추출 용매에 따른 예덕나무 수피 추출물의 항산화 및 항암 활성 연구
조 유 진*, 김 현 우*, 오 찬 진*, 오 득 실*, 김 진**,†
*전라남도 산림자원연구소
**,†광주보건대학교 간호학과
A Study of antioxidant and antitumor activity of Mallotus japonicus bark extracts with different solvents
Eugene Cho
*, Hyoun-Woo Kim
*, Chan-Jin Oh
*, Deuk-Sil Oh
*, Jin Kim
**,†*Jeollanam-do Forest Resource Research Institute, Naju 520-833, Korea
**,†Department of Nursing, Gwangju Health University, Gwangju 62287, Korea (Received : Apr. 25, 2020, Revised : May 28, 2020, Accepted : Jun. 20, 2020)
Abstract : Mallotus japonicus, belonging to Euphorbiaceae, has been known to possess various physiological activities such as anti-bacterial, anti-virus, and anti-inflammatory effects. This study was designed to investigate the anti-oxidative activity and anti-tumor effect of the Mallotus japonicus bark extracts with water and ethanol.
The amount of total polyphenolic compounds was measured using gallic acid as a standard material. The ethanol extract showed higher contents (143.6±1.57 mg GAE/g) than the water extract (120.4±6.11 mg GAE/g). Based on this result, a modified DPPH assay was conducted for the free radical scavenging activities of water and ethanol extracts. The ethanol extract revealed 80% free radical scavenging activity, compared with the 60% activity of water extract. To identify the qualitative and quantitative analyses of ethanol extract, LC/MS/MS method was applied to 15 standard materials. The result showed the highest contents of bergenin and the existence of other materials except resveratrol and oxyresveratrol. Cytotoxicity test was performed with MTT assay. Whereas the ethanol extract showed no cytotoxicity to 293T of a normal cell, the effects of ethanol extract on Fadu cell (head and neck carcinoma cells) appeared to be toxic in a 125-250 μg/mL range of concentrations. These results imply the value of developing anti-oxidant and anti-tumor agents using the ethanol extract of Mallotus japonicus bark.
Keyword : Mallotus japonicus, ethanol extract, anti-oxidant, anti-cancer
1. 서론
1)
의약화학의 발전에 의한 합성 의약품이 출현하기 훨 씬 이전부터 식물은 의학적인 용도로서 다양하게 사용 되어져 왔다. 식물의 껍질, 씨앗, 꽃, 뿌리와 같은 다 양한 부위들이 차 및 탕제와 같은 방식으로 오랜 시간 동안 음용되어져 왔고, 이에 따른 다양한 효능 또한 광범위하게 기록되어져 왔다. 최근에는 식물 부위별
†Corresponding author 성명 : 김 진
소속 : 광주보건대학교
주소 : 광주광역시 광산구 북문대로 419번길 73 전화 : 062-958-7620
E-mail : [email protected]
다양한 화합물들의 존재가 규명되고 있으며 이의 약 리학적 작용 및 그 기전 또한 상세히 밝혀지고 있다.
여러 화합물을 함유하고 있는 식물 부위는 항균, 항진 균, 항염증 및 항바이러스에서부터 불면증, 항불안, 우 울증 그리고 양극성 장애에 이르기까지 다양한 약리학 적인 효과를 보여주고 있다[1-7]. 또한 최근에는 건강 에 대한 관심이 증가하면서 예방적 차원에서 천연 식 물의 항산화효과에 많은 관심이 집중되고 있으며 이와 관련된 연구 또한 증가하는 추세이다[8-10]. 인체는 산소를 이용한 대사과정 중에 산화력이 높은 활성산소 종(reactive oxygen species)을 생성한다. 일반적으 로 활성산소종은 정상 신체 대사과정 중에도 생성되지 만 화학물질, 자외선 및 스트레스 등에 의해 그 생산 량이 증가되는 것으로 알려져 있다[11]. 활성산소는 산소 중심의 라디칼인 superoxide anion radical, peroxyl radical, hydroxyl radical과 비라디칼 종
인 hydrogen peroxide, singlet oxygen, hydroperoxide로 나누어진다[12]. 생체 내에서 이러 한 활성 산소가 과잉 생산된 경우 산화적 스트레스로 인해 지질의 과산화를 비롯하여 생체막, 단백질 그리 고 DNA에 손상을 가하게 되어 암, 노화 및 각종 성 인병을 유발하는 것으로 보고되고 있다[13]. 신체는 catalase, superoxide dismutase (SOD), glutathion peroxidase와 같은 활성 산소를 제거하 는 여러 효소적 방어기작을 가지고 있으나, 노화에 따 른 이러한 방어막 기능의 저하는 비 효소적 항 산화제 에 대한 관심을 증대시키고 있다[14]. 지금까지 이용 되어 온 비 효소적 합성 항 산화제에는 BHA, BHT가 있으나 이 화합물들의 경우 흡수된 후 발암성 및 독성 을 유발하는 것으로 알려져 있어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다[15]. 이러한 여러 문제들을 해결하기 위한 방법으로 식물 자원을 활용한 천연물 항 산화제 에 대한 연구에 관심이 집중되고 있다.
대극과(Euphorbiaceae) 식물들은 한랭지를 제외 한 전 세계에 분포하며 280속의 8000종이 알려져 있 으며, 특별히 열대지에 종류가 많다[16]. 예덕나무 (Mallotus japonicus)는 대극과 예덕나무속에 속하 는 낙엽 소교목이다. 높이가 10 m에 이르며 잎 모양 은 달걀모양이며 주로 3갈래로 갈라진 형태를 나타낸 다. 꽃은 단성화이며 6월에 피고, 열매는 세모꼴의 공 모양에 10월에 익는다. 전통의학에서는 예덕나무의 수 피를 적아백 또는 야오동의 명칭으로 불렀으며, 여기 에는 탄닌 성분이 많이 함유되어 있어 위산과다 및 위 궤양 그리고 십이지장궤양을 치료하는데 사용되었다 [17]. 대극과에 속하는 몇 가지 식물들의 항산화작용 이 보고되었다. Kamala tree 또는 red Kamala로 불리는 Mallotus philippinensis 식물의 과실과 수 피 추출물을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과 phenolic fraction에서 상당한 효과를 보임이 증명되 었다[18,19]. 또한 몇몇 연구에 따르면 예덕나무 잎 추출물 역시 강력한 항산화효과를 나타냄이 보고되었 다[20-22]. 이러한 여러 연구 결과에도 불구하고 의 학적 용도로 예전부터 많이 사용되어 온 껍질부분에 대한 연구는 아직까지 미흡한 실정이다. 이에 본 연구 에서는 용매 별 예덕나무 껍질 추출물을 이용하여 항 산화작용을 검증하고 LC/MS/MS를 통해 주요한 phenolic compounds의 함량 측정 및 두경부암 세포 에 대한 세포 독성을 살펴보고자 한다.
2. 실험방법 2.1 실험재료 및 시약
예덕나무는 보길도에서 채취한 후 불순물을 제거하고 수피를 벗겨 그늘진 곳에서 건조시킨 후에 사용하였다. 자유라디칼(free radical) 소거능 확인을 위한 DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, D9 132), 및 Folin–Ciocalteu‘s phenol reagent (F9 252), gallic acid (398225), protocatechuic acid (E24859), 4-hydroxy benzoic acid (H20059), vanillic acid (94770), rutin (R5143), ferulic a
cid (128708), naringenin (N5893), oxyresverat rol (91211), caffeic acid (C0625), syringic aci d (S6881), coumaric acid (C9008), benzoic aci d (242381), nicotinic acid (72309), resveratrol (R5010), bergenin (80479)등은 Sigma-aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다. Sodium carbo nate (7541-4405)는 Daejung (Gyeonggi-do, Ko rea), potassium acetate는 Duksan (Gyeonggi-d o, Korea)에서 구입하였고, 기타 사용되어진 각종 용매들은 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
2.2 추출방법
예덕나무 수피 10 g을 물 또는 식물성 에탄올을 이 용하여 70 ℃, 가열시간 5분, 반응시간 15분, 1순환 조건으로 Dionex™ ASE™ 350 Accelerated Solvent Extractor 기기로 추출하였다. 추출 후 즉 시 원심분리를 시행하여 침전물을 제거한 후 상층액을 취하였고, 이 상층액을 0.45 μm syringe filter를 이 용하여 여과하였다. 이후 여과액은 감압 농축하여 최 종 물 및 에탄올 추출물을 만들어 시료로 사용하였다.
2.3 Total polyphenolic compound 함량 측정 예덕나무 수피 물 추출물과 에탄올 추출물의 총 pol yphenolic 혼합물 함량은 약간 변형된 Folin-ciocalt eau 방법을 이용하여 측정하였다[23]. 검량선을 위한 표준물질로서 gallic acid를 선택하였고, 0, 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL로 희석하여 준비하였다. 96-well plated에 250 μg/mL농도의 시료용액 및 각 농도 별 gallic acid를 0.1 mL 씩 넣고 여기에 0.1 mL 0.0 4 N Folin-Ciocalteu’s reagent와 0.1 mL 1% Na
2CO3를 가한 후 암실에서 1시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 후 UV/VIS spectrophotometer (OAS YS UVM 340, biochrom, chambridge, England) 를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정된 흡광도 값들은 gallic acid 표준곡선으로부터 시료 별 총 polyphenol 화합물의 함량을 구하였고, g allic acid 상당량(GAE)으로 표시하였다.
2.4 Free radical 소거능 측정
반응성이 매우 크며 상당히 불안정한 free radical 에 대한 소거능을 확인하는 실험으로 변형된 Blois방 식의 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)법을 이용하였다[24]. 물과 에탄올 추출물을 각각 0, 250, 500, 1000 μg/mL로 준비하고 96-well plate에 0.1 mL씩 넣고 여기에 1 mM DPPH 0.1 mL을 가 한 후 실온, 암실 환경 하에서 30분간 반응을 시켰다.
이후 UV/VIS spectrophotometer (OASYS UVM 340, biochrom, chambridge, England)를 이용하 여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 넣지 않은 군을 대조군(control)로 하여 free radical 소거 능을 구하였다.
2.5 LC/MS/MS를 이용한 폴리페놀류 분석
예덕나무 수피 추출물에 함유된 polyphenolic com pounds를 정량적으로 분석해보기 위해, 대표적인 15 종의 polyphenol류에 대한 LC/MS/MS 분석을 시행 하였다. 정량 분석에 사용된 표준물질들은 bergenin, protocatechuic acid, 4-hydroxy benzoic acid, c affeic acid, syringic acid, vanillic acid, coumar ic acid, rutin, ferulic acid, oxyresveratrol, nari ngenin, resveratrol, benzoic acid, nicotinic aci d, gallic acid였다. 분석 물질의 정량 분석에는 LC/
MS/MS (AB SCIEX 4000 Q Trap LC/MS/MS System, Shimadzu LC 20A System, Japan)가 사용되었다. 분리에 사용된 컬럼은 Gemini 3 μm, C 18 110A 50 mm x 2.0 mm을 사용하였고, Colum n oven 온도는 40 ℃, autosampler의 온도는 15
℃로 하였다. 이동상은 gradient 방식으로, 0.1% 포 름산 용액(A)과 0.1% 포름산이 포함된 acetonitrile (B)가 사용되었다. 유속은 0.3 mL/min이고, 시료 주입량은 10 μL였다. 이동상은 B액을 0%에서 시작 하여 0.5분에 20%까지 증가시키고, 2분에 80%까지 증가시키고 2.5분까지 그대로 유지하다가 2.6분까지 20%로 다시 낮추고 6분까지 유지시켰다. MS/MS의 조건은 Turbo Ion Spray방식으로, 검출기 온도는 4 00 ℃, Negative mode로 spray voltage는 4500V 이고, 커튼가스(curtain gas)는 30 psi, Gas 1 그리 고 Gas 2 모두 50 psi였다.
2.6 세포배양 및 세포 독성 시험
각 추출물에 의한 세포 독성 시험을 위해 사람 배아 신장 세포주 293T와 두경부암세포주인 FaDu을 배양하였다. 293T 세포는 DMEM 배지를, 두경부암 세포주인 FaDu 세포는 MEM 배지를 사용하였고 각 배지에는 10% fetal bovine serum과 1% penicilli n/streptomycin을 첨가하였으며 37 ℃, 5% CO2
인큐베이터에서 배양하였다. 세포 독성 시험은 MTT 법을 이용하였다. 먼저 24-well plate에 1×105 개씩 세포를 분주하였고, 16시간 후에 각 추출물을 농도별 (0, 62.5, 125, 250 μg/mL)로 처리하여 24시간 후의 독성 반응을 확인하였다. 24시간 처리 후 MTT solution (5 mg/mL) 50 μL를 각 well에 가하고 4 시간 후에 상층액을 제거하였다. DMSO 300 μL를 넣어주고 난 뒤 30분간 암실에서 반응시키고, 생성된 formazan 용출 용액 100 μL를 96-well plate에 옮겨 570 nm에서 microplate reader (OASYS U VM 340, biochrom, chambridge, England)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
2.7 통계처리
본 실험의 결과들은 student’s t-검정:쌍체비교를 통해서 통계적 유의성을 검증하였고, 필요에 따라 평균±표준편차로 표현하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 Total polyphenolic compounds 함량
일반적으로 식물체 내에 있는 polyphenol 계열의 화합물들은 다양한 생리적 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데, 이는 주로 분자 내에 있는 phenolic hydroxyl group이 효소나 단백질과 같은 체내 거대 분자들과 결합할 수 있는 능력이 있기 때문으로 생각되고 있다[25]. 특히 항산화 활성은 phenolic hy droxyl group이 유리기의 수용체로서 free radical 들이 쉽게 결합하여 안정화됨으로써 나타나는 것으로 알려져 있다. 따라서 polyphenolic compound가 많다는 의미는 산화 억제 작용 즉 항산화 작용이 강하다는 것을 의미한다[26]. 예덕나무 수피의 물 추출물과 에탄올 추출물의 총 polyphenolic compou nd는 각각 120.4±6.11 mg GAE/g과 143.6±1.57 mg GAE/g을 나타내어, 에탄올 추출물이 물 추출물보다 더 많은 polyphenolic compound를 함유하고 있음을 보여주었다(Table 1). 이와 유사한 몇 가지 실험 결과를 살펴보면 예덕나무 잎을 메탄올로 추출하여 총 phenolic compounds를 측정한 결과 75.64 ±3.18 mg TAE (tannic acid)/
g 이 함유되어 있음이 보고되었다[20]. 또한 대극과의 식물 종 중의 하나인 Mallotus philippine nsis의 과실과 수피를 아세톤과 메탄올로 각각 추출하였을 때, 수피에서 총 phenolic compounds가 20배 가량 많은 것으로 밝혀졌다[19]. 이를 통해 예덕나무 각 부위 별로 총 polyphenolic compounds 의 함량이 다르다는 것을 유추할 수 있고, 유기 용매를 이용하는 추출이 물보다 추출수율에 더 큰 영향을 미치는 것을 짐작할 수 있다.
Table 1. Amount of total polyphenolic compounds in the water and ethanol extracts of Mallotus japonicus bark
Extract Water extract Ethanol extract Total polyphenol
(mg GAE/g dry
extract) 120.4±6.11 143.6±1.57
*The total polyphenolic compounds contents were expressed as mg of gallic acid equivalent per g-dry extract weight. The values are expressed as the means of three independent experiments ± the standard deviations.
3.2 Anti-oxidant activity
Free radical은 공유되지 않은 홑 전자를 가진 원자단을 의미하며 이는 결국 매우 큰 불안정성과 상당한 반응성을 나타낸다. 이러한 불안정성과 반응성으로 인해 free radical은 신체 내에서 DNA 및 단백질과의 결합을 나타내어 신체 구성 성분들에 손상을 일으켜 성인병이나 노화와 같은 질병의
원인으로 지목되고 있다. DPPH를 이용한 free radic al 소거능은 대표적인 항산화력 측정법이며 이는 보라색의 DPPH에 전자를 줌으로써 노란색의 물질로 변화시키는 것을 이용한 방식이다. 예덕나무 수피 물 추출물과 에탄올 추출물의 농도별 항산화능을 측정한 결과 250, 500, 1000 μg/mL에서 물 추출물은 62.
50±0.50%, 60.20±0.60%, 60.10±1.20%이었고, 에탄올 추출물은 75.20±7.00%, 80.60±0.80%, 82.
40±4.90%으로 나타났다. 비교물질인 BHA의 항산화능은 250, 500, 1000 μg/mL에서 66.30±0.5 0%, 67.20±1.20%, 69.10±1.20%을 보여주었다 (Fig. 1).
Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of the water and ethanol extracts of Mallotus japonicus bark and BHA. The
values are expressed as the means ± the standard deviations of three experiments. (*p < 0.01) 예덕나무 수피를 7일간 에탄올로 추출한 추출물을 이용한 실험 결과를 살펴보면 2%와 5% 희석 시료에서 각각 55%, 76%정도의 항산화력을
나타냄이 보고되었다[17]. Mallotus philippinensis 의 과실과 수피를 이용한 실험에서도 총 phenolic co mpounds 함량이 높은 수피에서 더 강한 항산화능이 나타남을 보고하였다[19]. 본 실험의 결과 추출물의 항산화력은 비교물질인 BHA보다 더 약한 것으로 나타났고, 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 훨씬 더 강력한 항산화력이 있음이 드러났다. 이러한 결과들은 식물 추출물의 총 phenolic compounds의 함량과 항산화력의 비례관계와 일치함을 보여주었다.
3.3 LC/MS/MS를 이용한 폴리페놀류 분석
예덕나무 수피 추출물에 대한 총 polyphenolic co mpounds 함량과 항산화능의 결과를 토대로 더 좋은 결과를 나타낸 에탄올 추출물에 함유된 polyphenolic compounds를 정량분석하였다. 총 15개의 표준물질 (Bergenin, protocatechuic acid, 4-hydroxy ben zoic acid, caffeic acid, syringic acid, vanillic a cid, coumaric acid, rutin, ferulic acid, oxyresv eratrol, naringenin, resveratrol, benzoic acid, nicotinic acid, gallic acid)에 대해 LC/MS/MS를 이용한 분석을 실시하였다.
Table 2. Quantitation of polyphenolic compounds in the ethanol extract of Mallotus japonicus bark with LC/MS/MS
Polyphenolic compounds
RT (retention time, min)
Concentration (ng/g of ethnaol extract)
Bergenin 1.1 145000
Protocatechuic acid 1.33 298.23 Gallic acid 1.17 1560 Nicotinic acid 1.04 136
Benzoic acid 3.3 83.2 resveratrol 3.49 N.D.
Naringein 3.69 0.686 Oxyresveratrol 3.28 N.D.
Ferulic acid 3.06 227
Rutin 3.05 400
Coumaric acid 2.7 309 Vanillic acid 1.87 107 Syringic acid 1.90 54.3 Caffeic acid 1.81 4.52 4-hydroxybenzoic acid 1.70 55.6
*N.D.: Not detected
에탄올 추출물(1 mg/mL)을 분석한 결과 bergeni n의 함량이 145 μg/mL로 가장 높았으며 gallic aci d, rutin, coumaric acid, protocatechuic acid, fe rulic acid, nicotinic acid, vanillic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, syringic acid, caff eic acid, naringenin 순이었고 resveratrol, oxyre sveratrol은 검량선 범위에 포함되지 않아 검출이 되지 않았다(Fig. 2, Table 2). Bergenin은 4-O-m
ethyl gallic acid의 C-glycoside로 분자량은 328.2 7 g/mol이다. Bergenin은 여러 식물에 함유되어 항산화, 항암 및 항말라리아 효과를 나타낸다[27-2 9]. 연구에 따르면 범의귀과(Saxifragaceae)에 속하는 식물인 노루오줌(Astilbe rubra) 전초를 5 0% 메탄올 추출 시 가장 높은 효율로 추출됨이 보고되었으며, 또한 킬리아타돌부채(bergenia ciliat e)에도 함유되어 있고 특히 땅속줄기(rhizoma) 부위에서 높은 함량을 나타냄이 보고되었다[30,31].
본 실험결과 일반적으로 알려진 바와 같이 예덕나무 수피에서 bergenin이 가장 많이 함유된 것으로 나타났으며, 이 외에도 다양한 polyphenolic compou nds가 존재함이 실험을 통해 증명되었다.
Fig. 2. The LC/MS/MS chromatogram of polyphenolic compounds existing in the ethanol extract of Mallotus japonicus bark. A) bergenin, B) gallic acid, C) nicotinic
acid, D) benzoic acid, E) resveratrol, F) naringenin, G) oxyresveratrol, H) ferulic acid, I) rutin, J) coumaric acid, K) vanillic acid, L) syringic acid, M) caffeic acid,
N) 4-hydroxybenzoic acid, O) protocatechuic acid.
3.4 세포 독성 시험
예덕나무 수피 에탄올 추출물이 가진 생리활성 중 항암효과를 알아보기 위해 MTT test를 실시하였다.
먼저 정상 세포에 대한 독성 시험을 인간 배아 신장 세포주인 293T 세포를 이용하여 조사하였다. 시험 결 과 에탄올 추출물 62.5, 125, 250 μg/mL 농도 모두 에서 세포 독성은 나타나지 않았다. 상기의 농도 범위 에서 암세포주에 대한 독성의 유무를 확인하기 위해 두경부암 세포주인 FaDu 세포를 이용하여 실험을 진 행하였다. 62.5 μg/mL농도에서는 FaDu 세포에 대 해 독성이 거의 없었으나, 125 μg/mL농도에서는 46%, 250 μg/mL에서는 34%로 생존율이 떨어짐을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 두경부암의 경우 수술적으 로 접근의 어려움과 수술 치료 후 재건 및 흉터와 같 은 외적인 요인에 의한 우울감 상승 그리고 화학요법 실시에 따른 수많은 부작용으로 인해 치료의 어려움을 겪는다. 정상세포에 독성이 없이 암세포주에 세포독성 을 나타내는 예덕나무 수피 추출물이 향후 두경부암세 포 치료 시 좋은 대안이 될 수 있을 것으로 사료된다.
Fig. 3. Cytotoxic activities of the ethanol extract of Mallotus japonicus bark on human 293T cells and FaDu
cell for 24 h. The values are expressed as the means ± the standard deviations of triplicate independent tests. (*p <
0.01) 4. 결론
본 연구에서는 대극과에 속하는 예덕나무의 수피의 추출물들을 이용하여 이들의 total polyphenolic compounds 함량, 항산화 활성, LC/MS/MS를 통한 polyphenolic compounds 분석 그리고 세포독성을 살펴보았다. 물과 에탄올을 이용한 두 가지 추출물 중 에 에탄올 추출물이 물 추출물보다 total polyphenolic compounds 함량이 높았으며 이에 따 라 항산화활성 또한 높은 양상을 보였다. 에탄올 추출 물을 대상으로 LC/MS/MS를 이용한 15가지 표준물 질 함량을 조사한 결과 bergenin의 함량이 가장 높았 고, 2가지 물질을 제외한 나머지 물질들이 모두 함유 되어 있음이 밝혀졌다. 세포 독성 시험의 결과 정상 세포주에 대한 에탄올 추출물의 독성은 250 μg/mL농 도까지 발견되지 않았고 두경부암 세포주인 FaDu 세 포의 경우에는 생존율이 34%까지 감소함을 볼 수 있 었다.
감사
이 논문은 2017년도 광주보건대학교 교내연구비의 지원을 받아 수행된 연구임 (No. 3017029).
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