경희대학교 의과대학·의학전문대학원

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진단분자유전학

Prof. Hee Joo Lee Feb. 28, 2011

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제 7

부 유전 및 분자질환

• Chapter 84 진단분자유전학 서론 • Chapter 86-88 진단분자유전학 검사기법 • Chapter 91 단일 유전자 질환 • Chapter 92 다인자 질환의 유전 • Chapter 93 혈액 종양의 분자 유전학검사 • Chapter 95-97 감염성 질환의 분자병리

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역사

세계적으로 분자진단 검사가 시작 : 1980 년대 말 • 인간게놈 프로젝트가 완성 : 2003 년말 • 인간 30 억 bp, 2500 개의 유전자 • 검사기술의 발전 • 의의 : – 질병의 확진과 진단 – 질병의 위험도 진단 – 치료와 관련된 검사의 증가 – 임상상과의 관련성

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질환의 진단 – 유전질환 – 암 – 감염질환 • 진단 및 치료에 유용한 검사 – HLA typing

– Blood cell antigen typing – Forensic application

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용어

• Single nucleotide polymorphism (SNP) 단일 염기 변

이 or 단일염기다형성

– 단일염기에서 발생 , 대부분 치환 , 삽입 결손도 포함

• Variable number of tandem repeats (VNTR) 일렬

반복수변이 – 아홉개 내지 수십개의 반복 단위를 갖고 총 길이가 수백개의 염기에 이르는 minisatellite 를 의미 – microsatellite : 수개의 반복 단위를 갖고 총 길이가 길게는 100 개 이상의 염기에 이름 – 경우에 따라 minisatellite 와 microsatellite 를 모두 포함

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핵산추출

• DNA 추출

페놀 클로로포름추출법 : 액체상 추출법

– 고체상추출법 : 높은 재현성과 다량의 검체처리 , 자동화

– Chaotrophic salt 용액의 존재하에서 silica mat rix, glass fiber, magnetic bead 등과 가역적으 로 흡착되는 원리 이용

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• RNA 추출 – 불안정성 때문에 신선한 상태로 보존제의 신속한 첨가 , 액체 질소에 의한 급속 냉동 – RNase 에 의한 오염을 예방하여야 함 – RNA 가 제거된 세정제나 화학제 이용하여야 • 추출 핵산의 수율과 질의 평가 – 분광광도계를 이용하여 정량적으로 평가 – 260 nm 의 자외선을 최대한 흡수

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순도 260 nm 와 280 nm 의 흡광도 비 • 1.8 이상시 오염이 최소화

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핵산증폭검사

• 1985 Mullis KB 에 의해 개발 , 1993 노벨화학 상 • 열변성 , 시발체의 결합 , DNA 합성 • 200-500 bp 가 제일 효율적 • 구성성분주형 DNA, 시발체 , 열저항 DNA 중합효소 , dNTP – 위양성 , 위음성

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PCR Amplifies a Targeted Sequence Target Sequence DNA Strand Double Helix DNA Strand Supercoiled DNA Strand Chromosome

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Target Amplification

No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon

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Components

Mg2+ Mn2+ dCTP dGTP dUTP dATP

Taq DNA Polymerase

Primer

and OR and

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Geometric Plateau Linear Variability High precision

Classic PCR quantification

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CTM48

Automated

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HPV PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2: HPV(16, 18, 31, 33, 35, 52b, 58 ) Positive 3: HPV(16, 18) Positive 다중중합효소연쇄반응 (Multiplex PCR) 두개 이상의 원하는 산물을 증폭하 는 방법 대상수에 따른 시발체 추가

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• Long Distance PCR

증폭산물이 20-50 kb 에 달하는 PCR엄격한 실험기법 준수해야 함

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탐색자증폭법 (Probe amplification method technology)

• DNA 에 상보적인 구조를 가지는 탐색자를 사용하여 증폭반응을 일으키는 것

• 연결효소연쇄반응법 (Ligase chain reactio n, LCR)

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신호증폭법 (Signal amplification method)

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Hybridize RNA probe with tar get DNA

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잡종포획검사 (Hybrid capture assay)

포적 DNA 를 RNA 탐색자를 주입하여 교 잡반응 시키고 DNA-RNA 반응 산물을 RN A 항체를 이용하여 효소면역 반응판에 부착 시킨다 . 이어 효소가 결합된 많은 양의 항체 를 다시 주입하여 DNA 와 결합하고 발색 반 응을 일으켜 검출

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Amplification Technique Target Patent holder Manufac-turer

Target PCR* DNA Roche Roche

Ligase chain R(LCR)* DNA Abbott Abbott Transcription

medi-ated amplification (TMA)

RNA Gen-Probe Gen-Probe

Nucleic acid sequence based amplification (NASBA) RNA Organon Technica bioMerieux Strand displacement (SD) DNA BD BD

Probe Clevase/invader DNA Third wave

Signal Branched DNA(bDNA) DNA Chiron Bayer Hybrid capture DNA Digene Digene

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염기서열검사 (Sequencing)

• Dedeoxy chain termination 원리

• Dedeoxynucleotide triphosphates (ddNT Ps) 3’ OH group 이 없어 phosphodiester bond 가 형성되지 않기 때문에 두 염기가 이 어 지지 않게 된다 .

• Sanger 방식의 manual method 와 자동염 기순서검사

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Molecular pathology of Infectious Disease • 환자의 증상 및 병력을 명확히 파악하여 감염질환의 원 인으로서 가능한 미생물을 파악하는 것이 중요 • 미생물의 검출 • 유전형의 분류 • 정량검사 • 약제내성검사 • 미생물 동정 • 역학조사

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미생물의 검출 • 결핵균 : 성장이 느리므로 신속한 검사 필요 • 클라미디아 , 바이러스 : 특수 배지 필요 • 일반적으로 항체가 형성된 후에는 미생물이 제거되 므로 빠른 시간내 검체를 채취하는 것이 중요 ( 예외 , HCV, HIV) • CMV: 정상인의 소변에서도 배출될 수 있기 때문에 결과 해석에 임상 증상을 고려

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유전형의 분류

• Human papilloma virus

• 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 • 조기암진단

• HPV 는 항원을 거의 생성 안하므로 항체검사 가 어려움

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정량검사

• HCV, HIV : Viremia 정도로 치료효과 판정 • HCV: 인터페론의 효과 판정

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약제내성검사

결핵균 : rifampin 내성 유무 확인

– line probe assay

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역학조사

• 전염병의 집단발생이나 병원 감염의 원인 규명 • 염색체 DNA 를 제한 효소로 분해하고 탐식자 를 이용하여 Southern 재결합 ( 예 : 라이보타 이핑 ) • 제한효소로 분해한 염색체 DNA 를 pulsed fi eld gel electrophoresis

• PCR, Rep-PCR, random primed PCR • DNA 를 증폭한 후 염기배열 분석

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혈액종양의 분자진단

BCR/ABL 재배열

PML/RARa 재배열

AML1/ETO 재배열

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고형종양의 분자진단

• 유전성암 • 유전성 유방 난소 암 (BRCA1, 2)유전성 대장암 • 망막모세포증 • 다발성내분비선종 • 폰 히펠린다우 병

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단일 유전자 질환

• Thalassemia : ß-globin 유전자 돌연변이

• Cystic fibrosis : cystic fibrosis transmem brane conductance regulator 장애

• Duchenne’s muscular dystrophy : Dystr

ophin 유전자 장애

• Trinucleotide repeat expansion disorder

: 취약 X 증후군 , Huntington 병 , myot

onic dystrophy

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분자진단을 위한 생물정보학

(Bioinformatics)

유전질환 데이터베이스 • OMIM – http://www.ncbi.nih.gov/sites/entrez?db =omim • GeneReviews • http://www.geneclinics.org/proenfiles/al l.htlm

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• 유전자 / 유전체 / 단백질 서열 데이터베이스

미국국립보건원의 유전서열 데이터베이스 (Gen bank)

– 유럽분자생물연구소 (European molecular Biol ogy Laboratory, EMBL)

일본의 Data Bank of Japan

스위스 제네바 단백질 서열 데이터베이스 1986 Swiss-Prot

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• Genebank

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank

• Ensemble

http://www.ensemble.org/index.htlm

• UCSC Genome browser

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수치

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