treated mice, D, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25.

Fig. 8. The immunohistochemical staining against ICAM-1 was carried out with colons of nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT treated mice on day 9.

A, the colon of control mice; B, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25; C, the colon of TNBS alone treated mice; D, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25.

6. RT-PCR을 이용한 cytokine의 mRNA 발현의 변화

마우스의 대장 조직에서 염증 매개체인

TNF-⍺, IL-1β 및 ICAM-1의 발현양상을

RT-PCR을 이용하여 조사한 결과 면역조직

화학적 염색법 결과와 마찬가지로 TNBS를

단독으로 처리한 군에서는 TNF-⍺, IL-1β

및 ICAM-1의 mRNA의 발현이 증가하였으나

大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 시행한 군의

마우스 대장에서는 현저하게 이들 mRNA의

발현이 억제된 것을 볼 수 있었다(Fig. 9).

Fig. 9. The reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR) against TNF-⍺, IL-1β and ICAM-1 was carried out with colons of nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT treated mice of day 9. A, the colon of control mice; B, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25; C, the colon of TNBS alone treated mice; D, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25.

7. TNBS에 의해 유발된 대장손상에 대 한 灸津 약침의 억제효과

대장의 육안적, 현미경적 손상의 정도를 객관화하고 수치로 나타내기 위하여 Vilaceca의 기준

을 이용하여 대장 손상의 정도를 분석하였는데 각 처리군 마다 5마리 씩 취하여 TNBS를 처리한 군과 大腸兪 상 응부위에 灸津藥鍼을 처리한 군의 대장 손 상정도를 측정한 결과 TNBS를 처리한 군 에서는 대장의 육안적 손상정도가 7.1로 정 상 0.3에 비하여 손상정도가 매우 큰 것을 확인 할 수 있었지만 大腸兪 상응부위에 灸 津藥鍼을 처리한 군의 경우 대장의 육안적 손상정도는 2.2였다(Fig. 10).

또 TNBS를 처리한 군의 경우 대장의 현 미경적 손상정도가 6.3로 정상 0.21에 비하 여 크게 손상된 것을 확인할 수 있었지만

大腸兪상응부위에 灸津藥鍼을 처리한 군의 현미경적 손상정도는 2.5로 TNBS에 의한 대장의 현미경적 손상을 억제하는 것을 확 인할 수 있었다(Fig. 11).

Fig. 10. The macroscopic damage score was carried out in colons of nothing, MT, TNBS, and TNBS/MT treated mice of day 9. Cont, the colon of control mice (n=10); MT, the colon of Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25 (n=10); TNBS, the colon of TNBS treated mice (n=10); TNBS/MT, the colon of TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice at BL25 (n=10); *, p<0.05.

Fig. 11. The microscopic damage score was carried

out in colons of nothing, MT, TNBS, and

TNBS/MT treated mice of day 9. Cont, the colon of

control mice (n=10); MT, the colon of Moxi-tar herbal

acupunctured mice at BL25 (n=10); TNBS, the colon of

TNBS treated mice (n=10); TNBS/MT, the colon of

TNBS treated and Moxi-tar herbal acupunctured mice

at BL25 (n=10); *, p<0.05.

Ⅳ. 고 찰

궤양성 대장염이나 Crohn씨 병 같은 만성 염증성 대장염은 장기간에 걸쳐 혈변, 설사, 체중감소 등의 증상이 악화와 회복단계를 반복하는 특징을 지니고 있다

. 우리나라에 서도 그 빈도가 점차 증가하는 추세이며, 공 통적인 특징은 泄瀉를 동반하는 것으로 이 는 대장의 점막에 염증이 유발되기 때문이 다. 비록 염증성 장질환에 대한 원인이 정확 하게 밝혀지지 않았지만 발병요인들을 역학 적으로 조사한 결과 기본적인 3가지의 상호 요인 즉 유전적인 영향, 외부에서 유입된 미 생물이나 장내 미생물에 의한 숙주 감염에 대한 반응과 같은 환경적 요인, 그리고 점막 면역체계의 붕괴에 의한 것으로 밝혀졌으며, 그 중 가장 큰 비중을 차지하고 있는 것은 장내 미생물에 의한 것으로 알려져 있다

.

이러한 만성 염증성 대장염은 韓醫學에서 는 泄瀉, 下痢, 腸澼의 범주로 인식되며

, 이에 대한 한의학적 치료방법은 주로 약물 치료법과 침구치료법으로 대별된다. 陳

은 天樞, 大腸兪를 主穴로 하고, 3가지 유형으 로 辨證하여 補瀉法, 전침자극 등을 통해 치 료한 것을 보고하였고, 강 등

은 단순한 鍼 刺戟에 의한 치료와 穴位에 艾灸施術이나 手技法을 사용한 경우, 전침, 침구치료와 약 물투여를 병행하여 치료하는 방법을 보고하 기도 하였다.

<靈樞․背兪篇>에 말하기를 “則欲得而驗 之 按其處 應在中而痛解 乃其輸也”

라고 하였으니 背兪穴은 足太陽膀胱經 第 1線上 에 위치하며, 高低順序와 臟腑位置가 거의

일치한다. 臟腑와 經脈의 氣가 흘러나오는 부위이므로 背兪穴과 臟腑는 특수한 관계가 있으며 임상에서 五臟六腑의 虛實과 盛衰를 가장 잘 반영한다. 그중 大腸兪는 足太陽膀 胱經의 25번째의 穴로서 腰陽關 兩傍 1.5寸 에 위치하는 穴로서 疏調二腸, 理氣化滯하는 穴性으로 腸炎, 腸痙攣, 腸出血, 泄瀉, 腹痛 等의 大腸疾患과 大小便不利 等을 主治한다 고 알려져 있다

.

艾灸療法은 뜸쑥(애엽;艾葉 Folium Artemisiae Lavandulaefoliae), 즉 菊花科(Compositae) 에 속한 多年生 草本인 참쑥(Artemisiae lavandulaefolia DC.) 및 황해쑥(Artemisia argyi. Lev et Vant)과 野艾(A. vulgaris L.) 의 잎을 陰乾

하여, 艾絨을 만들고 병증에 상응한 부위에 부착하여 燃燒시킴으로써 얻 어지는 溫熱刺戟과 연소과정에서 발생하는 물질에 의한 화학적 자극으로 병을 치료하 는 일종의 자극요법으로

, 營血衛氣의 장애 로 인한 질환 및 疼痛을 치료하는 효능을 갖고 있다

.

이러한 艾灸療法의 效用을 증명하려는 최 근의 연구 趨勢는 크게 溫熱刺戟에 의한 보 고와 艾絨의 燃燒生成物, 즉 化學的 刺戟에 의한 보고로 나누어진다.

온열자극에 대한 연구로는 林

은 溫熱刺

戟이 국소조직에 대하여 열분해물질을 생성

하여 치료효과를 나타내고, 華

는 온열의

弱刺戟은 補의 작용을, 强刺戟은 瀉의 작용

을 일으킨다고 보고하였다. 안 등

은 艾絨

의 연소생성물을 灸津이라 칭하고 면역세포

에서 LPS 자극으로 유도되어지는 iNOS의

증가 억제효과를 보고하였고, 灸津이 뇌신경

세포에서 LPS 자극으로 유도되어지는 nitric oxide생성을 억제한다고 보고하였다. 또한 김 등

은 일과성 전뇌 허혈 손상에 있어 百會에 대한 灸津藥針液의 자극이 BDNF (brain derived neurotrophic factor) 단백질 발현을 유의하게 증가시킨다고 보고하였다.

그리고, 朴 등

은 온열자극 자체만을 분석하였는데, 艾葉을 가열할 때 발생되는 열자극을 객관화하려는 특이한 시도를 했다.

즉 艾葉을 인체에 가해지는 하나의 열자극 으로 규정되고 가열되는 艾葉이 시간에 따 라 일정한 형태의 열자극적 특징을 나타냄 과 아울러, 艾灸의 形態, 大小에 따라서 각 기 다른 특징을 나타냄을 보고했으며 艾炷 의 연소과정을 예열기, 가열기, 보온기, 냉각 기의 4구간으로 나누어 艾炷의 밀도 종류 및 중량 등에 따라 연소특성이 변화 한다고 하였다. 동일한 열량의 艾炷라 하더라도 최 고온도, 지속시간, 회복신간, 최대승온속도, 평균승온속도 등에 따라 刺戟의 樣相 및 刺 戟의 質은 相異하게 나타난다고 하였다.

이러한 보고는 艾灸는 施術量에 따라 作 用이 相異함을 發見하여 艾灸의 有效用量을 究明한 金

의 보고와 일맥상통하다고 볼 수 있다. 이 외에 孫

은 施灸에 의한 血壓 降下作用을, 金

, 朴

, 李

는 施灸에 의한 hormone의 變化를 觀察하여 相互連關性을 硏究하였다. 또한 김

은 동일한 부위라도 艾灸 자극방법을 상이하게 할 경우 효능에 차이가 있음을 보고하였다.

艾葉은 항균작용과 항암성을 나타내는데 쑥의 종류에 따라서 TNF의 priming activity를 나타내고, 정유성분인 santolina

alchohol은 antibacterial activity를 나타내며

34)

, 염증 및 항암과 관련된 IL-1, IL-2, TNF-⍺의 생성과 분비를 촉진시키고 여러 종의 tumor cell line에 대해 세포독성효과를 나타내는 것이 알려져 왔다

.

김 등

은 TNBS로 대장염을 유발시킨 흰 쥐에게 애엽의 추출물을 투여해 본 결과 sulfasalazine의 효과에 상응하는 치료효과를 보인다는 사실을 보고하였고, 장 등

은 애 엽의 추출물 중 flavonoids계 eupatilin 유도 체(DA-6034)가 적정농도에서 TNBS로 유발 한 흰쥐의 대장염에서 유의한 치료효과가 있으며 이는 arachinodic acid 대사에 억제 적으로 작용할 것이라고 보고하였다.

따라서, 大腸兪(BL25) 灸津藥鍼 시술이 만성 염증성 대장염을 치료하는 방법이 될 수 있다는 가정하에 TNBS로 만성 대장염 을 유발하고 大腸兪 상응부위에 灸津藥鍼을 실시하였다.

접촉성 감작 알레르겐인 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)를 에탄올과 함께 대 장에 관장 투여하면 대장염이 유발된다.

TNBS에 의한 염증성 대장염 모델은 궤양 성 대장염보다는 크론씨 대장염에 가까운 모델이다. 유발기전은 먼저 에탄올에 의한 급성적인 점막손상이 나타나고 후에 hapten 의 일종인 TNBS에 의해 면역반응이 유도 되어 만성 염증이 지속되는 것이므로 사람 의 염증성 대장염과 유사한 유발기전과 병 태생리를 나타낸다.

TNBS는 공유결합에 대해 반응하는 물질

로 장점막과 접촉하면 산화적인 손상에 의

해 급성 전층성 괴사를 일으킨다. 약제에 의

한 전층성 염증의 발생 유무가 대장염의 발 생에 중요하기 때문에 대장염을 유발하기 위해서는 거의 치사량에 가까운 용량이 투 여되어야 한다. 관장 후 수일 내에 급성 괴 사와 염증이 생기고 그 후로는 단핵구 침윤 등과 함께 만성 염증 소견을 보인다.

이러한 이유로 TNBS를 단독 투여한 群 에서 마우스의 치사율이 상당히 높은 편인 데, 본 실험에서 TNBS를 주입한 마우스에 灸津을 大腸兪에 투여한 결과 TNBS에 의 한 치사율이 39%에서 11%로 현저히 감소 하였다(Fig. 2). 또한 TNBS로 유도된 염증 성 대장염 모델 장점막의 생화학적 결과들 은 인체의 대장염 점막에서와 매우 유사하 여 TNBS에 의한 염증세포들의 침윤과 염 증전구매개체의 생성이 사람의 염증성대장 염과 유사한데, 염증성 점막에서 호중구의 침윤이 증가되는 것을 관찰할 수 있었고 cytokine 및 leukotreine에 의해 활성화된 세 포들에 의해 cytokine과 platelet activating factor, arachidonic acid 대사산물들, oxygen free radical들이 분비되어 염증성 대장염의 유발 및 지속에 관여한다. MPO (Myeloperoxidase)는 호중구의 과립에서 주로 발견되는 효소로서 호중구 침윤에 대한 지표가 되며

, 이는 염 증활성의 지표로써 염증성 대장염에 의한 장 손상 수치와 상관성을 갖는다

.

TNBS/ethanol의 직장내 투여는 체중감소 와 설사를 유발하였고, 심한 혈성병변 (bleeding)과 장 두께의 증가를 동반한 장점 막 궤양과 염증이 관찰되었다. 염증활성은 TNBS 투여 후 2일째에 급격한 체중의 감 소가 나타나 3일째에 염증이 심화되어 급성

대장염의 임상소견을 보였다.

TNBS에 의한 심각한 대장의 점막 손상, 대장의 두께 및 무게의 증가 또한 억제되었 다. 대장조직의 염증세포 침착이 대조군 수 준으로 현저히 억제 되었으며(Fig. 3), 그리 고 MPO 활성이 TNBS에 의해서 약 2.4배 증가한 것을 灸津에 의해서 대조군 수준으 로 낮아진 것을 볼 수 있었다(Fig. 4).

TNF-⍺나 IL-1β는 대장의 상피세포의

apoptosis를 조절할 뿐만 아니라 염증 매개

물질의 발현과 매우 밀접한 관계가 있다. 따

라서 만성 염증성 대장염의 병리과정에 중

요하게 관여하고 있는데 동물모델에서

TNF-⍺의 과발현을 유도하면 염증성 장질

환이 유도되고 반대로 만성 염증성 장 질환

을 갖고 있는 환자에 TNF-⍺를 낮추면 만

성 염증성 장질환이 개선된다고 보고되어

있다

. 따라서 최근에는 TNF-⍺나 IL-1β

에 대한 중화항체를 이용한 치료를 임상적

으로 시도하고 있다. 본 실험에서도 灸津은

대장에서 TNBS에 의한 TNF-⍺와 IL-1β의

발현을 현저히 억제하여 장 염증을 현저히

개선시킨다고 생각된다(Fig. 6, Fig. 7). 염증

세포의 침착은 ICAM-1의 발현과 매우 밀

접하게 관계되어 있다. 특히 궤양성 대장염

과 크론병 환자의 대장 점막에서 ICAM-1

의 발현이 현저히 증가되어 있다. ICAM-1

의 발현은 염증과정 중에 매우 증가한다. 그

리고 혈관내피세포 위에서의 leukocyte의 이

동이 ICAM-1에 대한 중화항체에 의해 크

게 억제되었다는 보고가 있다

. 따라서

ICAM-1에 대한 antisense oligonucleotide나

중화항체는 염증성 장 질환을 개선시킬 수

있다고 생각된다. 본 실험에서도 灸津은 대 장에서 TNBS에 의한 ICAM-1의 발현을 현 저히 억제하여 염증세포의 부착과 이동을 억제함으로써 염증성 장 염증의 증상을 현 저히 개선시켰다고 생각된다(Fig. 8).

또한 이들 염증매개 물질들의 발현을 조 절하는 전사 조절인자인 NFκB의 활성이 만 성 염증성 장 질환의 병리과정 중에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

NF-κB의 활성을 유도하기 위해서 IκB의 붕괴를 유발하는 유전자인 폴리펩티드의 N 말단에 위치한 32와 36의 세린잔기가 인산 화를 촉진시키는데 이들 두 가지 아미노산 을 제거한 결과 IκB의 붕괴를 막아줌으로써 NF-κB의 활성이 억제되었다. 본 연구는 TNBS에 의해 유도된 만성 염증성 대장염 마우스에서도 灸津이 NF-κB의 활성을 억제 하는 효과를 나타내는지 조사하기 위해서 시행되어졌다. 그 결과 TNBS를 처리한 마 우스의 대장에서 IκB의 분해가 증가되어 NF-κB가 활성화되었으며 灸津을 처리한 군 에서는 TNBS에 의한 IκB의 붕괴를 억제하 였다. 이 결과를 통해서 마우스의 대장에서 灸津이 TNBS에 의한 NF-κB 활성을 억제 함으로써 대장염을 개선시키는 것으로 생각 된다(Fig. 5). 또한 灸津은 대장에서 TNBS 에 의한 TNF-⍺, IL-1β, 및 ICAM-1의 발 현을 억제함으로써 대장염을 개선시키는 것 으로 생각된다.

이상의 실험 결과에서 TNBS로 유발된 대장염의 치료 수단으로서 대장의 背兪穴인 大腸兪의 灸津藥鍼요법이 유의성이 있다고 사료된다.

Ⅴ. 결 론

大腸兪 相應部位에 灸津藥鍼이 TNBS로 유도된 마우스의 만성 염증성 대장염에 미 치는 영향을 관찰한 결과 다음과 같은 결론 을 얻었다.

1. 灸津藥鍼은 TNBS에 의한 치사율을 억제 하였다.

2. 조직소견에서 灸津藥鍼은 TNBS에 의한 장 전반에 걸친 염증세포의 침착을 억제 하였다.

3. MPO 활성에서 灸津藥鍼은 TNBS에 의 해 증가되는 MPO 활성을 억제하였다.

4. 灸津藥鍼은 TNBS에 의해 증가된 NF-κ B의 활성을 억제하였다.

5. 대장상피세포에서 灸津藥鍼은 TNF-⍺, IL-1β과 ICAM-1의 단백질 및 mRNA 발현을 억제하였다.

6. 육안 및 현미경적 대장손상분석 시스템에 서 灸津藥鍼은 TNBS에 의한 대장손상 을 대조군 수준으로 개선시켰다.

이상의 연구 결과에서 大腸兪 상응부위

灸津藥鍼은 TNBS에 의한 염증세포의 침착

과 이와 관련된 염증 매개물질들의 단백질

및 mRNA의 발현을 억제하였고 만성 염증

성 대장염과 관계가 있는 NF-κB의 활성을

억제하여 TNBS에 의한 만성 염증성 대장

염의 병리작용을 개선시킬 수 있는 것으로

사료되었다.

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