Synthesis and DNA methyltransferase inhibitory activity of <i>N,N'</i>-(alkanediyl)bis(phenylacetamide) derivatives

Yakhak Hoeji Vol. 63, No. 2 DOI 10.17480/psk.2019.63.2.113

N,N'-(Alkanediyl)bis(phenylacetamide)유도체 합성 및 DNA methyltransferase 저해활성

이소현·마은숙^#

대구가톨릭대학교 약학대학

Synthesis and DNA methyltransferase inhibitory activity of N,N'-(alkanediyl)bis(phenylacetamide) derivatives

Sohyun Lee and Eunsook Ma^#

College of Pharmacy, Daegu Catholic University

(Received March 26, 2019 Revised April 18, 2019 Accepted April 20, 2019)

Abstract DNA methyltransferases (DNMTs) are epigenetic enzymes responsible for gene expression in cancer, therefore their inhibitors have been considered as target for the treatment and prevention of cancer. Psammaplin A (PsA) with dimeric disulfide structure exhibits excellent DNMT inhibitory activity, but there are synthetic limitations in the development of various derivatives. To develop various DNMT inhibitors that are easy to synthesize, N,N'-(alkanediyl) bis(phenylacetamide) derivatives 1-16 were synthesized from 3- or 4-substituted phenylacetic acids and α,ω-diaminoalkanes (NH₂(CH₂)_nNH₂, n=2-5) and evaluated for the preliminary screening of DNMT inhibitory activity using PsA as an positive control. The DNMT inhibitory activities (21-91%) of all synthesized compounds were lower than that of PsA (>100%) at 200μM concentration. Among them, N,N'-(pentane-1,5-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (12) was found to be most active compound with DNMT inhibition of 91%.

Keywords DNA methyltransferase, N,N'-(alkanediyl)bis(phenylacetamide), epigenetics

서 론(Introduction)

후성유전학(Epigenetics)은 DNA 염기 서열에는 변화를 주지 않고 chromatin remodeling에 의하여 비정상적으로 유전자 발현 을 유도하는 것을 연구하는 학문이다. 후성유전학은 가역적으로 유전자 변이를 일으키며 크게 DNA methylation과 histone mod- ification (histone deacetylation, histone acetyltransferase, 및 his- tone methylation) 등이 해당된다.

DNA methylation 은 DNA methyltransferase (DNMT) 에 의해 CpG 5' 탄소 부위에 메틸기가 결합되는 것이다.

불규칙한 DNA methylation은 여러 가지 유 전병 증후군의 원인이며, 또한 인간 암 발생에 중요한 역할을 할 수 있다. 특히 암세포에서는 종양억제유전자나 다른 암 관련 유전자의 promotor부위에 비정상적으로 과메틸화(hypermethylation) 되는 현상이 일어나는 것으로 알려져 있다

그러므로 DNMT 효소 활성을 저해하면 암 억제유전자의 과메틸화가 저해되어 암

억제유전자가 정상적으로 재발현 되어 암세포의 증식을 억제할 수 있게 된다. 현재 DNMT저해제는 후성유전학(epigenetics)의 대 표적인 항암제 개발 타겟 중의 하나이다.

DNMT 저해제는 nucleoside와 non-nucleoside계열로 나눌 수 있으며 nucleoside계열은 대표적으로 5-azacytidine (Aza-C, Vidaza, Celgene) 과 azacytidine의 유도체인 5-aza-2'-deoxycytidine (decitab- ine, Dacogene, SuperGen) (Fig. 1) 만이 2004년과 2005년에 미국 FDA 의 승인을 얻었다. 이들 화합물은 여전히 독성과 화학적인 불안정성

에도 불구하고 골수형성이상증후군(myelodysplastic syndrome, MDS) 등 여러 암의 치료제로 사용되고 있다.

이 계 열의 화합물은 직접적인 DNMT 저해제가 아니라 DNA에 삽입 되어 복제 시 DNA 메틸화가 더 이상 일어나지 않게 하는 suicide substrate 로 작용한다. Zebularine (2-pyridinon-1-β-

-ribose, Fig. 1) 은 5-azacytidine과 decitabine에 비해 화학적인 안정성은 있으나 반감기가 짧아 자주 복용해야 하는 불편함이 있다.

이처럼 nucleoside 계열의 DNMT 저해제의 높은 독성과 짧은 반감기가 이들 약물의 사용을 제한시키게 된다.

Nucleoside 계열의 저해제가 가지는 문제점을 극복하기 위하 여 non-nucleoside 계열의 DNMT저해제 개발이 필요하였다. N- Phthaloyl-

-tryptophan (RG 108) 은 fragment-based virtual screening

#

Corresponding author

Eunsook Ma

, College of Pharmacy, Daegu Catholic University, 13- 13 Hayang-ro Gyeongsan-si, 38430, Korea

Tel: +82-53-850-3621, Fax: +82-53-850-3602

E-mail: [email protected]

으로 drug design하여 합성된 화합물로

동물실험결과 효능은 감소하고 독성은 남아있는 단점이 보고되었다.

SGI-1027 은 심 각한 독성없이 methylation cofactor인 S-adenosyl-

-methionine (SAM, AdoMet) 과 경쟁적으로 DNMT 활성을 저해하는 quinolone- based 화합물이다.

Procainamide는 부정맥치료제로 FDA 승인 을 받은 약물로서 DNMT저해작용이 있음이 알려졌으며,

저해 활성 증가를 위하여 RG-108 같은 DNMT 저해제 등과 linker된 화합물도 보고되어 있다.

Psammapline A (PsA)는 해양천연물 Psammaplysillia sponge 에서 1987년 처음으로 분리된 dimeric dis- ulfide 구조를 가진 화합물로서

histone deacetylase (HDAC) 와 DNMT 효소 저해작용, topoisomerase저해작용, 항암, 및 항균 작 용 등을 가진 것으로 알려져 있다.

이처럼 다양한 활성을 가 진 PsA와 유도체의 효율적인 합성 및 활성 증가를 위한 연구들 이 보고되어 있다.

그러나 PsA유도체의 DNMT 저해작용에 대하여 실험한 연구는 많지가 않다.

본 실험에서는 PsA 유도체 합성은 대부분 pyruvic acid 유도 체를 사용하기 때문에 출발물질 선택에 제한 요소가 되므로 PsA 를 modification시켜 단순한 방법으로 다양한 DNMT 저해제를 합성하고자 하였다. PsA의 hydroxyimino group은 제거하고 PsA 구조 내 dimer를 연결하고 있는 disulfide 결합 대신에 alkane chain으로 linker된 dimer 화합물을 골격구조로 선택하였다. 이를 위하여 PsA의 출발물질인 3-bromo-4-hydroxypyruvic acid 대신에 4-hydroxy 기를 제거한 3-치환 phenylacetic acid, 모두 제거한 phe- nylacetic acid 및 procainamide와 동일한 치환기를 가진 4-ami-

nophenylacetic acid를 사용하여 α,ω-diaminoalkanes (NH

(CH

)

NH

, n=2-5)와 반응시켜 N,N'-(alkanediyl)bis(phenylacetamide) 유도체를 합성하고 이들의 DNMT 저해 효과에 대하여 screening하였다.

실험방법(Experimental Methods)

사용기기

실험에 사용한 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA) 또 는 TCI사(Tokyo, Japan)에서 구매하였다. 용매는 필요한 경우 사 용 전에 정제하거나 건조시켜 사용하였다. 녹는점은 Thomas-Hoover melting point apparatus (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA) 를 사용하여 측정하였고 별도의 보정은 하지 않았다.

H 및

13

C NMR spectra 측정은Varian 400 MHz spectrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 를, 측정용매는 DMSO-d

를 사용하였다. Chemical shifts (δ)는 내부 표준물질로 tetramethylsilane 을 사용하여parts per million (ppm)으로, coupling constants (J)는 Hertz로 나타내었다. GC/MS (EI) 측정은 SHIMADZU QP 2010 model (Shimadzu, Kyoto, Japan)을, fraction collection는 EYELA fraction collector DC-1500 (Tokyo Rikakikai, Tokyo, Japan) 을 사용 하였다. TLC는silica gel 60 F

plates (Merck, Kenilworth, NJ, USA) 을 사용하였고, 분리 용매는ethyl acetate/n-hexane mixtures 또 는 methanol/dichloromethane을 사용하였다. Column chromatography 는 Merck silica gel 9385 (Merck, Kenilworth, NJ, USA) (230- 400 mesh) 을 사용하여 분리 정제하였다.

Fig. 1. Nucleoside and non-nucleoside DNA methyltransferase inhibitors.

각 화합물의 합성방법

화합물 1-12의 합성방법-Method A: 3-치환 phenylacetic acid유 도체 (2 mmol)을 dimethylformamide (DMF, 10-20 mL)에 용해시 키고 N-hydroxysuccinimide (NHS, 345 mg, 3 mmol)과 dicyclo- hexylcarbodiimide (DCC, 721 mg, 3.5 mmol) 을 가하고 실온에서 1시간 교반시켰다. 반응혼합물에 해당 α,ω-diaminoalkane (NH

(CH

)

NH

, n=2-5, 1 mmol)을 DMF (5 mL)에 용해시킨 용 액을 가하고 24-48 시간 반응시킨 후 생성된 결정을 여과하였 다. 여액을 감압 농축하여 crude 오일상 또는 고체상 물질을 얻 고 column chromatography (ethyl acetate:n-hexane=1:1 또는 1:3 그리고 methanol:dichloromethane=1:9 또는 1:5)를 실시하여 백색 또는 미백색의 순수한 결정을 얻었다.

N,N'-(Ethane-1,2-diyl)bis(2-phenylacetamide) (1)-Phenylacetic acid (272 mg, 2 mmol와 1,2-diaminoethane (60 mg, 1 mmol)을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응시켜 백색 결정을 얻었다. Yield: 74% (220 mg), m.p: 135-138

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.27 (1H, s, NH), 7.22-7.36 (5H, m, H- 2,3,4,5,6), 3.71 (2H, s, CH

CO), 3.63 (2H, s, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 171.7 (C=O), 133.2 (C-1), 129.5 (C- 2,6), 128.7 (C-3,5) (C-4), 127.2, 39.6 (CH

CO), 38.2 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 296 [M]

.

N,N'-(Propane-1,3-diyl)bis(2-phenylacetamide) (2)-Phenylacetic acid (272 mg, 1 mmol) 과 1,3-diaminopropane (74 mg, 1 mmol)을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응시켜 미백색의 순 수한 결정을 얻었다. Yield: 65% (200 mg), m.p: 162-166

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.30 (1H, d, J=4.8 Hz, NH), 7.20-7.34 (5H, m, H-2,3,4,5,6), 3.70 (2H, s, CH

CO), 3.48 (2H, t, J=6.4 Hz, CH

), 1.92 (2H, quint, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 171.7 (C=O), 133.5, 130.0, 128.8, 127.2, 39.4 (CH

CO), 37.0 (CH

), 28.1 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 310 [M]

.

N,N'-(Butane-1,4-diyl)bis(2-phenylacetamide) (3)-Phenylacetic acid (272 mg, 1 mmol)과 1,4-diaminobutane (88 mg, 1 mmol)을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응시켜 백색의 순수 한 결정을 얻었다. Yield: 62% (200 mg), m.p: 154-157

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.34 (1H, d, J=4.2 Hz, NH), 7.22-7.35 (5H, m, H-2,3,4,5,6), 3.70 (2H, s, CH

CO), 3.22 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

), 1.59 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 171.7 (C=O), 134.2, 131.2, 129.3, 128.1, 39.5 (CH

CO), 38.3 (CH

), 27.4 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 324 [M]

.

N,N'-(Pentane-1,5-diyl)bis(2-phenylacetamide) (4)-Phenylacetic acid (272 mg, 1 mmol)과 1,5-diaminopentane (102 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응시켜 백색의 순 수한 결정을 얻었다. Yield: 59 % (200 mg), m.p: 111-114

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.50 (1H, d, J=4.2 Hz, NH), 7.21-7.35 (5H, m, H-2,3,4,5,6), 3.69 (2H, s, CH

CO), 3.20

(2H, t, J=7.0 Hz, CH

), 1.58 (2H, quint, J=6.4 Hz, CH

), 1.30 (2H, quint, J=6.4 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 171.7 (C=O), 134.1, 130.8, 129.0, 127.8, 39.6 (CH

CO), 39.0 (CH

), 28.9 (CH

), 23.0 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 336 [M]

.

N,N'-(Ethane-1,2-diyl)bis(2-(3-chlorophenyl)acetamide) (5)-3- Chlorophenylacetic acid (340 mg, 2 mmol)과 1,2-diaminoethane (60 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응 시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 60% (220 mg), m.p:

121-124

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.41 (1H, s, NH), 7.20-7.32 (3H, m, H-4,5,6), 7.44 (1H, s, H-2), 3.57 (2H, s, CH

), 3.61 (2H, s, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 170.9 (C=O), 135.4, 134.5, 130.0, 129.8, 128.1, 40.5 (CH

CO), 38.2 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 364 [M-1]

.

N,N'-(Propane-1,3-diyl)bis(2-(3-chlorophenyl)acetamide) (6)-3- Chlorophenylacetic acid (340 mg, 2 mmol)과 1,3-diaminopropane (74 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응 시켜 미백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 66% (250 mg), m.p:

140-142

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.37 (1H, d, J=4.4 Hz, NH), 7.17-7.30 (3H, m, H-4,5,6), 7.43 (1H, s, H-2), 3.55 (2H, s, CH

), 3.47 (2H, t, J=6.0 Hz, CH

), 1.90 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 170.8 (C=O), 135.9, 134.8, 131.3, 129.3, 128.1, 40.3 (CH

CO), 37.0 (CH

), 28.1 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 378 [M-1]

.

N,N'-(Butane-1,4-diyl)bis(2-(3-chlorophenyl)acetamide) (7)-3- Chlorophenylacetic acid (340 mg, 2 mmol)과 1,4-diaminobutane (88 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응 시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 59 % (230 mg), m.p:

170-174

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.25 (1H, d, J=5.2 Hz, NH), 7.21-7.35 (3H, m, H-4,5,6), 7.47 (1H, s, H- 2),3.58 (2H, s, CH

), 3.56 (2H, q, J=6.8 Hz, CH

), 1.57 (2H, t, J=7.2 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 170.7 (C=O), 135.5, 134.5, 131.1, 129.8, 129.4, 127.8, 40.2 (CH

CO), 38.3 (CH

), 27.4 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 392 [M-1]

.

N,N'-(Pentane-1,5-diyl)bis(2-(3-chlorophenyl)acetamide) (8)-3- Chlorophenylacetic acid (340 mg, 2 mmol)과 1,5-diaminopentane (102 mg, 1 mmol)을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반 응시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 59% (240 mg), m.p:

202-206

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.22 (1H, d, J=4.4 Hz, NH), 7.20-7.33 (3H, m, H-4,5,6), 7.50 (1H, s, H-2), 3.56 (2H, s, CH

), 3.55 (2H, q, J=6.4 Hz, CH

), 1.60 (2H, quint, J=6.8 Hz, CH

), 1.28 (2H, quint, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 170.9 (C=O), 136.0, 134.9, 131.7, 129.5, 129.0, 127.8, 40.4 (CH

CO), 39.7 (CH

), 28.7 (CH

), 22.7 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 406 [M-1]

.

N,N'-(Ethane-1,2-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (9)-3-

Bromophenylacetic acid (430 mg, 2 mmol)과 1,2-diaminoethane

(60 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응 시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 73% (330 mg), m.p:

155-158

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 7.36-7.40 (3H, m, H-2,4,5), 7.25 (1H, d, J=6.8 Hz, H-6), 3.64 (2H, s, CH

CO) 3.60 (2H, s, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 169.7 (C=O), 135.6, 131.9, 130.3, 129.9, 127.4, 123.1, 40.5 (CH

CO), 38.2 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 454 [M+1]

, 452 [M-1]

.

N,N'-(Propane-1,3-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (10)- 3-Bromophenylacetic acid (430 mg, 2 mmol)과 1,3-diaminopropane (74 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응 시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 68% (320 mg), m.p:

165-168

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 7.35-7.39 (3H, m, H-2,4,5), 7.24 (1H, d, J=6.8 Hz, H-6), 3.65 (2H, s, CH

CO), 3.47 (2H, t, J=6.0 Hz, CH

), 1.90 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 169.8 (C=O), 135.5, 132.0, 130.2, 129.9, 127.2, 123.3, 40.6 (CH

CO), 37.0 (CH

), 28.1 (CH

, GC-Mass (EI) m/z: 468 [M+1]

, 466 [M-1]

N,N'-(Butane-1,4-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (11)-3- Bromophenylacetic acid (430 mg, 2 mmol)과 1,4-diaminobutane (88 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반응 시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 70 % (337 mg), m.p:

178-181

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 7.35-7.40 (3H, m, H-2,4,5), 7.24 (1H, d, J=6.8 Hz, H-6), 3.65 (2H, s, CH

CO) 3.56 (2H, q, J=6.0 Hz, CH

), 1.57 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 169.7 (C=O), 135.4, 131.8, 130.3, 129.7, 127.4, 123.1, 40.6 (CH

CO), 38.3 (CH

), 27.4 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 482 [M+1]

, 480 [M-1]

.

N,N'-(Pentane-1,5-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (12)- 3-Bromophenylacetic acid (430 mg, 2 mmol)과 1,5-diaminoethane (102 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 동일한 방법으로 반 응시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 68% (337 mg), m.p:

153-156

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 7.37-7.41 (3H, m, H-2,4,5), 7.26 (1H, d, J=6.8 Hz, H-6), 3.64 (2H, s, CH

CO), 3.55 (2H, q, J=6.0 Hz, CH

), 1.56 (2H, quint, J=6.8 Hz, CH

), 1.28 (2H, quint, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 169.7 (C=O), 135.6, 131.4, 130.0, 129.8, 127.0, 123.5, 40.7 (CH

CO), 39.0 (CH

), 28.9 (CH

), 23.0 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 496 [M+1]

, 494 [M-1]

.

화합물 13a-16a의 합성 방법- 4-Nitrophenylacetic acid (362 mg, 2 mmol)과 해당 α,ω-diaminoalkane (NH

(CH

)

NH

, n=2-5, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 같은 방법으로 반응을 실시하 여 황색 또는 미황색의 결정을 얻었다.

N,N'-(Ethane-1,2-diyl)bis(2-(4-nitrophenyl)acetamide) (13a)-4- Nitrophenylacetic acid (362 mg, 2 mmol)과 1,2-diaminoethane (60 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 같은 방법으로 반응을 실시하여 황색의 결정을 얻었다. Yield: 54% (210 mg), m.p: 197-

201,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.12 (2H, d, J=7.6 Hz, H-3,5), 7.44 (2H, d, J=7.6 Hz, H-2,6), 3.81 (2H, s, CH

CO) 3.61 (2H, s, CH

),

C NMR (100 MHz, CDCl

δ:

172.2 (C=O), 147.4, 143.3, 131.2, 124.1, 41.0 (CH

CO), 38.2 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 386 [M]

.

N,N'-(Propane-1,3-diyl)bis(2-(4-nitrophenyl)acetamide) (14a)- 4-Nitrophenylacetic acid (362 mg, 2 mmol)과 1,3-diaminopropane (74 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 같은 방법으로 반응을 실시하여 황색의 결정을 얻었다. Yield: 63% (250 mg), m.p: 128- 131

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.12 (2H, d, J=7.6 Hz, H-3,5), 7.44 (2H, d, J=7.6 Hz, H-2,6), 3.65 (2H, s, CH

CO), 3.47 (2H, t, J=6.0 Hz, CH

), 1.90 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C-NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 172.3 (C=O), 147.6, 144.2, 131.2, 124.0, 41.5 (CH

CO), 37.6 (CH

), 28.3 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 400 [M]

.

N,N'-(Butane-1,4-diyl)bis(2-(4-nitrophenyl)acetamide) (15a)-4- Nitrophenylacetic acid (362 mg, 2 mmol)과 1,4-diaminobutane (88 mg, 1 mmol) 을 사용하여 method A와 같은 방법으로 반응을 실시하여 미황색의 결정을 얻었다. Yield: 60% (250 mg), m.p:

221-224

C,

HNMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.14 (2H, d, J=7.2 Hz, H-3,5), 7.40 (2H, d, J=7.2 Hz, H-2,6), 3.65 (2H, s, CH

CO), 3.25 (2H, t, J=6.0 Hz, CH

), 1.56 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 172.3 (C=O), 147.7, 144.0, 131.2, 124.0, 41.3 (CH

CO), 38.3 (CH

), 27.4 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 414 [M]

.

N,N'-(Pentane-1,5-diyl)bis(2-(4-nitrophenyl)acetamide) (16a)- 4-Nitrophenylacetic acid (362 mg, 2 mmol)과 1,5-diaminopentane (102 mg, 1 mmol)을 사용하여 method A와 같은 방법으로 반응 을 실시하여 미황색의 결정을 얻었다. Yield: 65% (280 mg), m.p:

148-151

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 8.12 (2H, d, J=Hz, H-3,5), 7.44 (2H, d, J=Hz, H-2,6), 3.65 (2H, s, CH

CO), 3.21 (2H, q, J=6.0 Hz, CH

), 1.58 (2H, quint, J=6.4 Hz, CH

), 1.28 (2H, quint, J=6.4 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 172.3 (C=O), 147.6, 144.2, 131.2, 124.0, 41.0 (CH

CO), 39.0 (CH

), 28.9 (CH

), 23.0 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 428 [M]

.

화합물 13-16의 합성 방법- Method B: 화합물 13a-16a (0.5 mmol)을 ethanol (20-30 mL)에 용해시킨 후 NH

Cl (10 mmol) 과 Fe (1 mmol) 를 가하고 7-10시간 환류 교반시켰다. 반응혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 얼음물을 가하고 감압 농축하여 ethanol 을 제거하고 남은 수층을 dichloromethane (30 mL×3)으로 추출 하고 추출액을 무수 MgSO

로 건조시키고 여과하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하여 오일상 또는 고체상 물질을 얻고 이를 column chromatography (ethyl acetate:n-hexane=1:1 또는 1:3 그 리고 methanol:dichloromethane=1:9 또는 1:5)를 실시하여 백색 또 는 미백색의 순수한 결정을 얻었다.

N,N'-(Ethane-1,2-diyl)bis(2-(4-aminophenyl)acetamide) (13)-화

합물 13a를 출발물질로 사용하여 method B와 동일한 방법으로 반응시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 80% (130 mg), m.p: 185-188

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 6.91 (2H, d, J=7.6 Hz, H-3,5), 6.52 (2H, d, J=7.6 Hz, H-2,6), 3.41 (2H, s, CH

CO), 3.59 (2H, s, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO- d

) δ: 172.0 (C=O), 147.1, 131.0, 122.4, 114.2, 41.5 (CH

CO) 38.9 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 326 [M]

.

N,N'-(Propane-1,3-diyl)bis(2-(4-aminophenyl)acetamide) (14)- 화합물 14a를 출발물질로 사용하여 method B와 동일한 방법으 로 반응시켜 미백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 76% (130 mg), m.p: 154-157

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 6.88 (2H, d, J=7.4 Hz, H-3,5), 6.53 (2H, d, J=7.4 Hz, H-2,6), 3.38 (2H, s, CH

CO), 3.44 (2H, t, J=6.2 Hz, CH

), 1.92 (2H, t, J=6.8 Hz, CH

),

C-NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 172.2 (C=O), 147.0, 131.1, 122.4, 114.3, 40.3 (CH

CO), 37.4 (CH

), 27.5 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 340 [M]

.

N,N'-(Butane-1,4-diyl)bis(2-(4-aminophenyl)acetamide) (15)-화 합물 15a를 출발물질로 사용하여 method B와 동일한 방법으로 반응시켜 백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 70% (124 mg), m.p: 213-217

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 6.91 (2H, d, J=7.6 Hz, H-3,5), 6.54 (2H, d, J=7.6 Hz, H-2,6), 3.39 (2H, s, CH

CO), 3.46 (2H, t, J=6.4 Hz, CH

), 1.88 (2H, t, J=7.0 Hz, CH

),

C-NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 172.0 (C=O), 147.2, 131.0, 122.3, 114.2, 40.3 (CH

CO), 38.1 (CH

), 27.3 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 354 [M]

.

N,N'-(Pentane-1,5-diyl)bis(2-(4-aminophenyl)acetamide) (16)- 화합물 16a를 출발물질로 사용하여 method B와 동일한 방법으 로 반응시켜 미백색의 순수한 결정을 얻었다. Yield: 65% (120 mg), m.p: 233-237

C,

H NMR (400 MHz, DMSO-d

) δ: 6.87 (2H, d, J=7.6 Hz, H-3,5), 6.58 (2H, d, J=7.6 Hz, H-2,6), 3.42 (2H, s, CH

CO), 3.55 (2H, q, J=6.4 Hz, CH

), 1.51 (2H, quint, J=7.2 Hz, CH

), 1.25 (2H, quint, J=7.2 Hz, CH

),

C NMR (100 MHz, DMSO-d

) δ: 172.0 (C=O), 147.1, 131.2, 122.5, 114.2, 40.2 (CH

CO) 39.0 (CH

), 28.6 (CH

), 22.2 (CH

), GC-Mass (EI) m/z: 368 [M]

.

DNMT 1 저해활성

Human recombinant N-terminal GST-tagged DNMT1 enzyme (BPS bioscience, San Diego, CA, USA)은 baculovirus expres- sion system에서 Sf9 cell에서 발현시킨 것으로 40 mM Tris-HCl, pH 8.0. 110 mM NaCl, 2.2 mM KCl, 0.04% Tween-20 및 20% glycerol로 formulate 시킨 것을 사용하였다. DNMT 저해활 성 실험은 DNMT colorimetric inhibition assay kit (Abnova, CA, USA)를 사용하였으며 이 assay kit는 cytosine-rich DNA substrate가 strip-well에 안정적으로 코팅되어 있는 것으로 저해 활성 실험은 제시된 manufacture method와 Wang et al.

이 보고 한 방법을 이용하여 실시하였다. 20 μM S-(5-adenosyl)-

-methion- ine을 methyl donor로 사용하여 100 ng의 DNMT1 효소와 test compound 를 200 μM DMSO solution (2% DMSO)으로 제조하여 strip-well 에 가하고 37

C 에서 2 시간 배양시켰다. 배양액을 aspirate 시키고 wash buffer 150 μL로 세척한 후 capture antibody를 희석 (1:1000)하여 strip-well에 가하고 실온에서 30분 배양시켰다.

Aspirate 시키고 wash buffer 150 μL로 세척하고 enhancer solution (1:5,000) 50 μL을 가하고 실온에서 30분 배양시킨 후 세척하고 developing solution을 가하고 실온에서 2-10분 배양시켰다. 여기 에 stop solution 50 μL을 가하고 이를 96 well microplate에 transfer하고 450 nm에서 microplate reader로 absorbance를 측정하 였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

합성

3-치환 phenylacetic acid와 α,ω-diaminoalkane과의 dimer 합성 방법은 Scheme 1에 제시하였다. PsA의 disulfide 결합과 hydrox- yimino group을 보유하지 않는 구조를 가지면서 전체적인 구조 적인 크기를 고려하여 dimer 구조를 유지하는 화합물을 합성하 였다. 또한 4번 위치에 hydroxy기가 제거된 phenylacetic acid의 3번 위치에 치환기가 없거나 Cl 또는 Br이 치환된 α,ω-diami- noalkane의 CH

chain 길이가 2-5개를 가진 화합물을 저해활성 을 비교하기 위하여 합성하였다. 먼저 dimer의 합성은 acid유도 체를 acid chloride로 합성한 후 dimer유도체의 합성을 시도하였

Scheme 1. Dimer synthesis from 3-substituted phenylacetic acids and α,ω-diaminoalkanes.

으나 반응이 가지 않거나 수득률이 매우 낮았다. N-Hydroxysuc- cinimide (NHS)와 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 존재 하 에서 α,ω-diaminoalkane (NH

(CH

)

NH

, n=2-5)을 가하여 24-48 시간 coupling 반응시켜 치환기가 없는 유도체 1-4와 8종의 3-치 환 N,N'-(alkanediyl)bis(phenylacetamide)유도체 5-12을 합성하였다.

4-Nitrophenylacetic acid와 α,ω-diaminoalkane과의 dimer 합성 및 환원은 Scheme 2에 제시하였다. Procainamide의 4-amino group 을 가진 유도체 합성을 위하여 4-nitrophenylacetic acid를 출 발물질로 사용하여 Scheme 1과 같은 방법으로 α,ω-diaminoalkane (NH

(CH

)

NH

, n=2-5) 와 coupling 반응시켜 4종의 nitro amide dimer 13a-16a를 얻었다. 이를 NH

Cl/Fe조건에서 환원 반응시켜 N,N'-(alkanediyl)bis(4-aminophenylacetamide) 유도체 13-16을 얻었다.

DNMT1 저해활성

본 실험에서는 화합물 1-16의 200 μM 농도에서의 in vitro human DNMT 저해 효과에 대하여 screening 하였다. PsA 및 DMSO 를 양성 및 음성대조물질로 사용하였고 모든 화합물은 DMSO (2% 이내)에 용해시켜 SAM을 methyl donor로 사용하여 측정하였으며 그 결과를 Table 1에 제시하였다. 저해활성 결과 를 보면 α,ω-diaminoalkane (NH

(CH

)

NH

, n=2-5) chain 은 활성 을 유지하거나 개선시키는 것에 기여하지 않았지만, 길이에 따 른 저해활성 효과는 전반적으로 길이가 길수록 활성이 증가하 는 경향을 보였다. 3-치환 유도체는 bromo group이 chloro group 보다 좋은 효과를 나타냈으며 4-amino group이 치환되거나 치환 기가 없는 화합물은 저해활성이 낮았다. 합성된 화합물 중에는 N,N'-(pentane-1,5-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (12)가 91%

로서 DNMT 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. 그러나 모든 화합물은 in vitro 실험에서 PsA >100% (IC

: 18.6 nM)

보다 저해활성이 낮았다. 향후 합성 방법이 간단하므로 치환기 또는 linker 등의 modification으로 저해활성을 증가시킬 수 있는 좀 더 최적화된 구조를 찾아야 할 것으로 생각되었다.

결 론(Conclusion)

후성유전학(epigenetics)의 대표적인 항암제 개발 타겟 중의 하 나인 DNMT 저해제 개발을 위하여 phenylacetic acid과 3-chloro-, 3-bromo- 또는 4-amino-phenylacetic acid와 α,ω-diaminoalkanes (NH

(CH

)

NH

, n=2-5)와의 coupling 생성물인 16종의 N,N'- (alkanediyl)bis(phenylacetamide) 유도체를 합성하였다. 이들의 저 해활성을 screening한 결과 모든 화합물은 dimeric disulfide 화합 물인 PsA (>100%, (IC

:18.6 nM

))보다 저해활성이 낮았으며 N,N'-(pentane-1,5-diyl)bis(2-(3-bromophenyl)acetamide) (12, 91%) 가 가장 좋은 저해활성을 나타내었다.

Scheme 2. Dimerization and reduction from 4-nitrophenylacetic acid and α,ω-diaminoalkanes.

Table 1. The human DNMT inhibitory activities of synthesized compounds against DNMT1

Compound No. Inhibition %

Compound No. Inhibition %

DMSO 0 9 59±4.0

1 25 10 72±3.0

2 21 11 85±2.9

3 36 12 91±3.7

4 55±2.2 13 27

5 63±1.9 14 29

6 62±2.5 15 33

7 76±3.3 16 41

8 85±4.1 PsA

>100

a

All compounds were tested as 200 µM DMSO solutions against 100 ng of DNMT1 enzyme.

When inhibition was >50%, experiments were performed in triplicate, these data are reported as the mean±SEM.

p<0.05. Other values are single determination.

PsA: Psammaplin A

and is commercially available. Piña et. al reported that IC

value of

PsA was 18.6 nM in 2003.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 2016년 대구가톨릭대학교 연구년 중 수행한 것으 로 연구비 지원에 감사드립니다.

References

1. Berger, S. L., Kouzarides, T., Shiekhattar, R. and Shilatifard, A.:

An operational definition of epigenetics. Genes Dev. 23, 781 (2009).

2. Weber, M., Hellmann, I., Stadler, M. B., Ramos, L., Pääbo, S., Rebhan, M. and Schübeler, D.: Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat. Genet. 39, 457 (2007).

3. Chik, F., Szyf, M. and Rabbani, S. A.: Role of epigenetics in cancer initiation and progression. Adv. Exp. Med. Biol. 7 20, 91 (2011).

4. Yamanaka, M., Watanabe, M., Yamada, Y., Takagi, A., Murata, T.

and Takahashi, H.: Altered methylation of multiple genes in carcinogenesis of the prostate. Int. J. Cancer 106, 382 (2003).

5. Yoo, C. B. and Jones, D. A.: Epigenetic therapy of cancer: Past, present and future. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 37 (2006).

6. Yang, X., Lay, F., Han, H. and Jones, P. A.: Targeting DNA methylation for epigenetic therapy. Trends Pharmacol. Sci. 31, 536 (2010).

7. Stresman, C. and Lyko, F.: Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors, azacytidine and decitabine. Int. J.

Cancer 125, 8 (2008).

8. Christman, J. K.: 5-Azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine as inhibitor of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene 21, 5483 (2002).

9. Ben-Kasus, T., Ben-Zvi, Z., Marquez, V. E., Keller J. A. and Agbaria, R.: Metabolic activation of zebularine, a novel DNA methylation inhibitor, in human bladder carcinoma cells. Biochem.

Pharmacol. 70, 121 (2005).

10. Holleran, J. L., Parise, R. A., Joseph, E., Eiseman, J. L., Covey, J.

M., Glaze, E. R., Lyubimov, A. V., Chen, Y. F., D’Argenio, D. Z.

and Egorin, M. J.: Plasma pharmacokinetics, oral bioavailability, and interspecies scaling of the DNA methyltransferase inhibitor, zebularine. Clin. Cancer Res. 11, 3862 (2005).

11. Graça, I., Sousa, E. J., Baptista, T., Almeida, M., Ramalho- Carvalho J., Palmeira C., Henrique, R. and Jenonimo, C.: Anti- tumoral effect of the non-nucleoside DNMT inhibitor RG-108 in human prostate cancer cells. Curr. Pharm. Design 20, 1803 (2014).

12. Asgatay, S., Champion, C., Marloie, G., Drujon, T., Senamaud- Beaufort, C., Ceccaldi, A., Erdmann, A., Rajavelu, A., Schambel, P., Jeltsch, A., Lequin, O., Karoyan, P., Arimondo, P. B. and Guianvarc’h, D.: Synthesis and evaluation of analogues of N- phthaloyl-

-tryptophan (RG 108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. J. Med. Chem. 57, 421 (2013).

13. Yoo, J., Choi, S. and Medina-Franco, J. L.: Molecular modeling studies of the novel inhibitors of DNA methyltransferases SGI- 1027 and CBC12: Implications for the mechanism of inhibition of DNMTs. PLoS One 8, e62152 (2013).

14. Lee, B.H., Yeanasubramanian, S., Lin, K. H. and Nelson, W. G.:

Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1.

J. Biol. Chem. 280, 40749 (2005).

15. Halby, L. Champion, C., Sénamaud-Beaufort, C., Ajjan, S., Drujon, T., Rajavelu, A., Ceccaldi, A., Jurkowska, R., Lequin, O., Nelson, W. G., Guy, A., Jeltsch, A., Guianvarc’h, D., Ferroud, C.

and Arimondo, P. B.: Rapid synthesis of new DNMT inhibitors derivatives of procainamide. ChemBioChem. 13, 157 (2012).

16. Rodriguez, A. D., Akee, R. K. and Scheuer, P. J.: Two bromotyrosine-cysteine derived metabolites from a sponge.

Tetrahedron Lett. 28, 4989 (1987).

17. Quinoa, E. and Crews, P.: Phenolic constituents of Psammaplysilla.

Tetrahedron Lett. 28, 3229 (1987).

18. Hoshino, O., Marakata, M. and Yamada, K.: A convenient synthesis of a bromotyrosine derived metabolite psammaplin A, from psammaphysilla sp. Bioorg. Med. Chem. 2, 1561 (1992).

19. Kim, D., Lee, I. S., Jung, S. H., Lee, C. O. and Choi S.-M.:

Psammaplin A, a natural phenolic compound has inhibitory effect on human topoisomerase II and its cytotoxic to cancer cells.

Anticancer Res. 19, 4085 (1999).

20. Piña, I. C., Gautschi, J. T., Wang, G. Y. S., Sanders, M. L., Schmitz, F. J., France, D., Cornellennon, S., Sambucetti, L. C., Remiszewski, S. W., Perez, L. B., Bair, K. W. and Crews, P.:

Psammaplins from the sponge Pseudoceratina purpurea: inhibition of both histone deacetylase and DNA methyltransferase. J. Org.

Chem. 68, 3866 (2003).

21. Baud, M. G., Leiser, T., Petrucci, V., Gunaratnam, M., Neidle, S., Meyer-Almes, F. J. and Fuchter, M. J.: Thioester derivatives of the natural product psammaplin A as potent histone deacetylase inhibitors. Beilstein J. Org. Chem. 9, 81 (2013).

22. Gadat, A. M., Angelino, N., Wolszynska-Read, A., Morey, S. R., James, S. R., Karpf, A. R. and Sufrin, J. R.: An Improved synthesis of psammaplin A. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 3330 (2006).

23. Garcia, J., Franci, G., Pereira, R. Benedetti, R., Nebbios, A., Rodriguez-Barrios, F., Gronrmeyer, M., Altucci, L. and de Lera, A. R.: Epigenetic profiling of the antitumor natural product psammaplin A and its analogues. Bioorg. Med. Chem. 19, 3637 (2011).

24. Wen, J., Bao, Y., Niu, Q., Liu, J., Yang, J., Wang, W., Jiang, T., Fan, Y., Li, K., Wang, J., Jhao, L. and Liu, D.: Synthesis, biological evaluation and histone deacetylase inhibiting as cytotoxic agents. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 4372 (2016).

25. Wang, S.-C., Lee, T.-H., Hsu, C.-H., Chang, Y.-J., Chang, M.-S., Wang, Y.-C., Ho, Y.-S., Wen, W.-C., and Lin, R.-K.:

Antroquinonol D, isolated from Antrodia camphorata, with DNA

demethylation and anticancer potential. J. Agric. Food Chem. 62,

5625 (2014).