PPAR-γ Agonist Attenuates Myocardial Fibrosis in a Type 2 Diabetic Rat Model

883

제 2 형 당뇨병 실험쥐 모델에서 PPAR-γ Agonist의 심근 섬유화 억제 효과

가톨릭대학교 의과대학 내과학교실

임상현·장기육·김범준·김희열·백상홍·윤호중·승기배·김재형·홍순조·최규보

PPAR-γ Agonist Attenuates Myocardial Fibrosis in a Type 2 Diabetic Rat Model

Sang-Hyun Ihm, MD, Ki-Yuk Chang, MD, Pum Joon Kim, MD, Hee-Yeal Kim, MD, Sang-Hong Baek, MD, Ho-Joong Youn, MD, Ki-Bae Seung, MD,

Jae-Hyung Kim, MD, Soon-Jo Hong, MD and Kyu-Bo Choi, MD

Department of Internal Medicine, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea

ABSTRACT

Background and Objectives：Receptor for advanced glycosylation end product (RAGE) plays an important role in the development of myocardial fibrosis in diabetics. Activation of peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)-γ agonist, rosiglitazone, reduces the RAGE expression. We investigated whether rosiglitazone could prevent left ventricle (LV) diastolic dysfunction and attenuate the myocardial fibrosis in a type 2 diabetic rat model. Materials and Methods：Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats were treated with ro- siglitazone (20 mg/kg/d) for 20 weeks. At the age of 20 and 40 weeks, all rats underwent intraperitoneal glucose tolerance tests, hemodynamic studies and Doppler echocardiography. At the age of 40 weeks, the hearts were examined by performing histopathological and immunohistochemical analyses. Results：At the age of 40 weeks, rosiglitazone significant improved the parameters of the LV diastolic function such as the E/A ratio (treated vs.

untreated: 1.7±0.1 vs. 1.5±0.1, p<0.05), the deceleration time and the isovolumic relaxation time in the OLE- TF rats, and this was correlated histologically to the reduced LV collagen volume fraction in the rosiglitazone- treated OLETF rats (3.2±1.3% vs. 5.7±2.0%, respectively, p<0.001). Rosiglitazone also significantly reduced the percentage of staining of the LV CTGF (7.4±2.5% vs. 15.4±4.7%, respectively, p<0.001) and RAGE (1.1

±0.4% vs. 2.0±0.8%, respectively, p<0.001), as compared with the untreated OLETF rats. Conclusion：These results suggest that rosiglitazone could prevent LV diastolic dysfunction and attenuate myocardial fibrosis in type 2 diabetic rats by its inhibition of the RAGE and CTGF expression. PPAR-γ agonist may provide a potential therapeutic approach for diabetic heart disease. (Korean Circulation J 2005;35:883-890)

KEY WORDS： Diabetes；Fibrosis；PPAR-γ；Growth factors；RAGE.

서 론

심실의 심근 섬유화(myocardial fibrosis)는 간질의 섬유 화(interstitial fibrosis)와 혈관주위 섬유화(perivascular

fibrosis)로 구성되며, 좌심실 비대와 당뇨병성 심근증(dia- betic cardiomyopathy) 및 심근경색후 재형성 등의 주된 원인으로 작용한다.

그 중에서 당뇨병성 심근증은 동맥경화나 관동맥질환 그 리고 판막성 심질환이 없이 발생하는 질환으로 당뇨병 환 자에서 울혈성 심부전의 중요한 원인 질환이다.

이러한 당 뇨병성 심근증은 심근의 섬유화가 주 원인으로 초기에는 좌 심실의 이완기능 부전이 발생하고, 이후 수축기능의 장애가 오면서 심부전이 발생하는 과정을 겪는다.

논문접수일：2005년 19월 27일 심사완료일：2005년 11월 13일

교신저자：장기육, 480-130 경기도 의정부시 금오동 65-1번지 가톨릭대학교 의과대학 내과학교실

전화：(031) 820-3203·전송：(031) 821-4471

E-mail：[email protected]

일반적으로 좌심실의 심근 섬유화는 TGF-β1의 섬유아세 포(fibroblast) 자극에 의한 콜라겐의 축적에 의해 형성된다.

하지만 당뇨병에 의한 심근 섬유화는 이외에도 고인슐린혈 증, 최종 당화 산물인 advanced glycosylation end products (AGEs), 그리고 AGE의 수용체인 receptor for advanced glycosylation end products(RAGE)의 발현 등이 중요한 원인일 것으로 생각한다.

특히 AGEs는 증가된 당에 의한 산화작용 및 비효소학적 인 당화(non-enzymatic glycosylation)에 의해 형성되는 물 질로 다양한 당뇨병성 합병증을 일으키며, 심근의 섬유화에 도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이러한 AGEs 는 특이 수용체를 통해 섬유화나 혈관생성을 촉진하는 con- nective tissue growth factor(CTGF)를 활성화 시키는데 이 과정에 병적인 재형성 및 구조 변화가 발생한다.

이 특 이 수용체 중에 하나가 RAGE인데, 당뇨병이 있는 혈관이나 신장에서 그 발현이 증가되며,

최근 연구에 의하면 당뇨 병이 있는 심장에서도 이 RAGE 발현이 증가되고 이 RAGE 는 AGEs와는 독립적으로 재형성에 관여하여 CTGF등의 인 자를 통해 심근 섬유화를 증가시킨다.

반면 당뇨병 치료 제인 PPAR-γ agonist가 혈관 내피세포에서 RAGE 발현 을 억제하는 것으로 알려져 있다.

Peroxisome proliferator activated receptor(PPAR)-γ 는 핵수용체로서 주로 지방세포와 근육 및 혈관에 위치하 여 rosiglitazone등의 agonist에 의해 활성화되어 인슐린 저 항성을 개선시키거나 항염증작용을 통해 동맥경화를 감소 시키는 등의 작용을 한다.

이외에 PPAR-γ agonist는 혈 관 및 신장 사구체에서 TGF-β1 및 CTGF 활성을 억제하여 동맥경화와 섬유화를 감소시킨다는 보고가 있었으며,

폐의 섬유아세포나 간의 stellate 세포에서 콜라겐 생성을 억 제하는 치료 약제로 in vitro와 in vivo에서 증명되어졌다.

하지만 PPAR-γ agonist와 심근 섬유화와의 연관성은 명 확하지 않았으나, PPAR-γ agonist 사용으로 당뇨병에 의 한 좌심실 이완기능의 부전을 개선시키는 효과

가 있는 것 으로 보아서, PPAR-γ agonist가 심근 섬유화의 억제 기능 이 있을 것으로 추정 할 수 있으나 정확한 기전에 관한 연구 는 없었다.

그러므로 본 저자는 PPAR-γ agonist인 rosiglitazone을 사용하여 제 2 형 당뇨병 실험쥐에서 심근 섬유화의 억제 효과를 알아보고자 하였으며, 그와 함께 심근에서 rosiglita- zone이 RAGE의 발현을 억제하여 CTGF의 활성화를 억제 하는지 상호 관련성을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 Rosiglitazone 투약

실험쥐로는 제 2 형 당뇨병 쥐 모델인 Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty(OLETF)쥐와 비당뇨 대조군인

Long-Evans Tokushima Otsuka(LETO)쥐를 일본 Otsuka 연구소(Tokushima, Japan)에서 5주령때 제공받아 20주령 까지 가톨릭대학교 의과학연구소 동물실험실에서 표준사료 를 사용하여 사육하였다. 생후 20주에 OLETF쥐 20마리를 치료군 10마리(Treated-OLETF, n=10)와 비치료군 10마리 (OLETF, n=10)로 나누고 대조군인 LETO쥐는 10마리(LETO, n=10)를 실험대상으로 하였다. OLETF쥐 중에 치료군에 ro- siglitazone(GlaxoSmithKline, Worthing, West Sussex, UK) 을 20주령에서부터 40주령까지 20주 동안 20 mg/kg/day 의 용량으로 증류수에 섞어 위관 영양도관(gavage tube)을 이용하여 투약하였고, OLETF쥐 중 비치료군이나 대조군인 LETO쥐에는 위관 영양도관을 이용하여 증류수를 치료군과 동일한 양으로 투입하였다. 모든 쥐에서 표준사료를 먹여 사 육하고 매주 8시간 금식 후 체중을 측정하여 변화된 체중을 기준으로 rosiglitazone용량 및 증류수 양을 다시 계산하여 투약하였다.

체중, 혈역학적 검사 및 복강내(Intraperitoneal) 당부하검사 모든 쥐는 약물 투약 직전 20주령에 12시간 금식 후 안 정 상태에서 오전에 꼬리에서 tail-cuff plethysmography (BP-2000, Visitech system, Apex, NC)를 이용하여 혈압 과 맥박을 측정하였다. 약물 투여 20주 후인 40주령에 다시 같은 방법으로 모든 쥐에서 체중, 혈압 및 맥박을 측정하였 다. 복강내 당부하검사는 12시간 금식 후 오전 8시경에 실 시하였으며, 대상 쥐들을 에테르로 마취한 후 2 g/kg양의 25% 포도당 용액을 주사기를 통해 복강내 투입하였다. 당 부하전과 당부하 후 30분, 60분, 90분, 120분에 꼬리 정맥 에서 채혈을 한 후 원심분리하여 혈장 분리한 후 Beckman Lucose Analyzer(Beckman instrument Co., Palo Alto, CA) 를 이용하여 혈당을 측정하였다.

심장초음파

모든 쥐를 약물 투약전 20주령과 실험 종료 시점인 40주

령에 심장초음파를 시행하였다. Ketamine(50 mg/kg)과 xy-

lazinne(10 mg/kg)으로 복강내 주사하여 전신 마취 후 흉

부에 면도를 시행하여 15 MHz의 고주파 탐촉자(Acuson,

Sequoia 256, Mountain View, CA)를 사용하여, 이면성 및

M-mode 심초음파 검사를 시행하였다. 좌심실의 수축기

(LVESD)와 이완기말 좌심실 내경(LVEDD) 및 좌심실 내경

분획률(Fractional Shortening, FS(%))을 측정하였다. 간

헐 파형 Doppler를 이용하여 좌심실 유입혈류의 이완기 초

기 최고 혈류 속도(E속도), 이완기 후기 최고 혈류 속도(A속

도), 감속시간(DT: Deceleration Time) 및 좌심실 등용적

이완기 시간(IVRT: Isovolumic Relaxation Time)을 좌심실

이완기 평가지수로 측정 하였다. 모든 값은 3번 측정하여

그 평균치를 수치로 하였다.

조직학적 검사

40주령에 모든 실험쥐를 약물 투약과 모든 검사가 끝난 후 ketamine(75 mg/kg)과 xylazine(10 mg/kg)을 복강내 로 주사하여 마취한 뒤, 개흉한 후 potassium chloride를 심장내 주사하여 이완기에 심정지 시킨 후 심장을 적출 하 였다. 분리된 심장을 횡단면으로 3부분으로 나누어 꼭지근 (papillary muscle) 층인 좌심실 중간 부위를 phosphate- buffered formalin용액에 24시간 고정하였다가, 파라핀에 포매한 뒤 4 μm의 조직박편을 만들었다. 만들어진 각 실 험쥐 마다 2개의 조직 박편을 콜라겐 특이적인 picrosirius red염색을 시행하였다.

면역조직화학적 염색(immunohistochemical stain) 역시 각 염색 당 2개의 조직 박편에 염색을 시행하였다. 면역조직 화학적 염색은 상용화된 CTGF 항체(rabbit polyclonal anti- body to CTGF; Abcam Inc., Cambridge, MA)와 RAGE 항체(rabbit polyclonal antibody to RAGE; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 사용하여 염색하였다.

모든 슬라이드는 100배와 200배로 관찰하였고, 그 중 각 특이적 염색에 의해 염색되어진 부위를 무작위로 3곳을 선 택하여, 컴퓨터 영상 분석프로그램(Image pro plus, Image processing solution, Media Cybernetics, Silver Spring, MD)을 사용하여 정량 분석하였다.

통 계

통계 분석은 SPSS software program(SPSS 10.0)을 이 용하였다. 모든 측정치는 평균±표준편차로 표시하였으며, 각 군간의 비교는 student t-test와 ANOVA를 이용한 통 계적 분석을 시행하였다. 모든 통계값에서 0.05 미만인 경 우 통계적 의의가 있는 것으로 하였다.

결 과

체중, 혈역학적 수치 및 당부하검사 결과

Rosiglitazone 투약 전 20주령때 이미 OLETF쥐는 대부 분 대조군인 LETO쥐와 비교하여, 당부하검사에서 당뇨병 이 발생하였고 체중도 증가되어 있었다. 그런데 20주간의 rosiglitazone 치료가 있은 후 40주령때 LETO쥐에 비해 치 료군과 비치료군 OLETF쥐에서 모두 체중이 유의하게 증가 되어 있었다(p<0.05). 복강내 당부하검사 결과에서 당부하 2시간후 시행한 혈당은 대조군인 LETO쥐에서는 139±11 mg/dl이었고, OLETF쥐 중에 rosiglitazone 치료군은 240

±47 mg/dl, 비치료군은 325±93 mg/dl으로 OLETF쥐에 서 보다 높은 혈당을 보였으며, OLETF쥐에서 rosiglitazone 치료를 받은 군이 비치료군에 비해서 통계적으로 의의있게 혈당이 감소되어 있었다(p<0.05)(Table 1).

혈역학적 검사 결과에서는 20주령 때에는 LETO, 치료와 비치료 OLETF군 세 군에서 혈압과 맥박에는 차이가 없었

다. 그리고 혈압 지표중 수축기 혈압에서는 LETO군이 118

±9 mmHg로 rosiglitazone 치료 및 비치료 OLETF군(137

±19 mmHg, 135±10 mmHg)에 비해 유의하게 낮았다(p<

0.05). 그러나 OLETF쥐 중에 rosigiltazone 치료군과 비치 료군에서는 수축기 혈압을 비롯하여 이완기와 평균 혈압 모 두 두 군간에 차이가 없었다(p>0.05)(Table 2).

심초음파 결과

치료 시작 전인 20주령 때 시행한 심초음파 결과 좌심실 의 수축 및 이완기 내경, 좌심실 내경 분획률과 좌심실 이완 기능을 의미하는 승모판 유입 혈류의 도플러 심초음파 지표 는 LETO군과 치료와 비치료 OLETF군 세 군간에 차이가 없었다(Table 3).

치료가 완료된 후 40주령에 시행한 심초음파에서는 좌심 실 수축기능의 지표인 좌심실의 수축 및 이완기 내경, 좌심 실 내경 분획률은 세 군간에 차이가 없었으나, 좌심실 이완 기능을 의미하는 승모판 유입 혈류의 도플러 지표 중에서 E속도와 A속도는 비치료 OLETF군이 LETO군에 비해 감소 되어 있었고, rosiglitazone 치료 OLETF군에 비해서도 감소

Table 1. Body weight and glucose tolerance test LETO

(10)

OLETF (10)

Treated OLETF (10) 20 week (before treatment)

Body weight (g) 491±22 530±59* 537±46*

Fasting glucose (mg/dL) 93±5 116±18* 114±33*

PP2hr glucose (mg/dL) 119±12 218±57* 223±54*

40 week (after treatment)

Body weight (g) 539±33 676±72* 788±119*

Fasting glucose (mg/dL) 102±50 193±35* 137±37*

0 PP2hr glucose (mg/dL) 139±11 325±93* 240±47*

0 Data are expressed as mean±SD. Treated OLETF: OLETF rats with rosiglitazone, PP2hr: 2 hours blood glucose level after glucose loading, LETO: long-evans tokushima otsuka, OLETF: otsuka long- evans tokushima fatty. *: p<0.05 vs. LETO rats. †: p<0.05 vs. OL- ETF rats

Table 2. Hemodynamic data LETO

(10)

OLETF (10)

Treated OLETF (10) 20 week (before treatment)

Systolic BP (mmHg) 117±11 120±90 123±15 Diastolic BP (mmHg) 084±15 094±70 92±9 Mean BP (mmHg) 097±14 102±80 103±11 Heart rate (beats/min) 417±32 388±190 401±33 40 week (After treatment)

Systolic BP (mmHg) 118±9 135±10* *137±10*

Diastolic BP (mmHg) 098±11 091±60 093±12

Mean BP (mmHg) 085±11 106±700 107±11

Heart rate (beats/min) 425±63 379±610 390±50

Data are expressed as mean±SD. Treated OLETF: OLETF rats

with rosiglitazone, BP: blood pressure, LETO: long-evans toku-

shima otsuka, OLETF: otsuka long-vans tokushima fatty. *: p<0.05

vs. LETO rats.

되어 있었다(p<0.05). E/A비에서는 LETO군에서는 1.7±0.1, 비치료 OLETF군과 rosiglitazone 치료 OLETF군은 각각 1.5±0.1, 1.7±0.1로 rosiglitzaone 치료를 받은 OLETF군 이 비치료 OLETF군에 비해 높았으나(p<0.05) 대조군인 LETO군과는 차이가 없었다. 그리고 지속시간(DT) 및 좌심 실 등용적 이완기 시간(IVRT)에서도 rosiglitazone을 치료 받은 OLETF군이 비치료군에 비해 감소되어 있었으나 대조 군인 LETO군에 비해서는 차이가 없었다(Table 3)(Fig. 1).

그러므로 rosiglitazone을 치료 받은 당뇨병 쥐에서 그렇지

않은 당뇨병 쥐에 비해 수축기 기능은 차이가 없었으나 이 완기 기능의 개선을 관찰 할 수 있었다.

심근 섬유화의 정량

콜라겐에 특이적인 picrosirius 염색으로 좌심실의 섬유화 정도를 비교한 결과, rosiglitazone 치료를 받은 OLETF쥐 가 비치료 OLETF쥐에 비해 간질조직의 섬유화가 현저히 감 소되어 있었으나, 대조군인 LETO쥐에 비교해서는 큰 차이 가 없었다(Fig. 2A). 그리고 섬유화 정도를 정량화 하기위 해 염색한 심근 조직을 컴퓨터 영상 분석프로그램을 이용 해 측정한 콜라겐 용적 분획률(Collagen Volume Fraction, CVF)은 LETO군에서 2.6±0.8%, 비치료 OLETF군에서 5.7

±2.0%, rosiglitazone 치료 OLETF군에서는 3.2±1.3%로 서, rosiglitazone 치료 OLETF군은 비치료 OLETF군에 비 해 CVF이 유의하게 감소되었으나(p<0.001), LETO군과는 통계적으로 의의있는 차이를 보이지 않았다(Fig. 2B).

좌심실의 CTGF와 RAGE의 면역조직화학적 염색 결과

섬유아세포를 자극하는 섬유화 촉진인자인 CTGF의 발현 을 알아보기 위해 좌심실 심근조직에서 시행한 CTGF 단백 질의 면역조직화학적 염색에서 비치료 OLETF쥐에서 CTGF 단백질의 발현이 심근 간질부위와 혈관주변 간질조직 및 혈관 내피세포등에 증가되어 있었으나, rosiglitazone 치료 OLETF쥐에서는 그 정도가 감소되었고 LETO쥐에서는 그 정도가 현저히 감소되었다(Fig. 3). 당뇨병 합병증의 원인 물 질인 AGEs의 수용체중에 하나인 RAGE의 발현 정도를 알아 보기 위한 RAGE 단백질의 면역조직화학적 염색에서는 RAGE 단백질의 발현이 주로 좌심실 심근의 간질부위와 혈관 내피 세포 및 혈관 중막(media)에 두드러졌고, 비치료 OLETF쥐 가 가장 증가되어 있었고, 그 다음으로 rosiglitazone 치료 OLETF쥐, LETO쥐 순으로 관찰되었다(Fig. 4).

좌심실의 CTGF와 RAGE 단백질 발현 정도를 정량화하여 백분율로 계산한 결과, CTGF 단백질은 rosiglitazone 치료

Table 3. Echocardiographic data LETO

(10)

OLETF (10)

Treated OLETF (10) LVEDD (mm) Baseline 8.0±0.8 7.9±0.6 8.1±0.7 After Tx. 8.4±0.7 7.9±0.6 8.4±0.7 LVESD (mm) Baseline 4.1±0.4 3.7±0.6 3.7±0.6 After Tx. 4.1±0.8 4.2±0.6 3.5±1.2 FS (%) Baseline 53±20 53±70 55±40

After Tx. 52±50 51±40 55±30

E (cm/s) Baseline 78±13 74±90 74±50

After Tx. 84±20 63±6* 82±6

A (cm/s) Baseline 48±10 51±10 44±60

After Tx. 84±40 43±5* 50±1

E/A ratio Baseline 1.6±0.2 1.5±0.2 1.7±0.2 After Tx. 1.7±0.1 01.5±0.1* 01.7±0.1

DTE (ms) Baseline 43±11 46±80 50±10

After Tx. 49±20 59±9* 50±3

IVRT (ms) Baseline 25±30 23±50 24±20

After Tx. 27±40 35±3* 29±3

Data are expressed as mean±SD. LETO: long-evans tokushima otsuka, OLETF: otsuka long-evans tokushima fatty, Treared OLETF:

OLETF rats with rosiglitazone, After Tx.: after treatment with ro- siglitazone, LVEDD: LV end-diastolic dimension, LVESD: LV end- systolic dimension, FS: Fractional Shortening of LV diameter, E:

peak velocity of early transmitral inflow, A: peak velocity of late transmitral inflow, DTE: deceleration time, IVRT: isovolumic relaxation time. *: p<0.05 vs. LETO rats. †: p<0.05 vs. OLETF rats

Fig. 1. Comparison of left ventricular mitral inflow patterns at the age of 40 weeks. Early to late diastolic peak velocity (E/A) ratio was reduced and deceleration time (DT) of early diastolic inflow was increased in the OLETF rats (middle). These were normalized in the rosiglitazone- treated OLETF rats (right). LETO: long-evans tokushima otsuka, OLETF: otsuka long-vans tokushima fatty, Treated OLETF: OLETF rats with rosiglitazone.

100 cm/s 200 msec

LETO OLETF Treated OLETF

OLETF군이 7.4±2.5%로 비치료 OLETF군 15.4±4.7%에 비해 유의하게 감소되었으나(p<0.001), 대조군인 LETO군 3.4±1.5%에 비해서는 증가된 결과를 보였다(p<0.001)(Fig.

3). 그리고 RAGE 단백질 역시 rosiglitazone 치료 OLETF 군이 1.1±0.4%로 비치료 OLETF군 2.0±0.8% 보다는 감 소되었으나(p<0.001), LETO군 0.2±0.1% 보다는 증가되 었다(p<0.001)(Fig. 4).

고 찰

당뇨병성 심근증은 당뇨병 환자에서 울혈성 심부전의 중 요한 원인 질환이며, 그 기전으로 심근의 섬유화가 주된 역 할을 한다.

당뇨병 환자에서 좌심실의 심근 섬유화를 퇴축시키는 치 료는 심부전을 포함한 다양한 심질환의 예방에 중요하므로 과거에서부터 많은 동물실험이 이루어졌으나, 아직까지 임 상에 적용이 용이하지는 않다.

최근 인슐린 저항성을 개 선시키는 PPAR-γ agonist는 당뇨병 치료제로 쓰이는 약 제로서 부가적으로 다양한 항염증 및 항응고 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 PPAR-γ agonist는 혈관 및 신장 사구체에 TGF-β1 및 CTGF 활성을 억제하여 섬유화 를 억제한다.

과거 PPAR-γ agonist을 이용한 심근의 섬유화 억제를

LETO

100 µm OLETF Treated OLETF

*

Fig. 2. A: representative micrographs of myocardium with picrosi- rius red stain at 40 weeks. Fibrosis was detected by picrosirius red stain that produces a red color. Myocardial fibrosis was greater in the OLETF rat (middle) than in the LETO rat (left) and the rosig- litazone-treated OLETF rat (right). Magnification ×100. B: LV collagen volume fraction (CVF) in LETO, untreated OLETF and treated OLEFT rats. LETO: long-evans tokushima otsuka, OLE- TF: otsuka long-evans tokushima fatty, Treated OLETF: OLETF rats with rosiglitazone. Value are expressed as mean±SD. *: p<0.01 vs.

LETO rats, †: p<0.01 vs. OLETF rats.

LV Collagen volume fraction (%)

0 1 2 4 5 6 7 8 9

3

Treated OLETF OLETF

LETO

†

B A

a e

b f

c g

100 µm

d

100 µm

h

0 5 10 15 20 25

LETO OLETF Treated OLETF

LV CTGF staining (%)

*

†

*

Fig. 3. A: immunohistochemical stainings for CTGF in LV sections (a through d) and perivascular structure (e through h) from the negative control (a and e), LETO (b and f), OLETF (c and g), and rosiglitazone-treated OLEFT (d and h) rats. Antibodies were detected by diami- nobenzidine method that produces a brown color (arrow). Counter-staining of nuclei was done with hematoxylin (blue). Magnification ×200.

B: LV CTGF stainings (%) in LETO, untreated OLETF and treated OLEFT rats. LV: left ventricle, CTGF: connective tissue growth factor, LETO: long-evans tokushima otsuka, OLETF: otsuka long-evans tokushima fatty, Treated OLETF: OLETF rats with rosiglitazone. Value are expressed as mean±SD. *: p<0.01 vs. LETO rats, †: p<0.01 vs. OLETF rats.

A

B

보고한 논문은 Yao 등

이 최초로 발표하였으나, 이는 제 2형 당뇨병 실험쥐 모델에서 당뇨병이 발생하기 전인 5주 령부터 PPAR-γ agonist를 투약하였으므로 당뇨병의 발생 에 영향을 미쳤을 것으로 생각되며, 그 기전에 대한 해석이 부족하였다.

그 외에 PPAR-α agonist와 함께 고혈압 실험쥐에서 섬 유화 억제 효과를 보고한 연구

와 실험적 심근경색 모델에 서 좌심실 재형성 억제 효과를 보고한 연구

는 있었으나, 이미 당뇨병이 발생한 동물 모델에서 좌심실 심근에서 섬 유화 억제와 그 기전에 관해 보고한 논문은 아직은 없었고, 단지 당뇨병 실험쥐 모델에서 좌심실 이완기능의 개선을 보고한 논문만이 있었다.

그러므로 본 저자는 제 2 형 당뇨병 실험쥐 모델인 OLETF 쥐를 대상으로 PPAR-γ agonist인 rosiglitazone으로 당뇨 병으로 인한 좌심실 섬유화의 억제효과와 그 기전에 대해 알아보고자 하였다.

Mizushige 등

의 연구에 따르면 당뇨병 실험쥐인 OLETF 쥐는 생후 15주경부터 고혈당이 발생하고 서서히 심근 섬유 화도 진행되며, 그에 따라 좌심실 이완기능의 장애도 일어 난다고 보고하였다. 본 연구에서도 OLETF쥐는 20주경에 이 미 대부분 당뇨병이 발생하였으며 체중도 대조군인 LETO 에 비해 증가된 경향을 보였다.

심초음파 검사에서는 20주령과 40주령 모두 수축기능에

는 큰 차이가 없었고, 이완기능에서도 20주령때는 세 군간 에 차이가 없었다. 그러나 40주령때는 좌심실 이완기능에 관 련된 모든 지표가 rosiglitazone 치료군이 그렇지 않은 OL- ETF군에 비해 LETO와 거의 비슷한 정도로 개선되어, 과거 Kim 등

의 연구결과와 비슷하였다. 반면 심근의 섬유화 정 도를 알아보기 위해 콜라겐에 특이적인 염색을 통해 콜라 겐 용적 분획률(CVF)을 비교한 결과, 비치료 OLETF에서는 CVF가 현저히 증가되어 있었으나, rosiglitazone 치료를 시 행한 결과 LETO와 비슷한 정도로 감소되어 있었다.

섬유화와 관련된 cytokine중 당뇨병과 관련되어 심근 섬 유화의 촉진 인자로 알려져 있는 CTGF

와 AGEs에 대한 수용체로 당뇨의 합병증 때 그 발현이 증가되는 RAGE

를 면역조직생화학 염색한 결과, 비치료 당뇨병 쥐에서 CTGF 와 RAGE 단백질의 발현이 심근 간질조직과 혈관의 주변조 직 그리고 혈관 내피세포에 증가되어 있었으며, rosiglita- zone을 치료한 군에서 그 정도가 비치료군에 비해 현저히 감 소되어 있었다. 이는 rosiglitazone이 AGEs의 수용체인 RA- GE 발현을 억제하고 CTGF 발현이 저하되어 심근의 섬유화 를 억제하고 콜라겐의 교차고리의 형성을 억제한 것으로 생 각된다.

일반적으로 TGF-β1이 심근의 섬유화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

최근 강력한 섬유화 촉진 인자 인 CTGF는 세포외 기질의 생성 및 혈관 생성에 TGF-β1

Fig. 4. A : immunohistochemical stainings for RAGE in LV sections (a through d) and perivascular structure (e through h) from the negative control (a and e), LETO (b and f), OLETF (c and g), and rosiglitazone-treated OLEFT (d and h) rats. Antibodies were detected by diaminobenzidine method that produces a brown color (arrow). Counter-staining of nuclei was done with hematoxylin (blue). Magnification

×200. B: LV RAGE stainings (%) in LETO, untreated OLETF and treated OLEFT rats. LV: left ventricle, RAGE: receptor for advanced glycation end product, LETO: long-evans tokushima otsuka, OLETF: otsuka long-evans tokushima fatty, Treated OLETF: OLETF rats with rosiglitazone. Value are expressed as mean±SD. *: p<0.01 vs. LETO rats, †: p<0.01 vs. OLETF rats.

c a

b

100 µm

d

e

f

g

100 µm

h

*

†

*

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

LETO OLETF Treated OLETF

LV RAGE staining (%)

B

A

에 의한 자극에 의해 형성되어, 섬유아세포를 직접 자극하 여 콜라겐 축적을 유도한다.

그러나 당뇨병에 의한 심혈 관 합병증의 원인인 심근의 섬유화에는 TGF-β1과는 무관 한 경로를 통해 이루어지며, 이 과정에 CTGF와 AGEs가 밀 접한 관련을 갖는다.

그러므로 본 연구 결과에서 당뇨 병 심근의 섬유화에는 CTGF가 AGEs와 더불어 중요한 역 할을 한 것으로 생각된다.

본 논문은 제 2 형 당뇨병 실험쥐에서 PPAR-γ agonist 인 rosiglitazone으로 치료하여 심근의 섬유화를 억제하고 좌심실 이완기능의 개선을 보여준 최초의 논문으로, 그 기 전으로 RAGE 발현의 감소로 인한 CTGF 발현의 억제에 따 른 것으로 생각된다.

본 논문은 몇 가지 제한점이 있다. 첫째로 직접적으로 혈 중 AGEs를 측정하지 못하였기 때문에 rosiglitazone이 혈 당 강하와 함께 얼마나 AGEs에 영향을 미치는지는 알 수 가 없었다. 그러나 혈당의 강하가 어느 정도 AGEs의 감소를 가져올 것으로 기대되나, 그것이 심근 섬유화의 감소와 직접 적인 연관성은 없을 것으로 생각된다. 그 이유로 심근 섬유 화의 주된 역할을 하는 수용체인 RAGE는 심장의 재형성에 AGEs와 무관하게 작용하는 것으로 이해한다.

그러므로 심근 섬유화에 있어서는 AGEs의 양이 중요한 것이 아니라, RAGE의 발현 정도가 중요하다 할 수 있다.

두 번째로 CTGF나 RAGE의 면역조직생화학 염색은 시행 하였으나, 이에 대한 유전자 발현을 RT-PCR등의 방법을 통해 정량화 하지 않았다. 하지만 면역조직생화학적 염색법 을 통해 각각의 단백질 발현을 측정하는 방법 역시 신뢰 할 수 있는 방법이라 생각되며 이를 객관화하기 위해 여러 부 위를 영상분석하여 평균하여 사용하였다.

세 번째로 rosiglitazone이 RAGE의 발현을 증가시키는 과 정이 명확하지가 않다. 하지만 Marx 등

의 연구에 따르면 rosiglitazone이 강력한 항염증 작용으로 NF-κB를 억제하 거나 그에 따른 TNF-α에 의한 내피세포의 RAGE 발현을 억제 한다고 주장하였는데 당뇨 쥐의 심장에서 역시 비슷 한 기전에 의할 것으로 생각되나 in vitro를 통한 연구가 실 행되어져야 할 것으로 생각된다.

그리고 본 연구에서 시행한 RAGE는 결국 여러 가지 AGEs 에 대한 수용체중에 하나이기 때문에 모든 수용체를 대변 할 수는 없다는 제한점이 있으나, RAGE가 다른 수용체에 비 해 심혈관계 발현이 보다 증가하므로,

심근에서의 AGEs 특이 수용체로 적합하리라 생각된다.

결론적으로 본 연구에서 PPAR-γ agonist인 rosiglita- zone은 당뇨병성 심근증의 초기 징후인 좌심실 이완기능의 개선과 함께 좌심실 심근의 섬유화를 억제하였고, 심근에 서 CTGF와 같은 섬유화 촉진 cytokine이나 당뇨병의 합병 증에 주된 작용을 하는 RAGE의 발현을 감소시켰다.

이러한 결과는 당뇨병성 심근증이나 기타 당뇨병에 의한

심장의 변화에 대한 기전을 알아내는데 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.

요 약

배경 및 목적 :

Receptor for advanced glycosylation end products(R- AGE)는 당뇨병에서 최종 당화 산물인 advanced glycosyla- tion end products(AGEs)를 활성화 시켜 심근 섬유화를 유 발한다. Peroxisome proliferator activated receptor(PP- AR)-γ agonist인 rosiglitazone은 인슐린 저항성의 개선 제이면서 항염증 작용이 있으며 혈관 내피세포에서 RAGE 발현을 억제한다. 본 연구의 목적은 rosiglitazone이 제 2 형 당뇨병 실험쥐 모델에서 좌심실 이완기능의 개선과 심 근 섬유화의 억제 효과가 있는지 알아보고자 하였다.

방 법 ^：

20주령된 제 2 형 당뇨병 모델인 Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)쥐 20마리를 rosiglitazone(20 mg/kg/d) 치료군 10마리와 비치료군 10마리로 나누고, 비 당뇨병 대조군인 Long-Evans Tokushima Otsuka(LETO) 쥐 10마리를 실험대상으로 하여 20주 동안 치료하였다. 모 든 실험쥐에서 실험시작 시점인 20주령과 종료시점인 40 주령에 복강내(intraperitoneal) 당부하검사와 혈압 및 맥 박 측정 그리고 심초음파 검사를 하였다. 40주령 때 모든 실 험쥐의 심장을 적출하여 콜라겐 특이적인 picrosirius red 염색을 하였고 connective tissue growth factor(CTGF)와 RAGE에 대한 면역조직화학적 염색을 시행한 뒤 발현의 정 도를 분석하였다.

결 과 ^：

40주령의 당뇨병 쥐에서 시행한 심초음파에서 rosiglita- zone 치료군은 비치료군에 비하여 좌심실 이완기 지표 중 E/A비는 증가하였고(치료군 vs. 비치료군: 1.7±0.1 vs. 1.5

±0.1, p<0.05), 감속시간(DT)과 좌심실 등용적 이완기 시 간(IVRT)은 유의하게 짧아지므로 좌심실 이완기 개선효과가 있었다(치료군 vs. 비치료군; DT: 50±3 vs. 59±9 msec, p<0.05; IVRT: 29±3 vs. 35±3 msec, p<0.05). 그러나 좌심실의 수축기능을 나타내는 지표는 치료 전·후로 세 군 (당뇨병 치료군, 비치료군, 비당뇨병군)간에 차이는 없었다.

심근에서 시행한 picrosirius red 염색 결과 당뇨병 쥐에서

rosiglitazone 치료군은 비치료군에 비하여 콜라겐 용적 분

획률(Collagen Volume Fraction, CVF)은 현저히 감소하여

LETO군과 거의 비슷하였다(치료군 vs. 비치료군: 3.2±1.3

vs. 5.7±2.0%, p<0.001). 또한 면역조직화학적 염색 검사

상 당뇨병쥐에서 rosiglitazone 치료군이 비치료군에 비하

여 CTGF와 RAGE 모두 현저히 감소하였다(치료군 vs. 비

치료군; CTGF: 7.4±2.5 vs. 15.4±4.7%, p<0.001; RAGE:

1.1±0.4 vs. 2.0±0.8%, p<0.001).

결 론 ^：

제 2 형 당뇨병 실험쥐 모델에서 rosiglitazone은 RAGE 와 CTGF 발현을 억제하여 좌심실 이완기능의 개선과 함께 심근 섬유화를 억제하였다. 그러므로 PPAR-γ agonist는 당뇨병 환자에서 심근 섬유화를 억제하여 당뇨병성 심근증 의 예방에 효과가 있을 것으로 기대된다.

중심 단어：당뇨병；섬유화；PPAR-γ；성장인자；RAGE.

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