추출 온도 및 시간에 따른 현초 열수 추출물의 항산화 및 항염증 활성 성혜미

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추출 온도 및 시간에 따른 현초 열수 추출물의 항산화 및 항염증 활성

성혜미․서예슬․양은주 (재)전남생물산업진흥원 식품산업연구센터

Anti-Oxidant and Anti-Inflammatory Activities of Hot Water Extract Obtained from Geranium thunbergii Using Different Extraction Temperatures and Times

Hea-Mi Sung, Ye-Seul Seo, and Eun Ju Yang Food Research Center, Jeonnam Bioindustry Foundation

ABSTRACT In this study, we investigated major flavonoids in the hot water extract from Geranium thunbergii.

The results of high-performance liquid chromatography showed that hot water extract from G. thunbergii contained 2 flavonoids, of which the major one was kaempferol followed by quercetin. Also, G. thunbergii was extracted at different temperatures (50°C, 70°C, and 90°C) and times (1, 2, 3, and 4 h), and the hot water extracts were evaluated for extraction yield, kaempferol content, anti-oxidant activity, and anti-inflammatory activity. The extraction yield, kaempferol content, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activities and nitric oxide (NO) inhibitory activity increased as the extraction temperature increased. In the evaluation of the extraction time of G. thunbergii, the content of kaempferol was highest after 2 h of extraction, but the extraction yield, DPPH and ABTS radical scavenging activities, as well as the NO inhibitory activity were not different after more than 2 h of extraction. We further investigated the effects of hot water extract from G. thunbergii with different extraction times on the expression of pro-inflammatory genes such as iNOS, COX-2, IL-1β, and IL-6 in lipopolysaccharides-stimulated RAW 264.7 cells. At 10 μg/mL, hot water extract with an extraction time of 2 h showed the highest decrease in expression of pro-inflammatory genes among hot water extracts with different extraction times. Based on these results, we suggest that the optimum hot water extract conditions of G.

thunbergii are 90°C for 2 h and that hot water extract from G. thunbergii has the potential for use as an anti-oxidant and anti-inflammatory agents.

Key words: Geranium thunbergii, extraction temperature and time, hot water extract, anti-oxidant, anti-inflammatory

Received 14 August 2018; Accepted 13 September 2018 Corresponding author: Eun Ju Yang, Food Research Center, Jeon- nam Bioindustry Foundation, Naju, Jeonnam 58275, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-61-339-1251

서 론

생체 대사과정에서 끊임없이 발생하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 생체 내에 존재하는 항산화 계에 의해 제거되어 정상적인 경우 항산화 방어계의 균형을 이루고 있다. 그러나 생체가 과도한 스트레스를 받거나 과 음, 흡연, 피로, 질병 상태에서는 활성산소의 생성과 소거의 불균형이 초래되고 DNA, 단백질, 세포 분자들의 산화적 손 상을 유발하여 암, 심혈관 질환, 당뇨 등과 같은 다양한 질병 을 유발하고 노화를 촉진한다(1,2). 현대인의 질병 예방에 대한 관심 및 항노화 산업의 발전에 따라 활성산소종을 억제 할 수 있는 천연 항산화제에 대한 요구가 증가하고 있으며, 특히 천연 식물 자원의 항산화 활성에 대한 연구가 많이 이 루어지고 있다(3). 식물에 함유된 폴리페놀은 2차 대사산물

의 하나로 phenolic hydroxyl기를 가지고 있으며, 이들은 활성 자유라디칼에 수소원자를 제공하여 안정한 비 라디칼 을 형성함으로써 활성산소를 제거하는 항산화 효과를 나타 내는 것으로 알려져 있다(4,5).

염증은 인체 내부 및 외부 자극에 대한 중요한 생체 방어 기전의 하나로 발열, 부종, 통증과 같은 병리적 증상을 수반 한다(6). 그러나 염증 반응이 만성화되면 류마티스 관절염, 동맥경화증, 위염, 천식 등의 염증성 질환을 유발할 수 있으 며(7,8), 염증반응이 일어나는 과정 중 proinflammatory cytokines, nitric oxide(NO), prostaglandins(PGs) 등의 염증매개물질이 생성된다(9). Inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해서 생성된 NO는 면역반응에서 유용한 역할을 하지만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO의 생성은 만성염증 질환을 일으키는 중요한 원인이다(10). 현재 항염 증 치료제로서 비스테로이드성 항염증 약물과 비마약성 진 통제가 급성 및 만성 염증 질환 치료에 사용되고 있으나, 기존 약물보다 안전하고 부작용이 없으며 효과적인 천연 항 염증 치료제에 대한 탐색도 이루어지고 있다(11).

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현초(Geranium thunbergii)는 노관초 또는 이질풀이라 불리는 식물의 한의학적 명칭으로 꽃이 필 무렵 풀 전체를 채취해서 말린 것을 의미한다(12). 한국, 일본, 대만 등지에 서 자생하는 다년생 초본으로 쥐손이풀과에 속하며, 전통적 으로 지상부를 사용하여 이질, 설사 및 염증 치료에 사용하 여 왔다(13). 현초의 주요 성분으로는 tannin과 geraniin, corilagin, ellagic acid, gallic acid, quercetin, kaempferol, kaempferol-7-rhamnoside 등의 플라보노이드 화합물 이 알려져 있다(14,15). 현초의 생리활성에 대한 연구로는 현초 페놀성 화합물에 의한 당뇨합병증 억제 효과(16), 메탄 올 추출물의 식중독균 억제 활성(12), 부탄올 분획물의 항비 만 및 항고지혈증 효과(13), 항산화 활성 및 항균 활성(17) 등이 있으나 소수에 불과하며, 대부분이 현초를 메탄올 용매 로 추출하여 연구한 결과로서 현초의 기능성 소재 개발 및 산업화를 위해 다양한 연구가 필요한 실정이다.

본 연구에서는 산화 스트레스 및 염증과 관련된 질병을 예방할 수 있는 천연 소재로서 현초의 활용 가능성을 평가하 고 산업적 이용 증대를 위한 기초 자료를 제시하기 위해 현 초 열수 추출물의 주요 플라보노이드 성분을 분석하고 열수 추출 조건에 따른 항산화 및 항염증 활성을 조사하였다.

재료 및 방법

재료 및 현초 열수 추출물 제조

본 실험에 사용한 현초는 2016년 수확하여 건조된 원료 를 조은약초(Bonghwa, Korea)에서 구입하여 -20°C에 보 관하면서 실험에 사용하였다. 추출 온도에 따른 현초의 열수 추출은 현초 40 g에 960 mL의 물을 가하여 50°C, 70°C, 90°C에서 1시간 동안 추출하였다. 추출 시간에 따른 현초의 열수 추출은 현초를 90°C에서 각각 1시간, 2시간, 3시간, 4시간을 추출하였다. 모든 열수 추출물은 55 μm bag filter 로 여과한 후 동결건조(PVTFD 10R, IlShin Lab Co., Ltd., Dongducheon, Korea) 하여 추출 수율을 측정하고 본 실험 의 평가 시료로 사용하였다. 추출 수율은 동결 건조된 분말 중량을 추출에 사용한 현초 원료의 중량으로 나누어 백분율 (%)로 나타내었다.

열수 추출물의 HPLC 분석

현초 열수 추출물의 주요 플라보노이드 성분(14,15)을 분 석하기 위하여 90°C에서 1시간 동안 추출한 열수 추출액 100 mL에 동량의 ethyl acetate를 첨가한 후 3회 반복하여 분획을 시행하였다. Ethyl acetate 분획물은 감압 농축하여 건조한 후 2.5 N HCl과 70% methanol 혼합 용액 5 mL를 가하여 75°C에서 2시간 동안 산 가수분해를 진행하였다. 가 수분해한 시료는 ethyl acetate 용액으로 재분획하여 감압 농축한 후 50% methanol에 용해하여 high-performance liquid chromatography(HPLC) 분석에 사용하였다. HPLC 분석기기는 Agilent 1100 series(Agilent Technologies,

Waldbronn, Germany)를 사용하였으며, column은 Sun- fire C18(4.6×250 mm, 5 μm, Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하였고, 검출 파장은 370 nm에서 분석하였다.

이동상은 0.2% acetic acid in 50% methanol(A)과 0.2%

acetic acid in 70% methanol(B)로 0분, 100%(A) 0%(B);

30분, 0%(A) 100%(B)의 기울기 용리 조건으로 설정하여 분석하였다. Flow rate는 0.7 mL/min, injection volume은 10 μL로 분석하였다. 현초 열수 추출물 주요 성분의 확인을 위한 kaempferol과 quercetin 표준품은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 추출 온도와 시간에 따른 현초 열수 추출물의 kaempferol 함량은 표준 검량 곡선을 통해 계산하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

현초의 열수 추출물 10 μL에 0.1 mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Wako Pure Chemical Indus- tries, Ltd., Osaka, Japan) 190 μL를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 DPPH 라디칼 소 거능은 아래의 식으로 계산하여 백분율로 나타내었다.

DPPH 라디칼

소거능(%) ＝(^1－ 시료 첨가구의 흡광도

)^×100

무처리구의 흡광도

ABTS 라디칼 소거능 측정

7 mM ABTS[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid), Wako Pure Chemical Industries, Ltd.]

와 2.45 mM potassium persulfate를 암소에서 16시간 동 안 반응시켜 ABTS 양이온을 형성시킨 후 사용 직전 734 nm에서 흡광도가 0.80±0.02가 되도록 조정하였다. 현초의 열수 추출물 10 μL에 ABTS 용액 190 μL를 혼합하여 실온 에서 6분 동안 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하 여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 ABTS 라디 칼 소거능은 아래의 식으로 계산하여 백분율로 나타내었다.

ABTS 라디칼

소거능(%) ＝(^1－ 시료 첨가구의 흡광도

)^×100

무처리구의 흡광도

세포 배양 및 세포 독성 측정

실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포는 한 국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세 포 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicil- lin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 대 식세포에 대한 현초 열수 추출물의 세포 독성은 XTT assay 로 측정하였다. RAW 264.7 세포를 48-well plate에 5×10⁴ cells/mL로 분주하여 24시간 전 배양한 후 현초 열수 추출

(3)

Table 1. Sequences of PCR primers used for quantitative re- al-time PCR

Primer name Sequence iNOS

COX-2 IL-1β IL-6

Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse

5’-CTCACTGGGACTGCACAGAA-3’

5’-GCTTGTCTCTGGGTCCTCTG-3’

5’-TGCTGTGGAGCTGTATCCTG-3’

5’-CGGGAAGAACTTGCATTGAT-3’

5’-TTCGACACATGGGATAACGA-3’

5’-TCTTTCAACACGCAGGACAG-3’

5’-TACCCCCAGGAGAAGATTCC-3’

5’-TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT-3’

물을 농도별로 첨가하여 24시간 동안 처리하였다. 시료가 처리된 세포를 상층액을 제거한 후 PBS로 세척하고 1 mg/

mL XTT[2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt, Sigma-Al- drich Co.]와 10 μg/mL phenazine methosulfate(PMS, Sigma-Aldrich Co.) 혼합 용액을 250 μL 첨가하여 37°C에 서 2시간 반응시켰다. 반응에 따라 생성된 formazan은 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존 율과 비교하였다.

NO 생성 억제능 측정

RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess reagent를 이용하여 측정하였 다. RAW 264.7 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 48-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 현초 열수 추출물 10 μg/mL와 lipopolysaccharides(LPS, Sigma-Aldrich Co.) 0.5 μg/mL를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 세포 배 양 상층액에 동량의 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine in 5% phosphoric acid) 를 혼합하여 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였 고, sodium nitrate로 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 산출 하였다.

Real-time PCR

RAW 264.7 세포에서 추출 시간에 따른 현초 열수 추출물 처리에 의한 염증매개인자 mRNA 발현 정도를 real-time PCR을 이용하여 측정하였다. LPS와 현초 열수 추출물이 처리된 RAW 264.7 세포를 PBS로 2회 세척한 후 TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 세 포에서 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Quanti Tect Reverse Transcription kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Rotor-Gene SYBR Green PCR kit(Qiagen)을 이용하여 Rotor-Gene Q thermal cycler(Qiagen)를 통해 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6 유전자를 증폭시켰으며, 이때 사용한 primer는 Table 1에 나타내었다. PCR 조건은 95°C에서 30 초, 50°C에서 30초, 72°C에서 90초를 35 cycle로 하였다.

통계분석

모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며, 실험의 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내 었다. 통계는 SPSS 프로그램(version 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석(one-way ANOVA) 을 실시한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 P<0.05 수준에서 유의적 차이를 검증하였다.

결과 및 고찰

현초 열수 추출물의 플라보노이드 성분 분석

현초 열수 추출물의 주요 플라보노이드 성분을 확인하기 위하여 HPLC를 시행한 결과 RT 19.0 min(peak 1)과 25.4 min(peak 2)에서 2개의 주요 피크가 검출되었으며, peak 2 물질의 함량이 가장 많은 것으로 나타났다(Fig. 1). 2개의 주요 피크를 현초의 플라보노이드 성분으로 보고된 물질들 과 비교한 결과 peak 1은 quercetin, peak 2는 kaempferol 로 확인되었다. 현초 열수 추출물에서 가장 함량이 높게 나 타난 kaempferol은 과일, 채소류 및 차에 주로 함유된 폴리 페놀 항산화 성분으로 알려져 있다(18). Kaempferol의 주 요 생리 활성으로는 강력한 항산화 활성(19), 항염증 활성 (20), 항암 활성(18), 항균 활성(21) 등이 보고되고 있다.

현재까지 보고된 현초 추출물의 생리활성 및 성분 분석은 에탄올 또는 메탄올 용매를 사용하여 추출한 결과이며(12, 13,16,17), 열수 추출물을 이용한 성분 분석 및 생리활성에 관한 보고는 없는 실정이다. Kwon 등(17)은 현초의 메탄올 추출물을 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 용매로 분획하여 용매 분획물의 항산화 활성 및 항균 활성을 보고하였다. Choi 등(16)은 현초의 에탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물로부터 gallic acid, protocatechuic acid, geraniin 등 8개의 화합물을 분리하여 당뇨합병증 억 제 활성과 관련된 연구 결과를 보고하였다. 본 연구에서는 기능성 소재로서 현초 열수 추출물의 활용 가능성을 검토하 고, 산업적 공정을 위한 기초 자료 확보를 위해 열수 추출 온도 및 시간에 따른 현초 추출물의 추출 수율 및 kaempferol 함량을 측정하고, 항산화 및 항염증 활성이 우수한 추 출 조건을 선정하고자 하였다.

추출 온도에 따른 현초 열수 추출물의 추출 수율, kaempferol 함량, 항산화 활성 및 NO 생성 억제 효과

현초를 50°C, 70°C, 90°C에서 각각 1시간 동안 열수 추 출한 후 추출물의 추출 수율 및 kaempferol 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 추출 수율과 kaempferol 함량 모두 추출 온도와 비례하여 증가하였으며, 추출 수율은 50°C 추 출의 9.0%에서 90°C 추출의 경우 12.5%로 증가하였고, kaempferol 함량은 50°C 추출의 0.68 mg/g에서 90°C 추 출의 경우 1.08 mg/g으로 증가하였다.

추출 온도에 따른 현초 열수 추출물의 항산화 활성을

(4)

Quercetin

Kaempferol

Peak 1

Peak 2

A

B

Fig. 1. HPLC chromatogram of standard flavonoid compounds (A) and hot water extract from Geranium thunbergii (B).

Table 3. DPPH radical scavenging activity and ABTS radical scavenging activity of hot water extract from Geranium thun- bergii at different temperature

Extraction temperature

DPPH radical scavenging activity (%)

ABTS radical scavenging activity (%) 50°C

70°C 90°C

37.2±0.6^c1) 41.2±0.8^b 52.8±0.8^a

49.1±1.1^c 56.4±1.2^b 65.2±1.7^a All the samples were used at the concentration of 25 μg/mL.

Values are expressed as the mean±SD (n=3).

1)Means with different letters within the same column are sig- nificantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Table 2. Extraction yield and kaempferol content of hot water extract from Geranium thunbergii at different temperature

Extraction

temperature Extraction yield

(%) Kaempferol content (mg/g) 50°C

70°C 90°C

9.0±0.3^b1) 10.4±0.9^b 12.5±1.3^a

0.68±0.02^c 0.90±0.03^b 1.08±0.05^a Values are expressed as the mean±SD (n=3).

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능법으로 측정한 결과는 Table 3과 같다. 온도별 추출 시료를 25 μg/mL 농도에서 항산화 활성을 비교한 결과 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 모두 추 출 온도와 비례하여 활성이 증가하는 경향을 나타내었다.

50°C 추출물의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 각각 37.2

%와 49.1%를 나타냈으나, 90°C 추출물은 각각 52.8%와 65.2%의 라디칼 소거능을 나타내어 항산화 활성이 1.3~

1.4배 정도 증가하는 결과를 보였다. Kwon 등(17)은 현초 의 메탄올 추출물을 용매별로 분획하여 DPPH 및 ABTS 라 디칼 소거능을 측정한 결과 ethyl acetate 분획의 활성이 가

장 우수한 결과를 보였으며, 25 μg/mL 농도에서 ethyl acetate 분획의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 각각 54.64%

와 47.14%로 측정되었다.

NO는 NO synthase(NOS)의 효소 촉매작용을 통해 생성 되는 활성질소종의 하나로서 일반적으로 면역반응에 중요 한 역할을 하지만 과량 존재할 경우 인체에 염증 반응을 유 발하며 세포의 돌연변이, 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다(10). 추출 온도에 따른 현초 열수 추출물의 항

(5)

c b b

a

d

0 5 10 15 20 25 30

Nitric oxide (µM) .

LPS (0.5 μg/mL) Sample (10 μg/mL)

−

− +

−

+ 50°C

+ 70°C

+ 90°C

Fig. 2. Effect of hot water extract from Geranium thunbergii at different temperature on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated with sample (10 μg/mL) and LPS (0.5 μg/mL) for 24 h. The amount of NO in supernatant was measured using Griess reagent. The results were expressed as the mean±SD of triplicate determinations. Different letters above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Table 4. Extraction yield and kaempferol content of hot water extract from Geranium thunbergii at different time

Extraction time

Extraction yield

(%) Kaempferol content (mg/g) 1 h

2 h 3 h 4 h

12.5±1.3^b1) 16.5±1.2â 16.8±1.0â 17.0±1.4â

1.08±0.02^bc 1.40±0.07^a 1.16±0.06^b 0.92±0.05^c Values are expressed as the mean±SD (n=3).

b

c

e

a

b

d

a b

d

a

b

d

0 10 20 30 40 50 60 70 80

6.3 12.5 25.0

Concentration ( μg/mL) DPPH radical scavenging . activity (%) .

1 h 2 h 3 h 4 h

A

f

d

b

e

c

a

e

c

a

e

c

a

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

6.3 12.5 25.0

Concentration (μg/mL) ABTS radical scavenging . activity (%) .

1 h 2 h 3 h 4 h

B

Fig. 3. DPPH radical scavenging activity (A) and ABTS radical scavenging activity (B) of hot water extract from Geranium thunbergii at different time. The results were expressed as the mean±SD of triplicate determinations. Different letters above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multi- ple range test.

염증 활성을 확인하기 위해 LPS로 NO 생성을 유도한 RAW 264.7 대식세포에 추출 온도별 열수 추출물을 무독성 농도 인 10 μg/mL로 처리하여 NO 생성 억제능을 측정하였다 (Fig. 2). LPS 처리군은 대조군보다 NO 생성량이 증가하였 으며, 추출 온도에 따른 현초 열수 추출물을 처리한 결과 모두 NO 생성량이 감소하였으나 NO 생성 억제 활성은 추출 온도에 따라 유의적인 차이를 나타내었다. NO 생성량은 50°C, 70°C, 90°C 추출물의 처리에서 각각 20.1, 18.4, 15.7 μM이 측정되어 추출 온도가 증가할수록 NO 생성 억제 능이 우수하였다. 추출 온도에 따른 현초 열수 추출물의 추 출 수율, kaempferol 함량, 항산화 및 항염증 활성을 평가한 결과 모든 평가항목에서 90°C 열수 추출물이 유의적으로 우수한 결과를 나타내어 현초의 열수 추출 온도를 90°C로 선정한 후 추출 시간에 따른 열수 추출물의 평가를 진행하였 다.

추출 시간에 따른 현초 열수 추출물의 추출 수율, kaempferol 함량, 항산화 활성 및 NO 생성 억제 효과

현초를 90°C에서 각각 1, 2, 3, 4시간 열수 추출한 후 추출물의 추출 수율 및 kaempferol 함량을 측정한 결과는

Table 4와 같다. 추출 수율은 1시간 추출에서 12.5%로 가 장 낮은 결과를 보였으나, 2시간 이상 추출에서는 상당히 증가하여 16.5~17.0% 범위로 측정되었으며 유의적인 차이 는 보이지 않았다. 추출 시간에 따른 현초 열수 추출물의 kaempferol 함량은 1시간 추출의 1.08 mg/g의 함량에서 2시간 추출 시 1.40 mg/g으로 1.3배 증가하였다. 그러나 3시간 추출에서 1.16 mg/g과 4시간 추출에서 0.92 mg/g의 함량을 나타내며 2시간 이상의 추출 조건에서는 추출 시간 이 증가할수록 kaempferol 함량이 감소하는 경향을 나타내 었다. 이러한 결과는 고온에서 장시간 열처리가 진행될 경우 kaempferol의 안정성이 저하되기 때문으로 생각된다.

Kaempferol을 95°C에서 15분 동안 열처리하였을 때 안정 하였다는 보고도 있으나(22), Koh 등(23)은 토마토 페이스 트를 실온에서 12개월 동안 저장하면서 주요 성분의 안정성 을 분석한 결과 quercetin은 안정한 결과를 보인 반면에 kaempferol은 저장 12개월 후에 38%의 함량이 감소하여 quercetin보다 저장 안정성이 낮은 결과를 보였다. 장시간 의 열처리 공정은 kaempferol의 안정성 저하를 가속화할 수 있을 것으로 생각된다.

추출 시간에 따른 현초 열수 추출물의 항산화 활성을 비교 하기 위해 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 추출 시간에 따른 각각의 열수 추출물을 6.3,

(6)

c c c b a

d

0 5 10 15 20 25 30

Nitric oxide (µM) .

−

− +

− + 1 h

+ 2 h

+ 3 h

+ 4 h

Fig. 4. Effect of hot water extract from Geranium thunbergii at different time on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated with sample (10 μg/mL) and LPS (0.5 μg/mL) for 24 h. The amount of NO in supernatant was measured using Griess reagent. The results were expressed as the mean±SD of triplicate determinations. Different letters above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multi- ple range test.

12.5, 25.0 μg/mL의 농도에서 항산화 활성을 측정한 결과 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 모두 1시간 추출물의 활성이 가장 낮은 결과를 보였다. 그러나 2시간 이상의 추출물은 모 두 1시간 추출물에 비해 동일 농도에서 더 높은 활성을 나타 내었으며, 12.5 μg/mL의 농도에서 1시간 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능이 각각 36.4%와 35.4%로 나타난 반면에 2시간 추출물은 각각 48.2%와 48.1%로 활성이 증 가하는 결과를 보였다. 2~4시간 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능은 동일한 농도에서는 유의적인 차이가 없는 결과를 보였다. 추출 시간에 따른 kaempferol의 함량이 2시 간 추출에서 가장 높고 추출 3시간 이후에는 감소하는 경향 을 나타내는 반면에 추출 시간에 따른 항산화 활성은 추출 2~4시간 조건에서 유사한 활성을 나타내므로, 현초 추출물 의 항산화 활성이 kaempferol의 농도 의존적인 영향보다는 전체 항산화 활성 화합물의 종류 및 함량과 연관성이 높을 것으로 생각된다.

추출 시간에 따른 현초 열수 추출물의 항염증 활성을 비교 하기 위해 LPS로 NO 생성을 유도한 RAW 264.7 대식세포 에 추출 시간별 열수 추출물을 10 μg/mL로 처리하여 NO 생성량을 측정하였다(Fig. 4). LPS만 처리한 군에서 NO가 24.3 μM이 생성됐지만 현초 열수 추출물 처리군은 NO 함량 이 7.7~15.8 μM 수준으로 측정되어 LPS 처리군보다 유의 적으로 35~68% 낮은 결과를 보였다. 추출 시간에 따른 NO 생성량은 1시간 추출물이 15.8 μM로 시료 처리군 중 가장 높았으며, 2~4시간 추출물은 7.7~8.1 μM의 유사한 농도를 나타내며 1시간 추출물에 비해 NO 억제능이 2배 정도 높은 결과를 나타내었다. Jeong 등(24)은 비파엽 열수 추출물을 LPS로 유도한 대식세포에서 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과 400 μg/mL의 농도에서 44.35%의 억제능을 나타냄을 보고하였고, Lee 등(25)은 염증반응이 유도된 대식세포에

서 히어리 가지 메탄올 추출물의 NO 생성 억제 활성을 측정 한 결과 500 μg/mL의 농도에서 약 40%의 억제능이 나타나 는 결과를 보고하여, 본 연구의 NO 생성 억제 결과와 비교할 때 현초 열수 추출물이 10 μg/mL의 낮은 농도에서도 NO 억제 효능이 우수함을 알 수 있다.

추출 시간에 따른 현초 열수 추출물의 염증매개인자 mRNA 발현 억제 효과

대식세포는 염증 반응 시에 전사인자인 nuclear factor- κB(NF-κB)를 활성화하여 iNOS와 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 발현시키며, iNOS의 경우 L-arginine의 산화 적 탈아미노화를 자극해서 염증인자인 NO를 생성시키고, COX-2는 염증매개체인 prostaglandin E2(PGE2)의 생합성 을 촉진하여 염증을 심화시키는 역할을 한다(26). 과도한 염증 반응의 경우 tumor necrosis factor-α(TNF-α), in- terleukin-1β(IL-1β), IL-6 등과 같은 염증매개성 cyto- kines의 분비가 촉진된다(27). 따라서 과도한 염증 반응의 조절은 다양한 염증 관련 질환을 개선하는 데 중요하므로 iNOS, COX-2의 발현 억제를 통해 NO와 PGE2의 생성을 억제하고, TNF-α, IL-1β 등의 염증매개물질의 생성을 억 제할 수 있는 천연소재의 개발이 요구되고 있다.

추출 시간에 따른 현초 열수 추출물의 NO 생성 억제 활성 을 비교한 결과 2시간 이상의 추출물에서 우수한 억제 활성 을 확인하였으며, 이들 시료 간에 유의적인 활성 차이는 나 타나지 않았다(Fig. 4). 현초 열수 추출물의 항염증 활성 평 가에서 추출 시간에 따른 열수 추출물이 염증매개인자의 발 현에 미치는 영향을 조사하기 위해 각 추출물이 10 μg/mL 의 농도로 처리된 대식세포에서 iNOS, COX-2, IL-1β, IL- 6 유전자의 mRNA 발현 변화를 real-time PCR로 확인하였 다. Fig. 5의 결과와 같이 현초 열수 추출물은 LPS 처리군에 비해 염증매개인자의 mRNA 발현을 유의적으로 억제하였 으나 추출 시간에 따라 억제율은 다르게 나타나는 결과를 보였으며, 모든 인자에서 2시간 추출물의 발현 억제 효과가 가장 우수한 것으로 측정되었다. NO의 생성과 밀접하게 연 관된 iNOS의 mRNA 발현에서 1시간 추출물은 26% 억제율 로 가장 낮았으며, 3시간과 4시간 추출물은 각각 50%와 49% 억제율로 유사한 수준이었고, 2시간 추출물은 76% 억 제율로 가장 높게 나타났다. 급성 염증 반응에서 prosta- glandins의 합성에 관여하는 COX-2의 mRNA 발현에 대한 현초 열수 추출물의 영향을 측정한 결과 1시간 추출물은 20% 억제율로 가장 낮고, 2시간 추출물은 66% 억제율로 가장 높았으며, 3시간과 4시간은 39%와 38% 억제율로 유 사하였다. 추출 시간에 따른 현초 열수 추출물이 LPS로 유 도된 염증성 cytokines의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 IL-1β와 IL-6 유전자의 mRNA 발현 변화를 측정하였 다. IL-1β와 IL-6의 mRNA 발현은 1시간 추출물에서 동일 하게 16% 억제율로 가장 낮았으며, 2시간 추출물에서는 각 각 76%와 79%의 억제율로 가장 높은 억제율을 보였다. 3시

(7)

e a

b

d

c c

0 20 40 60 80 100 120

iNOS levels (% of LPS control) .

A

−

− +

− + 1 h

+ 2 h

+ 3 h

+ 4 h

c c

d b a

e 0 20 40 60 80 100 120

COX-2 levels (% of LPS control) .

B

−

− +

− + 1 h

+ 2 h

+ 3 h

+ 4 h

c c

d b a

e 0 20 40 60 80 100 120

IL-1β levels (% of LPS control) .

C

−

− +

− + 1 h

+ 2 h

+ 3 h

+ 4 h

c c

d b a

e 0 20 40 60 80 100 120

IL-6 levels (% of LPS control) .

D

−

− +

− + 1 h

+ 2 h

+ 3 h

+ 4 h

Fig. 5. Effect of hot water extract from Geranium thunbergii at different time on iNOS (A), COX-2 (B), IL-1β (C), and IL-6 (D) mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated with sample (10 μg/mL) and LPS (0.5 μg/mL) for 24 h. The results were expressed as the mean±SD of triplicate determinations. Different letters above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

간과 4시간 추출물은 IL-1β에서는 약 50%의 억제율을, IL-6에서는 60%의 동일한 억제율을 나타내어 중간 수준의 억제 효과를 나타내었다. 염증매개인자의 발현에 대한 추출 시간별 현초 열수 추출물의 영향을 평가한 결과 iNOS, COX-2와 염증성 cytokines의 mRNA 발현에 대한 영향은 유사한 경향을 나타내며 2시간 추출물이 동일하게 가장 우 수한 항염증 활성을 나타냄을 확인하였다. Kim 등(28)은 흰 민들레 열수 추출물의 항염증 효과를 조사한 연구에서 추출 물 250 μg/mL 이상의 농도에서 IL-1β와 IL-6의 mRNA 발현이 50% 이상 억제됨을 보고하였으며, Kim 등(29)은 블루베리 잎을 70% acetone으로 추출한 시료의 염증 인자 mRNA 발현에 대한 영향을 조사한 결과 추출물 100 μg/mL 의 농도에서 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6의 발현을 각각 86.8%, 85.7%, 62.7%, 77% 억제하는 결과를 보여, 이들 천연 추출물의 항염증 활성 농도와 비교할 때 현초 열수 추 출물은 상당히 낮은 농도에서 염증 인자의 발현을 효과적으 로 억제하는 것을 알 수 있다. 본 연구에서 현초의 열수 추출 온도 및 시간에 따른 추출 수율, kaempferol 함량, 항산화 및 항염증 활성을 평가한 결과 90°C, 2시간 추출 조건에서 가장 우수한 결과를 나타내었으며, 향후 현초 열수 추출물은 다양한 후속 실험을 통해 산업적 경제성이 우수한 천연 항산 화 및 항염증 소재로서 개발이 기대된다.

요 약

본 연구에서는 현초 열수 추출물의 주요 플라보노이드 성분 을 분석하고, 열수 추출 조건에 따른 추출물의 항산화 및 항염증 활성을 조사하였다. 현초 열수 추출물의 HPLC 분석 결과 quercetin과 kaempferol이 검출되었으며, kaemp- ferol이 가장 함량이 많은 성분으로 확인되었다. 현초를 50

°C, 70°C, 90°C의 온도에서 각각 1시간 동안 열수 추출한 후 추출물의 추출 수율, kaempferol 함량, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, NO 생성 억제능을 측정하였다. 모든 평가 항목에서 90°C 열수 추출물이 유의적으로 우수한 결과를 나타내어, 추출 온도를 90°C로 선정한 다음 추출 시간에 따 른 평가를 진행하였다. 90°C에서 각각 1, 2, 3, 4시간 열수 추출한 추출물의 수율은 1시간 추출물의 12.5%에 비해 2시 간 이상의 추출에서 16.5~17.0%로 높게 측정되었다. Kaemp- ferol 함량은 2시간 추출에서 1.40 mg/g으로 가장 높은 함 량을 나타내었으며, 이후 추출 시간이 증가할수록 감소하여 4시간 추출에서 0.92 mg/g의 함량을 나타내었다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과 12.5 μg/mL의 농도에서 1시간 추출물은 각각 36.4%와 35.4%의 소거능을 나타냈으 나, 2시간 추출물은 각각 48.2%와 48.1%의 더 높은 소거능 을 나타내었으며, 2~4시간 추출물에서 유의적인 차이는 나

(8)

타나지 않았다. LPS로 NO 생성을 유도한 대식세포에 추출 시간에 따른 열수 추출물을 10 μg/mL로 처리하여 NO 생성 억제능을 비교한 결과 LPS 처리군에 비해 1시간 추출물은 35%의 억제율을 보였으나, 2~4시간 추출물은 67~68%의 2배 정도 높은 억제율을 나타내었다. 추출시간에 따른 현초 열수 추출물의 항염증 활성을 염증매개인자의 mRNA 발현 억제 효과로 비교하였다. 열수 추출물 10 μg/mL의 농도에 서 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6의 mRNA 발현 억제율은 2시간 추출물에서 각각 76%, 66%, 76%, 79%로 가장 높은 억제 효과를 나타내었다.

감사의 글

본 연구는 산업통상자원부 경제협력권산업육성사업(R000 5793)으로 수행한 연구의 일부로 이에 감사드립니다.

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