명월초 발효물의 항산화 활성과 Tyrosinase 저해 활성 배단비

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명월초 발효물의 항산화 활성과 Tyrosinase 저해 활성

배단비․김경희․육홍선 충남대학교 식품영양학과

Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Activities of Fermented Gynura procumbens

Dan-Bi Bae, Kyoung-Hee Kim, and Hong-Sun Yook Department of Food and Nutrition, Chungnam National University

ABSTRACT This study investigated total phenol and flavonoid contents, antioxidant activities, and tyrosinase in- hibitory activities of Gynura procumbens fermented with various useful microorganisms (BS: Bacillus subtilis, LP:

Lactobacillus plantarum, LC: Lactobacillus casei, CU: Candida utilis, S1: Saccharomyces cerevisiae strain ZP541, S2: S. cerevisiae strain CHY1011). The yields of fermented G. procumbens by BS, LP, LC, CU, S1, and S2 were 18.12%, 14.31%, 14.52%, 14.15%, 13.37%, and 14.08%, respectively. The total polyphenol contents were 9.97∼18.74 mg gallic acid equivalents/g, with the highest content in the group fermented by LC. The flavonoid contents were the highest in the group fermented by LP (1.69 mg catechin equivalents/g). For the antioxidant activity experiment based on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging activities, IC50 values of LC were 1.03 mg/mL and 2.01 mg/mL, respectively. The ferric reducing antioxidant power value (5 mg/mL) was highest in the group fermented by LC (139.40 mM/g). Evaluation of tyrosinase inhibition activity revealed values of 22.32 to 67.39% at 30 mg/mL, with the fermented group by LC showing the highest value. In conclusion, fermentation of G. procumbens using L. casei increases antioxidant activity and inhibition of tyrosinase, which shows it can be developed for use in functional foods and cosmetics.

Key words: Gynura procumbens, antioxidant, fermentation, tyrosinase

Received 13 August 2019; Accepted 24 September 2019 Corresponding author: Hong-Sun Yook, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-42-821-6840

Author information: Dan-Bi Bae (Graduate student), Kyoung-Hee Kim (Researcher), Hong-Sun Yook (Professor)

서 론

최근 새로운 건강기능성 재료를 개발하기 위한 방법의 하 나로 발효(fermentation)에 대한 관심이 증가하고 있으며, 발효를 이용한 생물학적인 전환방법이 산업체에 널리 사용 되고 있다(Kim 등, 1994). 발효는 식품이나 식품원료에 자 연적으로 존재하거나 인공적으로 첨가된 유산균, 효모, 바실 러스, 곰팡이 등의 유익한 미생물을 활용하여 천연물이 가진 성분이나 소재 자체의 활용성을 증진시키는 방법으로서 미 생물들이 식품에서 증식하면서 분비하는 각종 효소들에 의 해 식품성분에 변화가 일어나고 그 결과 맛이나 풍미 등을 증진시킨다. 또한 발효과정을 거치게 되면 다당체, 올리고 당, 사포닌, 아미노산, 펩타이드, 피틴산 등의 유용성분이 증가하거나 상호 간의 시너지 작용에 의해 생리활성 효능이 상승, 흡수율 증가, 잔류농약의 감소 또는 제거, 유용한 장내

미생물의 증가 등 다양한 이점을 지니고 있어 의약품이나 식음료 등 다양한 분야에서 오랜 기간 동안 사용 및 발전되 어 왔다(Yang 등, 2007; Cabras와 Angioni, 2000).

천연물 발효에 의한 성분 변화 중 플라보노이드의 경우 미생물과 당 분해 효소가 발효 및 자가 분해 과정을 통하여 배당체 형태의 플라보노이드가 비당체 형태로 전환되거나 또는 미생물의 2차 대사과정을 통하여 새로운 형태의 물질 로 전환되었다는 연구(Day 등, 1998) 및 당유자 과피 발효 물의 플라보노이드 성분 변화 및 항산화 활성 평가 결과, 효모를 통한 발효과정 중에 플라보노이드 성분이 다른 형태 로 전환되었으며, 이러한 성분들이 라디칼 소거 활성 등의 항산화 활성을 크게 증가시켰다는 연구(Hyon 등, 2009) 등 이 있다. 미생물별 천연물 발효 연구에는 Bacillus subtilis 균주를 이용한 뽕잎 발효연구에서 뽕잎 발효과정 중 성분 변화와 단백질의 변화, 항산화 활성을 측정한 결과, 발효에 의해 alanine, isoleucine, leucine, valine의 함량이 3배 이 상 증가하고 항산화 활성이 증가하였으며, 이러한 항산화 활성 증가는 단백질 분해로 인해 만들어지는 저분자 펩티드 의 생성에 의한 것이라는 연구가 있으며(Seo 등, 2017), Candida utilis의 경우 주로 사과박의 생물전환에 사용되어 단백질 수준이 높은 사료 생산에 이용되고 있다(Joshi 등,

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2000). Saccharomyces cerevisiae의 경우 수 세기 동안 음식과 주류생산에 이용되어 왔으며 오늘날에도 에탄올, 젖 산, xylitol 생산에 이용되고 있다. 유산균은 항산화, 면역 작용 및 미백 작용 등의 다양한 생리활성이 보고되어 있으 며, 부추 당침액의 유산균 발효산물이 항균 활성, 항산화 활 성과 ACE 저해 활성 등 우수한 생리활성 효과를 나타내었다 는 연구(Lee 등, 2014), 황금 유산균 발효물의 항산화 및 미백 효과 증진 연구(Um 등, 2017), 유산균을 이용한 보리 의 발효를 통한 항산화 및 미백 효과 연구(Lee 등, 2018) 등 다양한 연구 등이 보고되어 있다. 이렇게 다양한 식물들 은 발효에 의해 건강 및 식품 분야에서 상당한 응용성을 가 진 생물활성 물질들을 생산하고 있는데 이러한 화합물들은 flavonoids, phenolic acids, lignans, sallicylates, stanols, sterols, glucosinolates 등을 포함하며, 이들 화합물 중에 서 항산화 활성과 식물의 총 페놀 함량 사이의 강한 상관관 계가 관찰되었으며, 이는 페놀 화합물이 항산화 능력의 중요 원인이 될 수 있음을 제시하고 있다(Li 등, 2008). 따라서 천연물의 발효에 의한 성분 및 생리활성 변화에 대한 다양한 연구가 진행되어 암과 당뇨병 감소, 심혈관 질환의 위험 인 자 감소, 항산화, 항돌연변이성, 항알레르기성, 항염증 및 항미생물 효과 등의 인간의 건강에 도움이 되는 능력을 증진 시키는 생물활성 물질들에 대한 연구가 확대되고 있다(Mar- tins 등, 2011).

명월초(Gynura procumbens(Lour.) Merr.)는 국화과 (Compositae)에 속하는 식물로서 인도네시아, 태국, 말레 이시아 같은 동남아 전역에서 사용되는 중요한 약용식물로 인도네시아와 베트남에서는 신장 질환과 발열 치료를 완화 하는 데 널리 사용된다(Wiart, 2002). 일본과 중국에서는 노화방지 및 혈전 용해 효과를 지닌 장수식품으로도 여겨지 며 실내 공기 정화 효과가 있으며, 해독 작용도 뛰어나 숙취 해소에도 좋고, 피부 미백에도 효과가 있으며, 아삭거리는 식감과 향이 뛰어나 쌈채소로도 큰 인기를 얻고 있다(Kim, 2018). 명월초의 주요 성분은 kaempferol, quercetin, myricetin, rutin, astragalin, α-tocopherol, δ-tocotrienol 등 으로 항산화 효과뿐만 아니라 당뇨병, 고혈압, 항알레르기, 항암 등에 효과가 있다고 알려져 있다(Tan 등, 2016). 명월 초에 대해서는 다양한 연구가 진행되어 있어 항산화 활성 (Kim 등, 2015), 화장품과 식품의 소재로서의 기능성 평가 연구(Jeon과 Kwon, 2014), 명월초 추출물의 항염 효과에 대한 연구(Jeon과 Kwon, 2016) 등이 있으나 발효 명월초에 대한 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 생리활성 물질 함량이 높은 명월초 의 이용가치를 증진시키기 위한 연구의 일환으로 여러 유용 미생물을 이용하여 명월초를 발효시킨 후 명월초 발효물의 항산화 활성 변화를 조사하여 향후 새로운 식품 소재 및 기 능성 소재로써의 개발 가능성을 탐색하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

실험에 사용된 명월초는 대구 (주)미산약초농장에서 구입 하여 사용하였다. 명월초 발효물의 제조는 20 g의 glucose (Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)와 5 g의 pep- tone(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)을 1 L의 증류 수(DW)에 넣은 후 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하 여 실온에서 서서히 식힌 다음 미리 활성화한 6종의 발효 균주를 각각 10 mL씩 넣은 후 음건한 명월초 100 g을 넣고, B. subtilis, C. utilis, S. cerevisiae는 30°C, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei는 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 여과지(Whatman No.4, What- man International, Maidstone, UK)로 여과시킨 여액을 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균시켰다. 멸균된 배양 액을 동결건조기(FD8518, Ilshin Lab Co., Ltd., Dongdu- cheon, Korea)에 넣고 동결 건조하였다. 비발효 대조군으 로 명월초 100 g당 10배량(w/v)의 DW로 24시간 동안 3회 추출한 후 여과지(Whatman No. 4)로 여과한 다음 동결 건조 하여 얻은 명월초 추출물(이하 비발효 추출물)을 사용하였 다. 각 시료는 50% 에탄올에 용해하여 실험에 사용하였다.

사용균주

발효에 사용된 균주는 Bacillus subtilis KCTC 1022(BS), Lactobacillus casei KCTC 2180(LC), Lactobacillus plantarum KCTC 3104(LP), Candida utilis KCCM 50342 (CU)로 생물자원센터(Korean Collection for Type Cul- ture, Daejeon, Korea)와 한국미생물보존센터(Korean Cul- ture Center of Microorganisms, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였으며, S. cerevisiae 균주들[S. cerevisiae strain CHY1011(S1), S. cerevisiae strain ZP 541(S2)]은 빵 효모균으로, 18S rRNA 서열의 유사성에 근거하여 가장 가까운 종을 표시하였다. BS는 Nutrient broth(BD Diag- nostic Systems, Sparks, MD, USA)에서, LC와 LP는 Lactobacilli MRS broth(BD Diagnostic Systems)에서, CU, S1, S2는 YM broth(BD Diagnostic Systems)에서 배 양하였다. BS, CU, S1, S2는 30°C, LC, LP는 37°C에서 24시간 주기로 3회 계대 배양 후 600 nm의 spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 측정하여 흡광도 값이 0.4~0.6(1×10⁵CFU/mL) 범위 안에 들게 한 후 발효 균주로 사용하였다.

사용균주에 따른 명월초 발효액의 배양 특성

균주의 성장에 따른 배양액의 pH의 변화는 24시간 배양 후 여과지(Whatman No. 4)에 여과한 다음 pH meter (Neomet pH 200L, Istek Co., Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 혼탁도 측정은 24시간 배양 후 여과된 발효액을 600 nm에서 흡광도를 측정(xMark^TM Microplate Absorb-

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ance Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc., Seoul, Korea)하여 미생물의 발효 정도를 확인하였다. 생균 수 측정은 24시간 배양한 명월초 발효액을 여과하여 멸균된 생리식염수에 희석해 측정하였다. 발효 희석액을 충분히 혼 합한 후 plate count agar(PCA) 및 potato dextrose agar (PDA) 배지에 분주한 다음 각각 37°C, 30°C에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였으며, 모든 실험구는 4회 반복 하였다.

총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법에 따라 측정하였다. 50% 에탄올에 용해하여 희석한 시료 0.2 mL에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 증류수를 1:2로 섞은 혼합액 0.2 mL를 첨가하여 3분간 방치한 후 10% sodium carbonate (Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Pyeongtaek, Korea) 3 mL를 가하여 1시간 동안 암실에서 반응시킨 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀의 함량은 표준 물질을 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)로 하여 얻은 표준 곡선의 검량식에 흡광도를 적용하여 구하였으며, 시료 1 g 에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 참 고하여 측정하였다. 50% 에탄올에 용해하여 희석한 시료 250 μL에 증류수 1 mL와 5% sodium nitrite(NaNO₂,w/v, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 75 μL를 넣고 5분간 방치한 후 10% aluminium chloride(AlCl₃･6H₂O, w/v, Junsei Chemical Co., Ltd.) 150 μL를 넣고 6분간 방치하였 다. 그다음 1 M sodium hydroxide(NaOH, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 500 μL를 가하여 11분 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질을 catechin(Daejung Chem- icals & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)으로 하여 얻은 표준곡선의 검량식에 흡광도를 적용하여 구했으며, 시료 1 g에 대한 mg catechin(CE)으로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활 성은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 50% 에 탄올에 용해하여 희석한 시료 1 mL에 0.2 mM DPPH 용액 1 mL를 가하여 vortex mixer(Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, USA)로 10초간 진탕하고 암소에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 시 료 무첨가구는 시료를 처리하지 않고 시료 희석 용매인 50%

에탄올을 첨가한 것으로 하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하였다. 양성대조군은 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)로 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활 성은 아래의 식에 따라 백분율로 나타낸 후 50%의 소거능을

나타내는 시료 농도인 IC₅₀(inhibitory concentration of 50%) 값을 구하였다.

DPPH radical scavenging activity (%)＝

(

^1－ Sample absorbance

)

^×100

Control absorbance

ABTS 라디칼 소거 활성

ABTS[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid)](Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거 활성은 Pellegrini 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. 140 mM potassium persulfate(K2S2O8, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)88 μL를 증류수 5 mL에 가해 혼합 시약을 제조한 후 이 시약에 ABTS diammonium salt tablet(Sigma-Al- drich Co.) 2알을 넣어 7 mM ABTS 수용액을 만들어 어두 운 곳에 14~16시간 방치시킨 다음, 이를 absolute ethanol 과 1:88의 비율로 섞어 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 조절한 ABTS solution을 시약으로 사 용하였다. 50% 에탄올에 용해하여 희석한 시료 50 μL를 취하고 ABTS solution 1 mL를 가해 10초 동안 vortex mixer(Scientific Industries, Inc.)로 섞은 후 2.5분간 암실 에서 반응시켜 734 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다.

시료 무첨가구는 시료를 처리하지 않고 시료 희석 용매인 50% 에탄올을 첨가한 것으로 하여 위와 같은 방법으로 흡광 도를 측정하였다. 양성 대조군은 ascorbic acid를 사용하였 다. ABTS 라디칼 소거 활성은 아래의 식에 따라 백분율로 나타낸 후 50%의 소거능을 나타내는 시료 농도인 IC50 값을 구하였다.

ABTS radical scavenging activity (%)＝

(

^1－ Sample absorbance

)

^×100

Control absorbance

FRAP 측정

FRAP(ferric reducing antioxidant power) assay는 Benzie와 Strain(1996)의 방법에 준하여 측정하였다. 시약 은 0.3 M acetate buffer(pH 3.6, Sigma-Aldrich Co.)와 40 mM HCl(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)을 용매로 하여 제조한 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.) solution, 20 mM ferric chloridesol- ution(FeCl₃,Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)을 사용하 였다. 미리 제조된 acetate buffer, TPTZ solution 및 ferric chloride solution을 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합 하여 37°C에서 10분간 incubation 시켜 FRAP reagent를 준비하였다. 그다음 50% 에탄올에 용해하여 희석한 시료 30 μL에 FRAP reagent 900 μL와 증류수 90 μL를 가하여 vortex mixer(Scientific Industries, Inc.)로 혼합한 후 37°C에서 10분간 방치한 다음 593 nm에서 흡광도를 측정 하였다. FRAP value는 표준물질을 iron sulfate hexahy- drate(FeSO4･6H2O, Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)

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Table 1. pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of Gynura procumbens fermented by microorganism Microorganism¹⁾ pH Turbidity²⁾ Viable cell count (log CFU/mL)

BS LC LP CU S1 S2

5.56±0.02^a3)4) 3.84±0.01^c 3.69±0.06^d 4.11±0.01^b 4.14±0.01^b 4.12±0.01^b

1.35±0.00^b 1.28±0.00^d 1.40±0.00^a 1.15±0.00^f 1.27±0.00^e 1.34±0.00^c

6.92±0.06^a 6.64±0.01^b 5.38±0.16^d 6.56±0.00^b 6.53±0.25^b 6.05±0.21^c

1)Control: non-fermented G. procumbens, BS: Bacillus subtilis, LC: Lactobacillus casei, LP: Lactobacillus plantarum, CU: Candida utilis, S1: Saccharomyces cerevisiae strain CHY1011, S2: S. cerevisiae strain ZP 541.

2)Turbidity measurement based on OD600 in the broth of G. procumbens fermented by microorganism.

3)Mean±SD (n=4).

4)Different letters within a column differ significantly (P<0.05).

로 하여 얻은 standard curve의 검량식에 흡광도를 적용하 여 구했으며, 시료 1 g에 들어있는 iron sulfate hexahy- drate의 mM 함량으로 나타내었다.

Tyrosinase 저해능 측정

Tyrosinase 저해능은 tyrosinase의 작용 결과 생성되는 dopachrome을 비색법을 이용하여 측정하였다(Flurkey, 1991). 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5 mL, 시료 0.2 mL, 기질 10 mM L-DOPA(dihydroxyphen- ylalanine, Sigma-Aldrich Co.) 0.2 mL를 넣고 혼합한 혼합 액에 효소액(mushroom tyrosinase, 100 unit/mL, Sigma- Aldrich CO.)을 0.1 mL를 첨가하여 37°C에서 15분 동안 반응시켜 475 nm에서 측정(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 하고 dopachrome의 변화를 저해능으로 환산하였다. 양성 대조군은 kojic acid를 사용하였다. Tyrosinase 저해능은 다음의 식에 의하여 계산되었다.

Tyrosinase inhibition

ability (%) ＝

(

^1－ ^A－B_C

)

^×100

A: Absorbance at 475 nm determined with sample B: Absorbance at 475 nm determined with buffer

instead of enzyme

C: Absorbance at 475 nm determined with buffer instead of sample

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 실시한 후 그 평균값으로 나타 내었으며, 얻어진 결과는 SPSS 22.0(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사 용하여 분산분석을 실시하였다. 유의성이 있는 항목에 대해 서는 Duncan’s multiple range test로 P<0.05 수준에서 유 의차 검정을 실시하였다.

결과 및 고찰

사용균주에 따른 명월초 발효액의 배양성 결과

명월초의 발효 정도를 확인하기 위해 24시간 발효시킨

명월초 발효액의 배양성 결과를 Table 1에 나타내었다. 발 효하지 않은 배지의 pH는 7.49(data not shown)인 반면, 발효시킨 배지에서는 3.69~5.56으로 낮아져 모든 실험군 에서 발효가 일어났음을 확인하였다. BS 균주를 이용한 발 효군에서 5.56으로 가장 높은 pH 값을 보였으며, S1(4.14), S2(4.12), CU(4.11), LC(3.84), LP(3.69)의 순서로 낮은 pH값을 보였다. 보통 BS를 이용한 발효의 경우 다른 미생물 을 이용한 경우보다 pH 변화가 적은 편인데(Kim 등, 2013), 본 연구에서도 BS가 가장 영향을 적게 주는 것을 확인하였 다. Han(2005)은 연구에서 미생물을 이용한 발효 과정에서 다양한 아미노산 및 유기산의 생성으로 인해 주요 대사물질 인 젖산을 포함하는 유기산을 생산하고, 생성된 유기산은 발효물에 영향을 주어 발효군들의 pH가 낮아진 것으로 보고 하였다. 발효 후 미생물 생장에 의한 혼탁도 및 생균수 분석 결과(Table 1), 명월초 발효물의 혼탁도는 1.15~1.40, 생균 수는 5.38~6.92 log CFU/mL로 나타나 균주의 특성에 따라 차이는 보이지만 전반적으로 발효가 잘 진행되었음을 확인 하였다.

명월초 발효물의 수율

여러 유용미생물로 발효시킨 명월초 발효물의 수율은 Table 2에 나타내었다. 대조군에 비해 발효군에서 수율에 증가하였고, 발효물 중에서는 BS 발효군에서 18.12%로 가 장 높게 나타났으며, LC(14.52%), LP(14.31%), CU(14.15

%), S2(14.08%), S1(13.47%) 순으로 나타났다. 이는 Kim 등(2012)의 6종의 단일균주 및 혼합균주를 이용하여 발효 시킨 포도박 발효물에 대한 연구에서 대조군에 비해 발효물 의 수율이 증가하였다는 결과와 유사한 결과이다. 가장 높은 수율을 나타낸 BS 발효군이 명월초 발효액의 배양성 결과에 서도 높은 생균수 함량을 나타낸 것으로 볼 때 발효 시 사용 된 균주의 생육정도가 발효물의 수율 증가와 관련이 있을 것으로 생각되나, 이외에도 발효 시 사용된 균주가 생산하는 다양한 효소에 의한 효소작용의 차이도 발효물의 수율에 영 향을 나타낸 것으로 판단된다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

균주별로 발효한 명월초의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결

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Table 2. The yield of fermented Gynura procumbens by various microorganism

Microorganism¹⁾ Yield (%) Control

BS LC LP CU S1 S2

6.82±0.42^c2)3) 18.12±5.54â 14.52±0.30âb 14.31±0.80âb 14.15±0.98âb 13.47±0.63^b 14.08±0.91âb

1)Abbreviations: See the Table 1.

2)Mean±SD (n=3).

Table 3. Total polyphenol and flavonoid contents of fermented Gynura procumbens by various microorganism

Microorganism¹⁾ Total polyphenol

(mg GAE²⁾/g) Total flavonoid (mg CE³⁾/g) Control

BS LC LP CU S1 S2

9.97±0.05^f4)5) 15.14±0.16^c 18.74±0.02â 15.93±0.08^b 11.80±0.84ê 13.83±0.54^d 11.83±0.14ê

0.91±0.02^f 1.03±0.00^e 1.25±0.03^b 1.69±0.03^a 1.20±0.00^c 1.21±0.05^c 1.11±0.00^d

2)GAE: gallic acid equivalents.

3)CE: catechin equivalents.

4)Mean±SD (n=3).

과는 Table 3에 나타내었다. 대조군은 9.97 mg GAE/g으로 가장 낮은 값을 보였으며, 발효균주 중에서는 LC가 18.74 mg GAE/g으로 가장 높은 값을 나타내었고 LP(15.93 mg GAE/g), BS(15.14 mg GAE/g), S1(13.83 mg GAE/g), S2 (11.83 mg GAE/g), CU(11.80 mg GAE/g) 순으로 함량이 낮아졌다. Kang 등(2011)은 연구에서 꾸지뽕 추출물과 꾸 지뽕 발효물에서 각각 8.13, 9.53 mg/mL로 발효에 의해 페놀 함량이 증가하였음을 보고하였으며, Lee 등(2009)은 B. subtilis 균주로 24시간 발효시킨 탈지대두 발효물의 총 폴리페놀 함량이 발효시키기 전에 비하여 증가하였다고 보 고하였고, 유산균을 이용한 어성초 연구(Kim 등, 2016)에서 도 유산균 발효에 의해 폴리페놀 함량이 증가하였다고 보고 하였다. 발효에 의해 페놀 성분이 증가하는 것은 발효 미생 물에 의해 생성되는 protease, amylase, lipase 등의 효소 로 생성되는 페놀 화합물 때문인 것으로 판단되며(Park 등, 2012), 명월초의 페놀 화합물은 gallic acid, protocatechuic acid, vanillic acid, syringic acid, chlorogenic acid, caf- feic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, sinapic acid 등 이 보고되어 있다(Kaewseejan과 Siriamornpun, 2015). 본 연구에서는 다른 균주에 비해 유산균 발효에 의한 페놀 화합 물의 함량이 증가하였는데 유산균 발효에 의해 생성된 효소 가 식물 세포벽 기질을 붕괴시켜 페놀 화합물 추출을 촉진시 키고 글리코실화된 형태를 활성형의 아글리콘으로 전환시 켜 나타난 결과로 여겨지며, 이러한 배당체의 비배당화 활성 은 유산균의 종류에 따라 다양하며, 유산균들이 생산하는 β-glucosidase, decarboxylase, esterase 등의 효소 활성 과 밀접한 관련이 있다고 보고된 바 있다(Hur 등, 2014;

Chien 등, 2006).

플라보노이드는 넓은 의미에서 anthoxanthin, antho- cyanin, catechin, lecoxanthin 등이 포함되며 항산화 및 자유 라디칼 소거 활성을 비롯한 항염, 항암, 항바이러스, 콜레스테롤 저하, 지방간 억제 등의 다양한 생리활성을 나타 내는 것으로 보고되었다(Noh, 2002). 명월초의 플라보노이 드는 rutin, myricetin, quercetin, apigenin, kaempferol 등이 보고되어 있다(Kaewseejan과 Siriamornpun, 2015).

균주별로 발효한 명월초의 총 플라보노이드 함량을 측정한

결과는 Table 3과 같다. 대조군은 0.91 mg CE/g으로 가장 낮은 값을 보였으며, 발효균주 중에서는 LP가 1.69 mg CE/

g으로 가장 큰 값을 가졌고 다음으로 LC(1.25 mg CE/g), S1(1.21 mg CE/g), CU(1.20 mg CE/g), S2(1.11 mg CE/

g), BS(1.03 mg CE/g) 순으로 함량이 낮아졌다. 비발효군 인 대조군에 비해 발효군의 플라보노이드 함량이 증가한 것 은 발효과정에서 식물조직의 세포벽 성분과 결합되어 있던 배당체 형태의 플라보노이드가 가수분해되어 활성형의 아 글리콘 형태로 전환되었기 때문인 것으로 판단된다(Park 등, 2019). 미생물별 세포벽 성분의 분해는 L. lactis의 경우 esterase, decarboxylase, L. plantarum의 경우 β-glucosidase, decarboxylase, B. subtilis의 경우 cellulase, β-glu- canase, S. cerevisiae의 경우 β-glucosidase, feruoyles- terase 등의 효소가 관여하고 있다고 보고되어 있다(Hur 등, 2014). 또한 미생물 발효에 의한 플라보노이드의 대사산 물로의 생물전환은 quercetin의 경우 미생물에 따라 당화하 거나 고리열림으로 isoquercetin(quercetin-3-glucoside) 이나 2-protocatechuoylphloroglucinol carboxylic acid 로 전환될 수 있다(Huynh 등, 2014). 본 연구에서 페놀 화합 물의 경우에서는 LC 균주에서, 플라보노이드 함량은 LP 균 주에서 더 높은 함량을 나타내었고, 다른 균주들에 비해 LC 및 LP 균주의 유산균주에서 높은 페놀 및 플라보노이드 함 량을 나타내었다. 명월초의 경우 다른 균주들에 비해 유산균 에 의한 발효가 페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시키는 것으로 판단되며, 유산균별 페놀 및 플라보노이드 함량의 차이는 각각의 유산균이 생성하는 효소에 의한 페놀 및 플라 보노이드 화합물의 당화, 탈당화, 고리열림, 메틸화, 글루크 론산화 등의 대사경로의 차이 때문에 나타나는 것으로 생각 된다(Huynh 등, 2014).

DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성

DPPH는 실온에서 안정한 자유 라디칼로 DPPH를 사용 하면 지방질의 산화 억제 정도 및 항산화 물질을 쉽고 신속 하게 평가할 수 있다(Müller 등, 2010). 균주별로 발효한

(6)

Table 4. DPPH and ABTS radical scavenging activity of fer- mented Gynura procumbens by various microorganism

Microorganism¹⁾

DPPH radical

scavenging activity ABTS radical scavenging activity IC50 (mg/mL)²⁾

Control BS LC LP CU S1 S2

3.48±0.07â3)4) 2.00±0.02^b 1.03±0.01ê 1.31±0.02^d 1.45±0.01^c 3.49±0.07â 1.39±0.01^c

2.45±0.01^e 4.36±0.00^b 2.01±0.02^f 3.29±0.08^d 3.33±0.08^d 4.16±0.13^c 5.21±0.05^a Ascorbic acid 0.03±0.01^f 0.05±0.00^g

2)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by inter- polation of concentration inhibition curve.

3)Mean±SD (n=3).

명월초의 DPPH 라디칼 소거 활성은 50%의 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC₅₀값으로 Table 4에 나타내 었다. LC 발효군의 IC₅₀값은 1.03 mg/mL로 가장 높은 활성 을 나타내었고, S1 발효군을 제외한 나머지 균주들의 IC₅₀값 은 LP(1.31 mg/mL), S2(1.39 mg/mL), CU(1.45 mg/mL), BS(2.00 mg/mL) 순으로 대조군(3.48 mg/mL)에 비해 모두 높은 활성을 나타냈다. 어성초를 유산균을 이용하여 발효한 연구(Kim 등, 2016)에서 비발효군에 비해 발효군에서 라디 칼 소거 활성이 증가하였다고 보고하였으며 이는 유산균 발 효군에서 높은 활성을 나타낸 본 연구 결과와 유사한 결과이 다. 반면 인삼꽃을 발효한 연구에서는 B. subtilis 및 S. cerevisiae 발효군에서 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내 어 본 연구와는 차이를 나타내었다(Kim 등, 2013). DPPH 라디칼 소거 활성은 보통 식물체에 존재하는 flavonoid류나 phenolic acid류 등과 같은 페놀성 화합물들의 함량과 비례 적 상관관계가 있다고 보고되고 있는데(Kim 등, 2010), 페 놀성 화합물의 미생물 대사는 사용된 미생물 균주 및 기질에 따라 당화 및 탈당화, 고리 절단, 에틸화, 글루크론산화 및 황산포합 같은 생물 전환 경로를 통해 많은 새로운 대사산물 을 생성하게 된다(Huynh 등, 2014). 본 연구에서 유산균 발효에 의하여 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가한 것은 명월 초의 경우 다른 균주에 비해 유산균 균주로 발효 시 DPPH 라디칼 소거 활성이 높은 대사산물을 많이 생성하였기 때문 인 것으로 판단되며, LP 균주에 비해 LC 균주의 활성이 좋 은 것으로 확인되었다.

ABTS 라디칼 소거 활성은 ABTS와 potassium persulfate 사이의 반응을 통해 생성된 청색/녹색 ABTS radical cation이 항산화 물질에 의해 제거되어 탈색되는 원리를 이 용한 방법으로 수용성 및 지용성 항산화제, 순수 화합물 및 식물 추출물 모두에 적용할 수 있다(Miller와 Rice-Evans, 1997). 본 연구의 ABTS 라디칼 소거 활성은 50%의 라디칼 소거능을 나타내는 IC₅₀값으로 Table 4에 나타내었다. LC

발효군의 IC₅₀값은 2.01 mg/mL로, 대조군의 2.45 mg/mL 보다 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, LP(3.29 mg/

mL), CU(3.33 mg/mL), S1(4.16 mg/mL), BS(4.36 mg/

mL), S2(5.21 mg/mL) 순으로 항산화 활성이 낮아졌다.

DPPH 라디칼 소거능 측정 결과와 마찬가지로 LC 발효군의 활성이 가장 높았으나 다른 균주 발효물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성과는 차이를 나타내었 다. 인삼꽃을 발효한 연구에서도 발효물의 ABTS 라디칼 소 거 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성과는 차이를 나타내었는 데, 일반적으로 반응속도가 빠른 ABTS 라디칼과는 달리 DPPH 라디칼의 반응속도는 화합물에 따라서 매우 다르며 (Kim 등, 2013), ABTS 라디칼은 DPPH 라디칼과 달리 극 성과 비극성 물질 모두와 반응하여 소거되며, ABTS 라디칼 과 잘 반응하는 항산화 물질이 DPPH와는 전혀 반응하지 않을 수도 있다고 알려져 있다(Kim 등, 2011). 발효에 의한 항산화 활성의 증가는 미생물 가수분해를 통한 페놀화합물 및 플라보노이드의 증가에 기인하며, 미생물 효소는 페놀성 glycoside를 가수분해하여 항산화 활성을 갖는 아글리콘을 생성하게 된다(Hur 등, 2014). 높은 ABTS 라디칼 소거 활 성을 나타낸 L. casei 균주의 경우 amylase, lactate dehydrogenases, peptidases, proteinase 등의 효소 활성을 가지는 것으로 보고되고 있으며, 이외 L. plantarum 균주의 경우 amylase, β-glucosidase, decarboxylase, lactate dehydrogenases, peptidases, phenolic acid decarbox- ylases, phenol reductase, proteinase, tannase의 효소 활 성을, B. subtilis 균주의 경우 mylase, cellulases, hydro- lases, levansucrase, peptidase, proteases, xylanase의 효소 활성을, S. cerevisiae의 경우 alcohol dehydrogen- ase, amylase, β-glucosidase, invertase, maltase, pro- teases의 효소 활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있어 같은 명월초 기질이라도 각각의 미생물이 가지는 효소 활성 및 발육조건에 따라 생성되는 대사산물의 차이로 라디칼 소 거 활성에 의한 항산화 활성이 차이를 나타내는 것으로 생각 된다(Hur 등, 2014).

FRAP assay

FRAP 분석법은 철의 환원 능력을 측정하여 항산화제를 평가하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tri- pyridyltriazine(Fe³⁺) 복합체가 파란색의 ferrous tripyri- dyltriazine(Fe²⁺)으로 환원되는 능력을 593 nm의 청색파장 에서 측정하여 환원력을 계산하는 방법으로 저렴하고 시약 준비 및 절차가 간단하며 결과의 재현성이 높은 항산화 측정 법이다(Kim 등, 2013). 균주별로 발효한 명월초의 FRAP value 측정 결과는 Table 5에 나타내었다. 발효 명월초의 FRAP value는 5 mg/mL 시료 농도에서 대조군이 57.33 mM/g으로 가장 낮았으며, LC 발효군이 139.40 mM/g으로 가장 높은 값을 나타내었다. 다음으로 LP(95.13 mM/g), CU(94.40 mM/g), S1(81.53 mM/g), S2(73.40 mM/g), BS

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Table 5. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of fermented Gynura procumbens by various microorganism

Microorganism¹⁾ FRAP value (mM/g) Control

BS LC LP CU S1 S2

57.33±0.31^f2)3) 71.07±0.76^e 139.40±1.64^a 95.13±0.64^b 94.40±1.22^b 81.53±0.50^c 73.40±0.53^d

2)Mean±SD (n=3).

Table 6. Tyrosinase inhibition activities of the fermented Gynura procumbens by various microorganism

Microorganism¹⁾ Tyrosinase inhibition activity (%) Control

BS LC LP CU S1 S2

31.92±2.67^d2)3) 32.24±1.32^d 67.39±0.92^b 47.68±0.14^c 22.32±1.63^e 30.04±1.21^d 29.38±1.70^d Kojic acid 88.83±2.84^a

2)Mean±SD (n=3).

(71.07 mM/g) 순으로 활성을 나타내었다. 앞에서의 라디칼 소거 활성 결과와 마찬가지로, 환원력에 의한 항산화 활성 실험결과 발효에 의해 항산화 활성이 증가한 것으로 확인되 었다. 유산균(Leuconostoc pesudomesenteroides) 발효 홍화 추출물의 FRAP 활성 측정 결과, FRAP 활성이 1,000 μg/mL 농도에서 비발효물과 발효물에서 각각 230.64 μM과 276.33 μM로 나타나 발효 전보다 약 10% 이상 높게 나타났 다고 보고(Lim 등, 2019)한 반면, 인삼꽃을 발효한 연구에 서는 BS 발효물을 제외한 균주에서 비발효물보다 낮은 FRAP 활성을 나타내었다고 보고(Kim 등, 2013)하여 발효 에 사용한 미생물뿐 아니라 천연물도 발효물의 항산화 활성 에 많은 영향을 나타내는 것으로 생각된다. 또한 발효에 사 용한 유산균 중 LC 균주가 LP 균주에 비해 높은 항산화 활성 을 나타낸 것은 LC 균주가 높은 항산화 활성을 가지는 대사 산물 생성에 관여하는 효소 활성을 가지고 있어 높은 FRAP 활성을 나타낸 것이라 판단된다.

Tyrosinase 저해 활성

멜라닌(melanin)은 피부에 침착되는 색소로 세포 내 멜라 노좀에서 효소의 연속적인 산화반응으로 합성되고 멜라닌 합성의 출발물질인 tyrosine은 tyrosinase에 의해 3,4-di- hydroxyphenylalanin(DOPA)으로 hydroxylation 되는 과 정을 시작으로 DOPA-quinone, DOPA-chrome의 과정을 거쳐 멜라닌으로 합성되며 과도한 멜라닌 생성은 피부노화 및 피부암의 원인이 되기도 한다(Lee 등, 2009). 명월초 발 효물의 미백 효과를 확인하기 위해 멜라닌 형성에 있어 중요 한 단계에 관여하는 tyrosinase를 저해하는 활성을 ty- rosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA-chrome을 비색법 (Im과 Lee, 2011)에 의해 측정하고 Table 6에 나타내었다.

시료 및 양성대조군인 kojic acid의 농도는 30 mg/mL로 실험에 사용하였으며, 실험 결과 CU 발효군이 22.32%로 가장 낮았고 S2(29.38%), S1(30.04%), 대조군(31.92%), BS(32.24 %), LP(47.68%), LC(67.39%) 발효군 순으로 LC 발효군이 가장 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었 다. 끄라차이담 발효물의 tyrosinase 저해능의 측정 연구에 서는 C. utilis 발효물이 47.00%로 유의적으로 가장 높은

저해능을 나타내었으며, 유산균을 비롯한 나머지 발효군 및 무발효군은 이보다 낮은 결과를 나타내었다고 보고(Choi 등, 2018)하고 있어 본 연구와는 차이를 나타내었으나, 유산 균으로 발효한 보리씨앗의 tyrosinase 저해 활성 측정 결과 L. paracasei 및 L. brevis로 발효한 보리는 1,000 ppm 농 도에서 비발효균에 비해 높은 효소저해 활성을 나타내었으 며 L. brevis의 7.89%에 비해 L. paracasei는 57.47%로 더 높은 효소 활성을 나타내었다고 보고하였다(Lee 등, 2018). 또한 L. plantarum, L. brevis 및 L. paracasei의 유산균 발효 대마씨 추출물의 tyrosinase의 저해 활성을 분 석한 연구에서 1 mg/mL의 농도로 처리한 발효하지 않은 대마씨 추출물에 비해 유산균 발효 대마씨 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 유의적으로 증가하였으며 같은 L. plantarum 균주에서도 L. plantarum KCTC3107보다 L. plantarum KCTC3108에서 더 높은 tyrosinase 저해 활성 을 나타내는 차이를 보였고, 특히 L. brevis BHN-LAB129 에서는 발효하지 않은 대마씨 추출물에 비해 약 45% 정도 증가한 tyrosinase의 저해 활성을 나타내었다고 보고하였 다(Yoon 등, 2018). 현재까지 천연물로부터 분리된 tyrosinase 활성 억제물질의 대표적인 화합물로는 phenolic compound, flavonoid, arbutin, glycolic acid, kojic acid, ferulic acid, isoflavonoids 등이 알려져 있는데(Cabanes 등, 1994; Jung 등, 1995), 명월초의 경우 ferulic acid를 비롯한 페놀 화합물들이 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 것 으로 생각된다(Kaewseejan과 Siriamornpun, 2015). 특히 LC 발효군에서 발효에 의해 tyrosinase 저해 활성을 나타내 는 페놀 화합물들이 많이 증가한 것으로 판단되며, 이외 젖 산이 tyrosinase 저해 활성에 농도 의존성을 보였다고 한 연구 결과와도 관련이 있는 것으로 여겨진다(Usuki 등, 2003).

요 약

본 연구에서는 유산균을 비롯한 여러 유용 미생물을 이용해 명월초를 발효시킨 후 발효물의 항산화 활성과 미백 활성을

(8)

평가하였다. 총 폴리페놀 함량은 대조군에서 9.97 mg GAE/

g으로 가장 낮은 값을 보였으며, 발효군 중에서는 LC 발효 군이 18.74 mg GAE/g으로 가장 높은 값을 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 LP 발효군이 가장 높은 값(1.69 mg CE/g)을 나타내었으며 대조군에서 가장 낮은 값(0.91 mg CE/g)을 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디 칼 소거능 측정 결과, LC 발효군에서 IC₅₀값이 각각 1.03 mg/mL, 2.01 mg/mL로 가장 높은 활성을 나타내었으며, FRAP 활성 또한 LC 발효군에서 139.40 mM/g으로 가장 높은 활성을 나타내었다. Tyrosinase 저해 활성 측정 결과 22.32~67.39%의 저해 활성을 나타내었으며 LC 발효군이 가장 높은 수치를 나타내었다. 이상의 연구 결과 명월초를 발효시킨 경우 Lactobacillus casei를 사용하는 것이 우수 한 항산화 활성 및 미백 활성을 가지는 것으로 생각되며 식 품 및 화장품 산업에 응용 가능할 것으로 판단된다.

감사의 글

이 연구는 충남대학교 학술연구비에 의해 지원되었으며, 그 지원에 감사드립니다.

REFERENCES

Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay.

Anal Biochem. 1996. 239:70-76.

Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958. 181:1199-1200.

Cabanes J, Chazarra S, Garcia-Carmona F. Kojic acid, a cosmetic skin whitening agent, is a slow-binding inhibitor of catecho- lase activity of tyrosinase. J Pharm Pharmacol. 1994. 46:982- 985.

Cabras P, Angioni A. Pesticide residues in grapes, wine, and their processing products. J Agric Food Chem. 2000. 48:967-973.

Chien HL, Huang HY, Chou CC. Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria. Food Microbiol. 2006. 23:

772-778.

Choi MH, Kim KH, Yook HS. Antioxidant activities of fer- mented Kaempferia parviflora and inhibitory actions on ty- rosinase and elastase. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2018.

47:1076-1084.

Day AJ, DuPont MS, Ridley S, Rhodes M, Rhodes MJ, Morgan MR, et al. Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid gly- cosides by human small intestine and liver β-glucosidase activity. FEBS Lett. 1998. 436:71-75.

Flurkey WH. Identification of tyrosinase in mushrooms by iso- electric focusing. J Food Sci. 1991. 56:93-95.

Folin O, Denis W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J Biol Chem. 1912. 12:239-243.

Han SK. Quality improvement of effective microorganisms (EM) pork produced by using EM. J Korean Soc Food Sci Nutr.

2005. 34:734-737.

Hur SJ, Lee SY, Kim YC, Choi I, Kim GB. Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods. Food Chem. 2014. 160:346-356.

Huynh NT, Van Camp J, Smagghe G, Raes K. Improved release

and metabolism of flavonoids by steered fermentation proc- esses: a review. Int J Mol Sci. 2014. 15:19369-19388.

Hyon JS, Kang SM, Han SW, Kang MC, Oh MC, Oh CK, et al. Flavonoid component changes and antioxidant activities of fermented Citrus grandis Osbeck peel. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2009. 38:1310-1316.

Im DY, Lee KI. Tyrosinase inhibitory activity and melanin production inhibitory activity of the extract and fractions from Paeoniae Radix. Kor J Pharmacogn. 2011. 42:323-328.

Jeon HJ, Kwon HJ. Anti-inflammation effect of Gynura Procum- bens extract. J Digital Convergence. 2016. 14:515-520.

Jeon HJ, Kwon HJ. Antioxidant effects and functional evaluation of Gynura procumbens extract as a collaboration material for cosmetics and functional food. Korean J Aesthet Cosmetol.

2014. 12:499-507.

Joshi VK, Gupta K, Devrajan A, Lal BB, Arya SP. Production and evaluation of fermented apple pomace in the feed of broilers. J Food Sci Technol. 2000. 37:609-612.

Jung SW, Lee NK, Kim SJ, Han D. Screening of tyrosinase inhibitor from plants. Korean J Food Sci Technol. 1995. 27:

891-896.

Kaewseejan N, Siriamornpun S. Bioactive components and prop- erties of ethanolic extract and its fractions from Gynura pro- cumbens leaves. Industrial Crops and Products. 2015. 74:271- 278.

Kang DH, Kim JW, Youn KS. Antioxidant activities of extracts from fermented mulberry (Cudrania tricuspidata) fruit, and inhibitory actions on elastase and tyrosinase. Korean J Food Preserv. 2011. 18:236-243.

Kim DH, Han SB, Park JS, Han MJ. Fermentation of antler and its biological activity. Kor J Pharmacogn. 1994. 25:233-237.

Kim GD, Lee YS, Cho JY, Lee YH, Choi KJ, Lee Y, et al.

Comparison of the content of bioactive substances and the inhibitory effects against rat plasma oxidation of conventional and organic hot peppers (Capsicum annuum L.). J Agric Food Chem. 2010. 58:12300-12306.

Kim HR. Anti-bacterial and anti-inflammatory activities of sol- vent fraction of Gynura procumbens leaf extracts. Master’s thesis. Eulji University, Daejeon, Korea. 2018.

Kim KH, Kim DM, Byun MW, Yun YS, Yook HS. Antioxidant activity of Panax ginseng flower-buds fermented with various microorganisms. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013. 42:663- 669.

Kim KH, Yun YS, Chun SY, Yook HS. Antioxidant and anti- bacterial activities of grape pomace fermented by various microorganisms. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2012. 41:1049- 1056.

Kim KJ, Gim AH, Kim JH, Kim DH, Lee SR, Park JH, et al.

Antioxidant activities of Gynura procumbens extracts. J Soc Cosmet Sci Korea. 2015. 41:181-187.

Kim YM, Jeong HJ, Chung HS, Seong JH, Kim HS, Kim DS, et al. Anti-oxidative activity of the extracts from Houttuynia cordata Thunb. fermented by lactic acid bacteria. J Life Sci.

2016. 26:468-474.

Kim YS, Jo C, Choi GH, Lee KH. Changes of antioxidative components and activity of fermented tea during fermentation period. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2011. 40:1073-1078.

Lee HT, Kim JH, Lee SS. Comparison of biological activity between soybean pastes adding sword been and general soybean pastes. J Food Hyg Saf. 2009. 24:94-101.

Lee JB, Bae JS, Son IK, Jeon CP, Lee EH, Joo WH, et al.

Antioxidant and ACE inhibiting activities of sugared-Buchu (Allium ampeloprasum L. var. porum J. Gay) fermented with lactic acid bacteria. J Life Sci. 2014. 24:671-676.

(9)

Lee JH, Yoon YC, Kim JK, Park YE, Hwang HS, Kwon GS, et al. Antioxidant and whitening effects of the fermentation of barley seeds (Hordeum vulgare L.) using lactic acid bac- teria. J Life Sci. 2018. 28:444-453.

Li HB, Wong CC, Cheng KW, Chen F. Antioxidant properties in vitro and total phenolic contents in methanol extracts from medicinal plants. LWT－Food Sci Technol. 2008. 41:385-390.

Lim MJ, Gu YR, Hong JH. Physicochemical properties and anti- oxidant activities of safflower (Carthamus tinctorius L.) ex- tracts according to fermentation of lactic acid bacteria. J Chitin Chitosan. 2019. 24:24-32.

Martins S, Mussatto SI, Martínez-Avila G, Montañez-Saenz J, Aguilar CN, Teixeira JA. Bioactive phenolic compounds: production and extraction by solid-state fermentation. A review.

Biotechnol Adv. 2011. 29:365-373.

Miller NJ, Rice-Evans CA. Factors influencing the antioxidant activity determined by the ABTS･⁺ radical cation assay. Free Radic Res. 1997. 26:195-199.

Müller L, Theile K, Böhm V. In vitro antioxidant activity of tocopherols and tocotrienols and comparison of vitamin E concentration and lipophilic antioxidant capacity in human plasma. Mol Nutr Food Res. 2010. 54:731-742.

Noh SK. Functional action of flavonoids for treatment of obesity.

Food Industry and Nutrition. 2002. 7(2):27-29.

Park G, Park JY, Chang YH. Changes in flavonoid aglycone contents and antioxidant activities of citrus peel depending on enzyme treatment times. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2019.

48:542-550.

Park MR, Yoo C, Chang YN, Ahn BY. Change of total poly- phenol content of fermented Gastrodia elata Blume and radi- cal scavenging. Korean J Plant Res. 2012. 25:379-386.

Pellegrini N, Re R, Yang M, Rice-Evans C. Screening of dietary

carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2,2’-azinobis(3-ethylenebenzothiazoline-6- sulfonic acid radical cation decolorization assay. Method En- zymol. 1999. 299:379-289.

Seo SH, Park SE, Kim EJ, Oh DG, Son HS. Characterization of fermented mulberry leaf using Bacillus subtilis. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2017. 46:108-114.

Tan HL, Chan KG, Pusparajah P, Lee LH, Goh BH. Gynura procumbens: An overview of the biological activities. Front Pharmacol. 2016. 7:52. https://doi.org/10.3389/fphar.2016.00052 Um JN, Min JW, Joo KS, Kang HC. Enhancement of antioxidant

and whitening effect of fermented extracts of Scutellariae baicalensis. J Soc Cosmet Sci Korea. 2017. 43:201-210.

Usuki A, Ohashi A, Sato H, Ochiai Y, Ichihashi M, Funasaka Y. The inhibitory effect of glycolic acid and lactic acid on melanin synthesis in melanoma cells. Exp Dermatol. 2003.

12:43-50.

Wiart C. Medicinal plants of Southeast Asia. 2nd ed. Prentice Hall, Petaling Jaya, Malaysia. 2002.

Yang SA, Im NK, Lee IS. Effects of methanolic extract from Salvia miltiorrhiza Bunge on in vitro antithrombotic and anti- oxidative activities. Korean J Food Sci Technol. 2007. 39:83- 87.

Yoon YC, Kim BH, Kim JK, Lee JH, Park YE, Kwon GS, et al. Verification of biological activities and tyrosinase in- hibition of ethanol extracts from hemp seed (Cannabis sativa L.) fermented with lactic acid bacteria. J Life Sci. 2018. 28:

688-696.

Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem. 1999. 64:555-559.