오리나무 추출물(AI-1367)의 간질환 동물모델에서의 간 보호효과
조우철*,**·이성희*,**·허재욱***·라정찬***·손동환*,**,#
*원광대학교 약학대학, **원광대학교 약품연구소, ***(주)알앤엘바이오 (Received November 30, 2011; Revised January 24, 2012; Accepted March 6, 2012)
Hepatoprotecive Effects of Alnus japonica Extract on Experimental Liver Injury Models
Yu-Zhe Zhao*,**, Sung Hee Lee*,**, Jae-Wook Huh***, Jeong Chan Ra*** and Dong Hwan Sohn*,**,#
*College of Pharmacy, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea
**Institute of Pharmaceutical Research and Development, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea
***RNL Natural Co., Ltd, Seoul 153-768, Korea
Abstract — The protective effect of AI-1367 (Alnus japonica extract) on liver injury was investigated. Primary rat hepa- tocyte intoxication was induced by tert-butyl hydroperoxide (tBH), carbon tetrachloride (CCl4), or D-glactosamine (D-GalN).
Liver injury was induced by CCl4, D-GalN or MCD (methionine choline deficient)-diet in mouse. The cellular leakage of lactate dehyrogenase and cell viability followed by the treatment of hepatotoxicants were significantly improved by AI-1367 treatment at a concentration range of 5~50µg/ml for tBH, 5~50 µg/ml for D-GalN, and 5~100 µg/ml for CCl4, respectively.
Treatment with AI-1367 (20, 10, 5 mg/kg, p.o.) on liver injury induced by subcutaneous injection of CCl4 or D-GalN reduced significantly the levels of aspartate transaminase and alanine transaminase in serum. Histological observations revealed that fatty acid changes, hepatocyte necrosis and inflammatory cell infiltration in CCl4 (D-GalN)-induced liver injury was improved by administration of AI-1367. AI-1367 treatment (10, 5, 2.5 mg/kg, p.o.) also significantly recovered the body weight change and serum levels of aspartate transaminase, alanine transaminase and triglyceride in liver injury induced by MCD diet. From these results, AI-1367 shows protective effects against tBH, CCl4, D-GalN, or MCD diet-induced hepatotoxicity in vitro or in vivo.
Keywords □ Alnus japonica, hepatocyte, MCD diet, CCl4, D-GalN, hepatoprotective
최근 의료과학의 발전과 함께 평균수명이 증가하고 있으나 불 규칙한 식사, 스트레스, 과다한 음주 등으로 간질환이 빈번하게 일어나고 있다. 이와 같은 간질환은 인체에 치명적인 회복하기 어려운 영향을 미친다.1)간질환은 간염에서 간섬유화,2)간경변, 간암으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 그 원인은 바이러스, 알 콜,3)비알콜성 지방 축적,4)약물남용 등이 있으며, 이들로 인한 반복되는 염증반응이 간염을 일으키며 지속적인 염증은 간섬유 화, 간경변, 간암으로 유도한다. 따라서 초기반응을 저해할 수 있 는 간질환 치료제 개발이 요구되고 있다.
오리나무(Alnus japonica Steude)는 자작나무과(Betulaceae)의 낙엽교목으로 우리나라 중부 이북의 해발 200~900 mm 지역에 분포하여 있다. 한방에서는 오리나무의 수피를 적양이라 하여 해
열, 지혈, 수렴 등의 효능이 있고 설사, 외상 출혈, 혈변 등에 쓰이 는 것으로 알려져 있으며5)민간에서는 숙취 해소에 사용하였다.6) 오리나무에는 여러 종류의 tannin, flavonoids, diarylheptanoid7-10) 등이 포함되어 있으며 생리활성 연구로는 항암효과,11)항산화효
과,12,14)항염효과13)등 효능에 대하여 보고되었다. acetaminophen
에 의한 간손상 모델에서 간보호효과14)와 알콜 분해촉진15)에 대 하여 보고된 바 있다.
오리나무 유래의 diarylheptanoid 일부 성분들이 항산화효과와 간세포 손상 억제효과16)가 있음을 저자 등에 의해 보고한 바가 있다. 본 연구에서는 식품 등으로 사용되고 있는 오리나무 추출 물을 이용하여 간질환 억제제로의 가능성을 각종 간손상 모델에서 조사하였다. oxidative stress 모델인 tert-butyl hydroperoxide (tBH), 바이러스성 간염 모델인 갈락토사민, 그리고 사염화탄소 로 유발시킨 간독성에 대한 오리나무 추출물의 보호효과를 정상 랫드의 일차배양 간세포로부터 확인하였다. 또한 간질환 예방 및 치료제로의 가능성을 알아보기 위해 다양한 간질환 동물모델을
#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 063-850-6822 (팩스) 063-854-6038 (E-mail) [email protected]
종설
사용하였다. 사염화탄소와 갈락토사민에 의한 급성간독성 동물 모델과 Methionine/Choline Deficient(MCD) 사료를 이용한 지 방간 동물모델에서 오리나무 추출물의 간 보호효과를 확인하였다.
실험방법
시료, 시약 및 기기
본 실험에 사용한 Alnus japonica 추출물(AI-1367)은 (주)RNL 바이오 중앙연구소에서 공급 받아 사용하였다. tBH, D- galactosamine, insulin, dexamethasone, penicillin/streptomycin, Ca2+-free Hanks’balanced salt solution(HBSS), collagen type I from rat tail, collagenase type IV, 3'-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethylsulfoxide (DMSO)와 silibinin은 Sigma Chemical Co.(St Louis, USA)에 서 구입하였으며 Silymarin은 대조약물로써 Aldrich Chemical Co., Inc.(Milwaukee, USA)에서 구입하였다. William's E medium and fetal bovine serum(FBS)는 Gibco-BRL(Grand Island, USA)에서 구입하였다. CCl4는 SHOWA Chemical Co.
(Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 Methionine/Choline control 사 료, Methionine/Choline deficient 사료는 MP Biomedicals, LLC.(Ohio, USA) 구입하여 사용하였다. 면역염색에 사용된 COX- 2는 Santa cruz(California, USA), IHC(one step plymer) Polink-1 HRP Rabbit kit(WA, USA)에서 구입하였다. 흡광도는 Bio-Rad(CA, USA)의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
실험동물
CCl4, 갈락토사민실험에는 외견상 건강한 23~25 g ICR계 웅 성 마우스를 사용하였으며, MCD 사료 실험에는 외견상 건강한 25~30 g C57BL6/J계 웅성 마우스를 사용하였다. 그리고 간세포 분리는 200~220 g Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 사용하였다.
실험동물은 대한바이오링크(음성, 충북)에서 공급받았으며 일정 한 조건(온도: 22~25oC, 습도: 40~60%(RH), 명암: 12시간 점 등(조명: 06:00~18:00), 조도: 150~300 Lux)에서 표준사료와 물 을 충분히 공급하면서 7일간 적응시킨 후 실험하였다.
간세포 분리 및 배양
Sprague-Dawley 계열의 수컷 흰쥐(200~220 g)로부터 2-step perfusion 법17)을 이용하여 간세포를 다음과 같이 분리한다. 마 취한 흰쥐의 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관한다. 1단계로 5%
CO2및 95% O2의 혼합기체를 불어넣은 37oC의 CMF-HBSS을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하고 desmosome cleavage를 유도한다. 2단계로 0.05% collagenase type IV 및 1 mM CaCl2 용액을 흘려보내 간세포를 유지하고 있는 collagenous extracellular matrix를 분해한다. 이후 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음
hepatocyte suspension을 만들어 원심분리(50×g, 2 min, 4oC)를 3회 반복하여 collagenase, 기타 cell 및 그 debris를 제거하고 hepatocyte pellet을 얻는다. collagen type I으로 코팅된 배양용 기에 5%(v/v) fetal bovine serum, 10-8M insulin 50 U/ml의 페 니실린 및 50 µg/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 Williams' Medium E를 배양액으로 하여 세포수가 5×105cells/ml되도록 한 후, 5% CO2, 37oC의 조건에서 배양한다. 2시간 배양 후 세 포를 wash하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교 체한 다음 5% CO2, 37oC의 조건에서 16~18시간 동안 배양시 킨 다음 실험에 사용한다.
간세포의 간독성 유도 및 생존률, LDH 효소 활성도 측정 간세포는 1.2 mM tBH에서 50분, 5 mM CCl4에서 1.5 h, 30 mM 갈락토사민에서 24시간 노출시켜 간독성을 유도하며,18) 약물은 간독성유도 10분 전에 처리하며 DMSO에 녹여 사용하 였다. 대조약물로써 silibinin을 사용하였다.19) LDH효소 활성도 는 Roche사의 Cytotoxicity Detection kit(Cat. 11 644 793 001)를 사용하여 측정하였다. 세포생존율은 MTT법을 이용하여 측정하였다.
CCl4및 갈락토사민에 의한 간독성 동물모델
ICR 계통의 수컷 마우스(체중 23~25 g)를 각 군당 8마리씩 사 용하였다. 순화기간을 거쳐서 체중을 측정하여 군 분리를 실시 한 후 각 개체별로 폴리카보네이트 사육상자에 수용하였다. 실 험물질인 오리나무추출물(20, 10, 5 mg/kg p.o.)은 3일간 동안 경 구 투여를 하고 4일째 되는날 사염화탄소(20 ml/kg, I.P.),20)갈락 토사민(800 mg/kg, I.P.)21)을 주사하였다. 그리고 24시간 후 채혈 과 동시에 부검을 실시하여 간장에 대한 조직병리학적 관찰을 실 시하였다. Sylimarin(50 mg/kg p.o.)을 대조약물로 사용하였다.
MCD-사료에 의한 지방간염 동물모델
C57BL6/J 계통의 수컷 마우스(체중 25~3 g)를 각 군당 8마 리씩 사용하였다. 순화기간을 거쳐서 체중을 측정하여 군 분리 를 실시한 후 각 개체별로 폴리카보네이트 사육상자에 수용하였 다. 실험물질인 오리나무추출물(10, 5, 2.5 mg/kg p.o.)은 5일/주 간동안 경구 투여를 하고 MCD 사료 및 정제된 물은 자유롭게 섭식할 수 있게 하였다. 그리고 4주 후에 채혈과 동시에 부검을 실시하여 간장에 대한 조직병리학적 관찰을 실시하였다. 실험기 간 동안 실험동물 체중은 주 1회씩 측정하였다.22)
혈청분석
채취한 혈액은 실온에서 30분간 방치한 후 400×g로 원심분리 하여 혈청을 분리한다. 분리한 혈청은 Autodry Chemistry Analyzer(SPOTCHEMTMSP4410, Arkray, Japan)로 aspartate
transaminase, alanine transaminase와 triglyceride를 측정한다.
조직병리학적 관찰
혈액 채취를 마치고 완전히 방혈 시킨 후 각각의 동물로부터 간을 취하여 10% 중성 포르말린에 조직을 고정시키고 paraffin 으로 embedding과정을 거쳐 5 µm의 절편으로 만들고 hematoxylin-eosin으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
면역조직화학적 검색
파라핀에 포매된 조직을 절편한 후 COX-2 항체를 이용하여 면역조직화학적 염색의 준비과정을 거쳐 검색하였다. 즉 파라핀 포매조직을 5 µm의 절편으로 자르고 Xylene으로 탈 파라핀 시 킨 다음 95%, 80%, 70% 알코올로 함수시킨다. 이어서 pH 6.0 으로 조정된 10 mM의 citrate 완충용액에 슬라이드를 넣고 Autoclave를 사용하여 121oC에서 10분 동안 처리하여 실온에서 식힌 후 3% 과산화수소수를 이용하여 상온에서 10분 동안 처리 하였다. 그리고 1차 항체로 1:300으로 희석한 COX-2를 실온에 서 각각 40분간 반응시킨 후 PBS로 다시 3회 세척하였다. 그후 Plymer HRP를 실온에서 15분간 반응시킨다. 수세 후 발색제 diaminobenzidine(DAB)을 5~10분간 발색시켜 흐르는 물에 씻 어내고, Mayer 헤마톡실린 대조 염색하여 비수용성 봉입제로 봉 입한 다음 광학현미경으로 관찰하였다.
통계처리
실험결과는 통계처리 하여 평균±표준편차 나타내었으며, 각 실험군 간의 유의성 검정은 통계프로그램인 GraphPad Prism (version 4.0, GraphPad Software Inc. USA)를 이용하여 5% 수 준에서 Dunca's multiple range test로 확인하였다.
결과 및 고찰
일차배양 간세포에서 오리나무 추출물의 tBH, 갈락토사민, CCl4에 의해 유도된 간독성에 대한 보호작용
오리나무 추출물(AI-1367)의 1.5 mM tBH에 의한 간독성에 대 한 간세포 보호작용은 Table I에서와 같이 오리나무 추출물 50 µg/
ml 처리군에서는 30%(p<0.001)의 세포생존률과 간독성 발생시 간세포에서 유리하는 LDH를 51%(p<0.01) 감소하였다.
5 mM CCl4에 의한 간독성에 대한 간세포 보호작용은 Table II와 같이 오리나무 추출물 100 µg/ml 처리군에서 63%(p<0.001) 의 세포생존율과 오리나무 추출물 50 µg/ml, 100 µg/ml 투여군 에서 각각 65%(p<0.001), 95%(p<0.001)의 LDH 감소를 나타 냈다.
30 mM 갈락토사민에 의한 간독성에 대한 간세포 보호작용은 Table III과 같이 오리나무 추출물 20 µg/ml, 50 µg/ml에서 각각 55%(p<0.001), 60%(p<0.001)의 세포생존율과 각각 43%(p<
Table II− Effect of Alnus japonica extract treatment on the release of lactate dehydrogenase (LDH), cell viability content of hepatocytes treated for 1.5 h with 5 mM carbon tetrachloride
Treatment LDH (IU/l) Cell viability (OD)
Nomal 0.246±0.047*** 3.381±0.023***
CCl4 alone 0.844±0.053 0.487±0.035
+Alnus japonica extract 100µg/ml 0.273±0.034*** 2.313±0.567***
50µg/ml 0.455±0.043*** 0.803±0.048
20µg/ml 0.652±0.043* 0.612±0.143
5µg/ml 0.763±0.097 0.504±0.032
+Silibinin 200µM 0.408±0.093*** 2.550±0.191***
50µM 0.657±0.002* 0.537±0.010
Values are expressed as means±SD of three replicates.
*=p<0.05, **=p<0.01, **=p<0.001; indicates a significant difference from the group treated with CCl4 alone.
Table I− Effect of Alnus japonica extract treatment on the release of lactate dehydrogenase (LDH), cell viability content of hepatocytes treated for 50 min with 1.5 mM tert-butyl hydroperoxide (tBH)
Treatment LDH (IU/l) Cell viability (OD)
Nomal 0.266±0.018*** 1.916±0.041***
tBH alone 0.674±0.058 0.493±0.034
+Alnus japonica extract 50µg/ml 0.465±0.058** 0.932±0.062***
20µg/ml 0.499±0.072* 0.653±0.087
5µg/ml 0.519±0.117 0.538±0.102
+Silibinin 200µM 0.299±0.148*** 1.020±0.198***
50µM 0.579±0.105 0.683±0.179*
Values are expressed as means±SD of three replicates.
*=p<0.05, **=p<0.01, **=p<0.001; indicates a significant difference from the group treated with tBH alone.
0.01), 46%(p<0.01)의 LDH가 감소되였다.
오리나무 추출물(AI-1367)은 tBH, CCl4, 갈락토사민 세가지 간독성 물질에 대한 보호작용을 나타냈으며 용량 의존적으로 세 포생존율은 증가하였으며 LDH 유리량은 감소하였다.
CCl4급성간독성 동물모델에서 오리나무 추출물의 간독성 보호작용 CCl4급성 간 독성 동물모델에서 CCl4(20 ml/kg I.P.) 투여군의 혈청 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 Normal 마우스 혈청 Aspartate transaminase 및 Alanine transaminase 의 4629% 및 43534%였다. 오리나무 추출물(AI-1367)(20, 10,
5 mg/kg, p.o.)을 3회 전처치하고 CCl4를 투여한 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 Fig. 1A에서 와 같다. 오리나무 추출물을 20 mg/kg을 투여한 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 CCl4투여군 의 29%(p<0.001) 및 32%(p<0.001) 수준으로 유의하게 감소하 였으며 10 mg/kg을 투여한 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 CCl4투여군의 19%(p<0.001) 및 25%
(p<0.001) 수준으로 유의하게 감소하였다. 간조직 절편을 Hematoxylin-eosin 염색을 통하여 CCl4투여로 인한 간조직의 미세구조 변화는 Fig. 2와 같다. 정상군은 어떠한 조직학적 이상 Table III− Effect of Alnus japonica extract treatment on the release of lactate dehydrogenase (LDH), cell viability content of hepatocytes
treated for 24 h with 30 mM D-galactosamine (D-GalN)
Treatment LDH (IU/l) Cell viability (OD)
Nomal 0.392±0.053*** 1.678±0.108***
D-GalN alone 0.770±0.027 0.264±0.021
+Alnus japonica extract 50µg/ml 0.593±0.104** 1.123±0.220***
20µg/ml 0.604±0.108** 1.046±0.105***
5µg/ml 0.731±0.093 0.326±0.099
+Silibinin 200µM 0.598±0.109** 1.102±0.135***
50µM 0.578±0.069** 0.574±0.058***
Values are expressed as means±SD of three replicates.
*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001; indicates a significant difference from the groups treated with GalN alone.
Fig. 1− Effect of Alnus japonica extract on serum asparate transaminase and alanine transaminase. A: protective effect of Alnus japonica extract administered at 0, 24, 48 h before the CCl4 injection in mouse. CCl4 (20 ml/kg) was administered to mouse by intraperitoneal injection. Alnus japonica extract 20 mg/kg (Al20), 10 mg/kg (Al10), 5 mg/kg (Al5) and the reference drug silymarin 50 mg/kg (S50) was administered orally to mouse. Control mouse (Al0) received the vehicle. Serum was obtained 24 h after CCl4 injection. B: Protective effect of Alnus japonica extract administered at 0, 24, 48 h before D-galactosamine (D-GalN) injection in mouse. D-GalN (800 mg/kg) was administered to mouse by intraperitoneal injection. Alnus japonica extract 20 mg/kg (Al20), 10 mg/kg (Al10), 5 mg/kg (Al5) and the reference drug silymarin 50 mg/kg (S50) was administered orally to mouse. Control mouse (Al0) received the vehicle. Serum was obtained 24 h after D-GalN injection. Values are expressed as mean±SD. Number of mouse in each group was at least 8. * P<0.05,
** P<0.01 and ***<0.001, were significantly different from control (B0+CCl4 or B0+D-GalN).
도 관찰되지 않았으나 CCl4군에서는 간세포의 괴사와 변성 및 염증세포의 침윤이 심하게 관찰되었다. 하지만 오리나무 추출물 (AI-1367) 10 mg/kg 투여군에서는 간손상 뚜렷이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 혈청분석과 형태학적 관찰을 통하여 오리나 무 추출물(AI-1367)이 CCl4에 의해 유도된 간손상을 예방하는 효 과가 있는 것으로 사료된다.
갈락토사민 급성 간독성 동물모델에서 오리나무추출물의 간독성 보 호작용
갈락토사민 급성 간독성 동물모델에서 갈락토사민(800 ml/
kg I.P) 투여군의 혈청 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 Normal 마우스 혈청 aspartate transaminase 및 alanine transaminase의 947% 및 1803%이다. 오리나무 추출물 (AI-1367)(20, 10, 5 mg/kg, p.o.)를 3회 전처치하고 갈락토사민을 투여한 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase 는 Fig. 1B에서와 같다. 오리나무 추출물을 20 mg/kg을 투여한 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 갈 락토사민 투여군의 29%(p<0.001) 및 44%(p<0.001) 수준으로 감소하였고 10 mg/kg을 투여한 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 갈락토사민 투여군의 56%(p<0.01)
및 59%(p<0.05) 수준으로 감소하였으며 5 mg/kg 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 갈락토사민 투여군의 57%(p<0.01) 및 70.8%(p<0.01) 수준으로 감소하였다.
이상의 혈청분석 결과로부터 오리나무 추출물(AI-1367)은 aspartate transaminase 및 alanine transaminase 활성을 용량의 존적으로 억제함으로써 간을 보호 하는 것으로 사료된다.
MCD 사료에 의한 지방간염 동물모델에서 오리나무추출물의 간 보 호작용
MCD 사료에 의한 지방간염 동물모델에서 체중변화를 확인한 결과는 Table IV와 Fig. 3에서와 같다. 정상군에서는 4주와 5주 에서 유의성 있는 체중 증가가 있고 대조군, 오리나무 추출물(AI- 1367)(10, 5, 2.5 mg/kg p.o.), silymarin(50 mg/kg p.o.) 투여군 모두에서 유의성 있게 체중이 감소하였다. 그러나 약물 투여군 은 대조군에 비하여 적게 감소되었으나 유의성은 인정되지 않았다.
MCD 및 MCC 사료 투여 4주 후 MCD 사료 투여군 혈청 aspartate transaminase, alanine transaminase 및 triglyceride는 MCC 사료 투여 마우스 혈청 aspartate transaminase 및 alanine transaminase의 417%, 2771% 및 226%이다. 오리나무 추출물 (AI-1367)과 MCD 사료를 투여한 투여군의 aspartate transaminase, Alanine transaminase 및 triglyceride는 Fig. 4에서와 같다. 오리 Fig. 2− Histological obserbation of Alnus japonica extract-treated
mouse liver injured by CCl4. Liver sections were stained with hematoxylin and eosin. A: Normal liver. B: CCl4 liver.
C: CCl4+20 mg/kg Al. D: CCl4+10 mg/kg Al. E: CCl4+ 50 mg/kg Silymarin (Original magnification ×200).
Fig. 3− Significant body weight changes were observed from the first week of the expeiment in 5 experimental groups (p<0.001). Weight loss in the control group (MCC group) was less than the other 4 treatment groups, thouth showed no significance.
Table IV− Body weight change of C57BL6/J mice with MCD diet and treatment
Treatment (mg/kg) -1 week 0 week 1 week 2 week 3 week 4 week
MCC 23.62±1.2 23.16±1.66 24.69±1.32 25.08±0.87 25.75±1.48 25.81±0.85
MCD 23.67±1.19 22.42±2.5 20.25±1.3* 19.24±1.11* 017.8±0.77* 017.1±1.11*
+AI-1367 10 23.44±1.35 22.92±1.76 20.17±1.59* 19.02±1.39* 17.41±1.05* 17.32±0.97*
5 24.14±1.19 23.33±1.85 20.64±1.15* 020.4±1.72* 18.34±1.38* 17.73±1.47*
2.5 24.27±0.83 23.06±1.2 20.88±1.05* 18.04±3.39* 18.06±0.96* 017.2±0.83*
+Silymarin 50 24.19±0.94 23.54±0.78 20.88±1.02* 20.15±1.3* 18.69±0.83* 18.08±0.81*
Values represent means±SD.
*=p<0.001 compared with the MCC.
Fig. 4− Effect of Alnus japonica extract on serum asparate transaminase, alanine transaminase and triglyceride in mice fed the MCD diet.
C57BL6/J mice were fed an MCD diet and treatment of Alnus japonica extract for 4 weeks and seruml Aspartate transaminase, Alanine transaminase and triglyceride levels were measured. Alnus japonica extract 10 mg/kg (A10), 5 mg/kg (A5), 2.5 mg/kg (A2.5) and the reference drug silymarin 50 mg/kg (Sil50) was administered orally to mouse. Values are expressed as mean±SD. Number of mouse in each group was at least 8. * P<0.05, ** P<0.01 and ***<0.001, were significantly different from control (MCD).
Fig. 5− Histological obserbation of Alnus japonica extract -treated mouse liver injured by MCD diet. Liver sections were stained with hematoxylin and eosin. A: Normal liver. B: MCD diet liver. C: MCD diet+10 mg/kg Al. D: MCD diet+5 mg/kg Al. E: CCl4+50 mg/
kg Silymarin. (Original magnification ×200).
나물 추출물 10 mg/kg 투여군의 aspartate transaminase, alanine transaminase 및 triglyceride는 MCD 사료군의 60%, 41% 및 66%(p<0.001) 수준으로 감소하였으며, 5 mg/kg 투여군의 aspartate transaminase 및 alanine transaminase는 MCD 사료 군의 93% 및 53%(p<0.01) 수준으로 감소하였다.
간 조직을 Hematoxylin-eosin 염색을 통하여 MCD 사료에 인 한 간조직의 미세구조 변화는 Fig. 5와 같다. 정상군에서는 간소
엽의 입체구조가 잘 유지되었고, 문맥 주위 및 중심정맥 주위의 섬유화 및 간세포 괴사나 염증반응은 관찰되지 않으나, 대조군 및 약물 투여군에서는 간소엽의 입체구조가 소실되면서 많은 지 방축적이 관찰되었다. 오리나무 추출물(AI-1367) 10 mg/kg, 5 mg/
kg 투여군에서는 지방축적이 대조군에 비하여 뚜렷이 감소하였 음을 확인할 수 있었다. 혈청분석과 형태학적 관찰을 통하여 오 리나무 추출물(AI-1367)이 MCD 사료에 의해 유도된 지방간염 을 예방하는 효과가 있는 것으로 생각된다.
COX-2 단백질 발현에 미치는 영향
사염화탄소와 갈락토사민에 의한 급성간독성 동물모델과 Methionine/Choline Deficient(MCD) 사료를 이용한 지방간 동 물모델에서 오리나무 추출물(AI-1367) 10 mg/kg 투여군 간조직 에 대하여 면역조직화학염색을 진행하여 COX-2의 발현을 음성 대조군과 비교하여 관찰하였다. 결과 오리나무 추출물(AI-1367) 10 mg/kg 투여군에서 COX-2 의 발현이 음성대조군보다 뚜렷이 감소되는 것을 관찰할 수가 있었다(Fig. 6). 이러한 결과에서 오 리나무 추출물(AI-1367)은 급성간독성, 지방간 동물모델에서 COX- 2의 발현을 억제함으로서 염증발현을 감소하고 또한 COX-2 prostanoids 신호전달계통에 영향을 줌으로써 간보호 및 치료효 과를 나타내는 것으로 사료된다.
결 론
본 연구에서는 시중에서 식품으로 사용되고 있는 오리나무 추 출물(AI-1367)의 간보호 효과를 규명하기 위해 랫드에서 분리한 일차간세포를 이용하여 검색하였으며, CCl4, 갈락토사민에 의한 급성 간독성 동물모델 및 MCD 사료에 의한 만성 지방간염 동 물 모델을 이용하였다.
랫드에서 분리한 일차 간세포를 tBH, 갈락토사민, CCl4를 간 독성 유발물질로 간독성을 유발하고 세포생존율과 간독성 지표 로 간세포질 효소 중 하나인 LDH의 배양액으로의 유출정도를 측정하였다. 오리나무 추출물은 간독성 유발물질에 따라 차이가 있지만 LDH의 유리를 유의성 있게 억제하며 세포생존율을 높 여주었다.
CCl4및 갈락토사민에 의한 급성 간독성 모델에서 오리나무 추출물(AI-1367)은 현저히 증가하였던 aspartate transaminase 및 alanine transaminase활성을 억제하였다. CCl4모델에서는 20, 10 mg/kg 투여군에서 유의적인 감소를 보였으며 갈락토사민모델 에서는 20, 10, 5 mg/kg 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
조직관찰을 통해 오리나무 추출물은 CCl4로 인해 유발된 간세포 의 괴사, 변성을 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
MCD 사료 모델에서 MCD 사료의 투여는 마우스의 체중을 유 의성 있게 감소시켰으며, 오리나무 추출물(AI-1367) 투여군은 대 Fig. 6− Immunohistochemistry obserbation of Alnus japonica
extract-treated mouse liver injured by MCD diet, CCl4, GalN Liver sections were stained with COX-2. A. Sham liver. B: MCD diet liver. C: MCD diet+10 mg/kg Al. D:
CCl4 liver. E: CCl4+AI 10 mg/kg F. GalN liver, G GalN+AI 10 mg/kg (Original magnification ×200).
조군에 비해 체중감소가 심하지 않았으나 유의성은 인정되지 않 았다. 오리나무 추출물(AI-1367)은 MCD 사료에 의한 aspartate transaminase 상승을 억제하였고 alanine transaminase 상승은 10, 5 mg/kg 투여군에서 유의적으로 억제하였으며 triglyceride은 10 mg/kg 투여군에서 유의적으로 억제하였다. 그리고 간조직의 지방축적이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
또한 면역조직화학적염색을 통하여 COX-2의 발현을 검토한 결과 사염화탄소와 갈락토사민에 의한 급성간독성 동물모델과 Methionine/Choline Deficient(MCD) 사료를 이용한 지방간 동 물모델 모두에서 오리나무 추출물(AI-1367) 10 mg/kg 투여군은 COX-2의 발현을 억제하였다.
이상에서 오리나무 추출물(AI-1367)은 MCD 사료로 유발된 비 알콜성 지방간 동물모델에서 간기능회복, 지방축적 억제에 효과 가 있음이 확인되었으며, CCl4, 갈락토사민으로 유발된 급성 간 독성 동물모델에서 간세포의 괴사 및 변성 감소, aspartate transaminase, alanine transaminase 및 triglyceride 활성, COX- 2발현 억제효과가 있음이 확인 되었다. 이러한 효과는 오리나무 추출물의 간세포 보호, 염증억제에 의한 것으로 추정되며 반응 기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
감사의 말씀
본 연구는 (주)알앤엘바이오의 연구 지원에 의해 수행되었으 며 이에 감사드립니다.
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