갈색거저리 유충 단백가수분해물의 제조 및 항산화 활성
유미희*․이효선*․조혜린․이승욱 계명대학교 식품가공학과
Enzymatic Preparation and Antioxidant Activities of Protein Hydrolysates from Tenebrio molitor Larvae (Mealworm)
Mi-Hee Yu*, Hyo-Seon Lee*, Hye-Rin Cho, and Syng-Ook Lee Department of Food Science and Technology, Keimyung University
ABSTRACT The present study was carried out to evaluate the applicability of Tenebrio molitor larvae (mealworm) as a health functional food material in order to contribute to the development of the domestic insect industry and health functional food industry. Protein hydrolysates were prepared from mealworm powder by enzymatic hydrolysis using five different proteases (alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, and papain), and the hydrolysates were then tested for their antioxidant activities. Based on available amino group contents and sodium dodecyl sulphate-poly- acrylamide gel electrophoresis analyses, mealworms treated with alcalase (4,781.39 μg/mL), flavourzyme (5,429.35 μg/mL), or neutrase (3,155.55 μg/mL) for 24 h showed high degree of hydrolysis (HD) value, whereas HD values of bromelain (1,800 μg/mL) and papain-treated (1,782.61 μg/mL) mealworms were much lower. Protein hydrolysates showing high HD values were further separated into > 3 kDa and ≤ 3 kDa fractions by a centrifugal filter system and then lyophilized, and the production yields of the low molecular weight protein hydrolysates (≤ 3 kDa) by alcalase, flavourzyme, and neutrase were 42.05%, 26.27%, and 30.01%, respectively. According to the RC50 values of the protein hydrolysates (≤ 3 kDa) obtained from three different antioxidant analyses, all three hydrolysates showed similar anti- oxidant activities. Thus, alcalase hydrolysates showing the highest production yield of low molecular weight protein hydrolysates were further tested for their inhibitory effects on peroxidation of linoleic acid by measuring thiobarbituric acid values, and the results show that peroxidation of untreated linoleic acid increased dramatically during 6 days of incubation. However, pretreatment with the hydrolysates (100∼800 μg/mL) significantly inhibited linoleic acid peroxidation in a dose-dependent manner over 6 days.
Key words: mealworm, protein hydrolysates, enzymatic hydrolysates, antioxidant activities
Received 14 November 2016; Accepted 7 March 2017
Corresponding author: Syng-Ook Lee, Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 42601, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-53-580-5570
*These authors contributed equally to this work.
서 론
최근 식량부족 문제를 해결하기 위한 정책으로 국제식량 농업기구(FAO)에서는 미래 식량자원으로 식용곤충의 활성 화 방안을 발표하여 전 세계적으로 이에 대한 관심이 증대되 고 있으며(1), 이와 발맞추어 국내에서는 농림수산식품부가
“곤충산업육성 5개년 종합계획”을 발표하여 곤충산업에 대 한 지원이 이루어지고 있다. 곤충은 약 100만 종 이상 보고 되어 있고 100만 종 이상이 아직 보고되지 않은 상태로 남아 있다고 예측될 정도로 지구상에서 가장 크고 다양성이 풍부 한 종으로 알려져 있다(2).
갈색거저리(Tenebrio molitor,mealworm)는 딱정벌레
목 거저리과의 곤충으로 “갈색쌀거저리”라고도 불리며 현 재 한국을 비롯한 전 세계에 분포되어 있으며, 강한 적응력 과 변태기간이 짧고 쉬운 사육기술로 연중 사육이 가능하여 산업화에 용이하다(3). 갈색거저리의 영양성분은 수분이 2
~4%, 조단백질이 50~53%, 조지방 27~34%, 조회분 3~
5%, 조섬유 4~5%이며, 단백질 함량이 매우 높은 고단백질 소재로 2016년 식용곤충 원료로 식품공전에 등록됨으로써 이의 활용에 대한 관심이 높아지고 있다(4). 갈색거저리 유 충의 경우 대두보다 필수 아미노산을 많이 함유하고 있고, 육류보다 불포화지방산 함량이 높으며, 비타민 A와 철, 식이 섬유 등이 비교적 풍부한 편으로 영양적인 장점이 많다(1, 5). 또한, 가축사육과는 달리 곤충사육에 필요한 땅을 개선 할 필요가 없고, 적은 사료만으로도 간편하게 많은 양의 곤 충을 사육하여 보급할 수 있으므로 경제적 부담이 적은 장점 이 있다.
예로부터 곤충은 약용으로 사용해 왔으며, 그중 누에, 메 뚜기, 굼벵이, 지네 등은 당뇨(6-8), 염증성 질환(9), 간질환
(10) 및 동맥경화(11) 등의 만성 질환 치료에 효과적이라는 연구 결과가 보고되고 있다. 한편 국내에서 이루어진 갈색거 저리에 관한 연구로는 갈색거저리 유충 추출물의 간암세포 에 대한 세포 독성 효능(12), 한국산 갈색거저리로부터 분리 된 항진균 단백질의 항균 효과(13) 등 갈색거저리 추출물을 이용한 연구들이 보고되어 있지만 갈색거저리 유충의 생리 활성 펩타이드에 대한 연구는 부족한 실정이다. 생리활성 펩타이드는 일반적으로 생리적 활성을 가지는 분자량이 작 은 펩타이드로 정의되는데(14), 보통 3~20개의 아미노산으 로 구성되어 있고 아미노산의 조성이나 서열에 따라 펩타이 드의 활성이 다양하다(15). 또한, 크기가 작아 생체 내로 쉽 게 흡수될 수 있으며, 다양한 기능적 특성을 갖는 장점이 있다(16). 지금까지 연구된 생리활성 펩타이드의 효과로는 우유단백질 가수분해물의 체내 항산화 기능 향상과 가공 식 품에서의 산화반응 방지(17), 달걀흰자 가수분해물의 새로 운 항균 펩타이드(18) 등이 알려져 있으며, 그 외에도 항고 혈압(19), 항혈전(20), 면역조절(21) 등 생리활성 펩타이드 의 기능성 연구가 활발하게 진행되고 있어 단백질이 풍부한 갈색거저리 유충 단백질의 효소적 가수분해를 통한 생리활 성을 갖는 펩타이드의 생산이 주목받고 있다.
따라서 본 연구에서는 다양한 효소원을 이용하여 갈색거 저리 유충으로부터 생리활성 펩타이드를 함유하는 단백가 수분해물을 제조하였으며, 그중 가수분해도가 우수한 것을 선택하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 및 hydrogen peroxide(H2O2) 소거 활 성과 지질과산화 억제 활성을 측정하여 분리된 단백가수분 해물의 항산화 활성을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
실험재료
본 실험에서 사용한 주 시료는 2016년 3월 18일에 농업 법인회사 (주)MG내츄럴(전남 담양군 무정면)에서 생산, 판 매된 것으로 동결 건조된 갈색거저리 유충을 구입하여 -20
°C 동결고에 저장하여 두고 실험에 사용하였다. Alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 단백질 분해 효소는 Novo사 제품을 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구 입하였다. 가수분해도 측정을 위해 사용된 2,4,6-trini- trobenzene sulfonic acid picrylsulfonic acid(TNBS)는 G-Biosciences Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였 으며, 특별한 언급이 없는 그 밖의 분석용 시약 및 유기용매 는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하 여 사용하였다.
갈색거저리 유충 단백질 가수분해물 제조
동결 건조된 갈색거저리 유충 분말을 10 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 4%(w/v)의 기질용
액으로 제조한 후, 90°C에서 20분 동안 항온수조 내에서 자가 효소를 불활성화하였다. 기질 대비 단백질 가수분해 효소(alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, pa- pain)를 각각 1%(w/w)가 되도록 첨가하여 55°C, 100 rpm 에서 0~24시간 동안 가수분해 하였고, 90°C에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화하였다. 방랭한 후 가수분해물을 13,000×g에서 20분 동안 원심분리 하여 상등액을 얻었으 며, 상등액은 저분자 펩타이드의 분리를 위해서 membrane filter(Amicon Ultra-15, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)를 이용하여 2시간 동안 원심분리 (5,000×g) 함으로써 최종적으로 분자량 3 kDa 이하의 단백 가수분해물을 얻었다. 단백가수분해물은 동결 건조한 후 -20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro- phoresis(SDS-PAGE)
각 효소별 갈색거저리 유충의 단백질 가수분해 특성을 확 인하기 위하여 SDS-PAGE를 이용하여 가수분해물의 단백 질 패턴을 측정하였다. SDS-PAGE는 15% gel을 사용하였 으며, 각 가수분해물은 3,000×g, 4°C, 10분 원심분리 후 얻은 상등액 20 μL를 gel에 loading 하여 80 V에서 약 2시 간 전기영동한 다음, coomassie brilliant blue를 사용하여 염색하고 10% acetic acid가 함유된 30% 메탄올을 이용하 여 탈색시켰다. 단백질 패턴의 분석은 Gel Logic 2200 PRO Imaging System(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA)을 이용하여 polyacrylamide gel을 스캐닝한 후 이미지로 영상화시켰다. 이때 molecular weight marker는 Bio-Rad Laboratories(Carlsbad, CA, USA)의 제품을 이 용하였다.
단백질의 가수분해도 측정
TNBS 방법(G-Biosciences Co.)을 이용하여 효소제 처 리 시간에 따른 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 가수분 해도를 측정하였다(22). 10 mM sodium bicarbonate(pH 8.5) 990 μL와 1% TNBS 10 μL를 혼합(v/v)하여 0.01%
TNBS를 제조하고, TNBS 50 μL와 시간별로 취한 반응혼합 액 100 μL를 섞어 37°C에서 2시간 반응시킨 후 반응을 정지 시키기 위해 10% SDS와 1 N hydrogen chloride(1 N HCl) 를 첨가시켰다. 그 후 microplate spectrophotometer(Bio Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 335 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성 측정
DPPH free 라디칼 소거 활성은 Ham 등(23)의 방법에 따라 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올을 이용하여 시료를 0, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL로 희석하 고 희석된 시료를 96 well plate에 160 μL씩 분주하였다.
다음 메탄올에 녹인 0.2 mM DPPH 용액 40 μL를 시료가
Fig. 1. Effect of five different proteases on SDS-PAGE profile of Tenebrio molitor larvae protein hydrolysates. SDS-PAGE pat- terns on 15% gel of Tenebrio molitor larvae hydrolysate. Lane [1], alcalase; Lane [2], bromelain; Lane [3], flavourzyme; Lane [4], neutrase; Lane [5], papain; Lane [6], no enzyme.
분주된 well에 분주하여 실온에 30분간 방치한 후 micro- plate spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도 로 측정하였다. 각각의 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분 해물의 흡광도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도 인 RC50값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위한 양성대 조군으로 Trolox를 사용하였다.
ABTS 라디칼 소거 활성 측정
ABTS 라디칼 소거 활성 실험은 Re 등(24)의 방법을 변형 하여 측정하였다. 최종 농도가 7 mM인 ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 각각 혼합한 후 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시킨 다음, ABTS 용액 의 농도는 사용하기 직전에 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±
0.02가 되도록 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4) 으로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 180 μL에 시료 20 μL를 가하여 1분 동안 30°C에 방치한 후 734 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 각각의 효소별 갈색거저리 유충 단백가수 분해물의 흡광도를 1/2로 환원시키는 데 필요한 시료의 농 도인 RC50값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위한 양성 대조군으로 Trolox를 사용하였다.
Hydrogen peroxide 소거 활성 측정
Hydrogen peroxide 소거 활성 측정은 Müller(25)의 방 법에 따라 증류수에 농도별로 희석한 시료 20 μL, PBS 100 μL, 1 mM H2O2 20 μL를 96-well plate에 가한 후 37°C incubator에서 5분간 반응시켰다. 이후 1.25 mM ABTS 30 μL와 1 U/mL peroxidase 30 μL를 가하고 37°C에서 10분 간 반응시킨 후 microplate spectrophotometer를 이용하 여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위 한 양성대조군으로 Trolox를 사용하였다.
Linoleic acid에 대한 산화방지 효과
Linoleic acid에 대한 산화 억제 효과를 확인하기 위해 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0) 2 mL와 2.52%
linoleic acid 1 mL, absolute alcohol 1 mL, 시료 1 mL를 혼합한 후 40°C에서 100 rpm으로 진탕하며 하루 간격으로 각 시료의 linoleic acid에 대한 산화 억제 효과를 측정하였 다. 20% trichloroacetic acid(TCA, w/v) 100 μL, 0.8%
thiobarbituric acid(TBA, w/v) 100 μL와 linoleic acid 반 응기질 용액 50 μL를 잘 혼합하여 95°C 이상에서 20분 반응 시킨 후, 실온에서 10분간 냉각시키고 3,000 rpm에서 15분 간 원심분리 하여 180 μL의 상등액을 흡광도 532 nm에서 측정하였다. 이때 활성 비교를 위한 양성대조군으로 Trolox 를 사용하였다.
통계분석
모든 데이터는 최소 3번 반복하여 평균과 표준오차(mean
±SE)로 나타내었으며, 통계분석에는 SPSS Statistics 23
(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용되었다. 또한, 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였으며, Duncan’s multiple range test 방법을 통한 사후 검증을 시행하였다. 유의확률(P-value)이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
결과 및 고찰
효소별 갈색거저리 유충의 단백질 가수분해물 제조 특성 Alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소별로 갈색거저리 유충 단백가수분해물을 제조하여 그 특성을 조사하였다. 24시간 반응시킨 각 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 특성을 확인하고자 SDS-PAGE를 실시하여 alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소에 대한 단백가수분해물의 SDS-PAGE 패턴을 Fig. 1에 나타내었다. 효소별 단백가수분해물을 비효소군과 비교한 결과, 비효소군보다 alcalase 단백가수분해물이 10 kDa 이하로 모두 분해되어 10 kDa 이상의 단백질은 거의 나타나지 않았으며, 저분자 펩타이드가 많고 가수분해도가 우수함을 확인하였다. Neutrase와 flavourzyme 단백가수 분해물은 alcalase 단백가수분해물보다 10 kDa 이상의 큰 분자량의 단백가수분해물이 다수 관찰되었다. 반면, bro- melain, papain 단백가수분해물에서는 10~25 kDa 사이의 단백질 띠가 선명하여 이 분자량 크기의 펩타이드를 많이 함유한 것을 확인하였다.
TNBS assay를 이용해 각 단백가수분해물의 가수분해도 를 그 지표로 사용되는 available amino group의 농도로 측정하였다. 단백질이 가수분해되면 가수분해도에 비례하 여 available amino group이 증가하므로 이는 펩타이드의 함량을 나타내는 지표가 될 수 있다. 각 효소를 이용하여
Fig. 2. Degree of hydrolysis of Tenebrio molitor larvae by five different proteases at 55°C. Each value is mean±SE (n≥3).
Table 1. Yields of protein hydrolysates (≤ 3 kDa) prepared from vacuum dried Tenebrio molitor larvae using different proteases
Enzymes Yields1) of protein hydrolysates (%) Alcalase
Flavourzyme Neutrase
42.05±2.66a2) 26.27±3.10b 30.01±4.32b
1)Yields (%)=[total solid content of protein hydrolysate－total solid content of blank (without substrate)]/total substrate con- tent×100.
2)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a,b) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Table 2. DPPH free radical scavenging activities of the hydro- lysates from Tenebrio molitor larvae with different proteases
Enzymes RC50 (μg/mL)1) TEAC (mg TE/g)2) Alcalase
Flavourzyme Neutrase
339.34±11.27b3) 379.35±12.88a 398.93±6.88a
7.81±0.09a 6.94±0.20b 6.58±0.06b
Trolox 2.65±0.34 －
1)Concentration required for 50% reduction of DPPH･ at 30 min after starting the reaction.
2)Trolox equivalent antioxidant capacity.
3)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a,b) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
시간에 따른 단백가수분해도를 알아보기 위해 효소별 단백 가수분해물의 펩타이드 함량을 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간별로 측정하였다(Fig. 2). 효소별 단백가수분해물을 이용하여 시간에 따른 분해능을 tyrosine의 함량으로 환산 한 결과, 24시간 반응 후 available amino group 농도는 alcalase, flavourzyme, neutrase가 각각 4,781.38 μg/mL, 5,429.35 μg/mL, 3,155.55 μg/mL로 측정되었다. Alcalase, flavourzyme, neutrase 단백가수분해물의 경우 가수분해 시간이 경과함에 따라 available amino group 농도가 0~6 시간 동안 급격히 증가하며 6시간 이후부터는 그 증가폭이 현저히 감소하였다. 하지만 bromelain, papain 단백가수분 해물은 SDS-PAGE 결과와 유사하게 24시간 처리에도 불구 하고 유의한 available amino group 함량의 증가를 보이지 않았다. 이를 종합해 볼 때 alcalase, flavourzyme 및 neu- trase에 대한 갈색거저리 유충의 단백질 가수분해는 6~8시 간이 경과하면서 가수분해가 충분히 이루어지며, 펩타이드 chain의 N-terminal을 분해하는 exo-peptidase인 fla- vourzyme을 처리했을 때 가장 많은 available amino group 이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
단백질 가수분해물의 경우 저분자량 펩타이드가 쉽게 체 내로 흡수되고 체내 이용률도 높다는 보고(22)에 따라 가수 분해가 활발히 일어났던 alcalase, flavourzyme, neutrase 가수분해물을 분자량 3 kDa 이하로 한외여과 한 후 동결 건조하여 실험에 이용하였다. 각 단백가수분해물의 저분자 펩타이드 생산 효율을 비교하기 위해 전체 기질의 고형분 함량에 대하여 3 kDa 이하로 분리한 후의 펩타이드의 무게 를 측정하였으며 그 수율을 비교하였다(Table 1). Alcalase 를 첨가한 단백가수분해물의 수율이 42.05%로 가장 높았으 며, neutrase 30.01%, flavourzyme 26.27% 순으로 나타 났다. 이상의 결과는 alcalase를 처리한 단백가수분해물이 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드를 가장 많이 함유하고 있다 는 것을 의미하며, neutrase와 flavourzyme을 처리한 가수
분해물이 alcalase 가수분해물보다 저분자 펩타이드 생산 효율이 상대적으로 떨어지는 것을 알 수 있다.
갈색거저리 유충 단백가수분해물의 활성산소종 소거 활성 DPPH 라디칼은 항산화 물질이 수소원자나 전자를 공여 할 수 있는 능력을 평가할 때 사용되는 물질로서 수소 혹은 전자를 받음으로써 안정한 형태의 화합물로 전환되어 라디 칼 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변한다(23). 이를 이용 하여 각 효소별 단백가수분해물의 DPPH 라디칼에 대한 소 거능을 측정해 Table 2에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성에 대한 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 영향을 50% 라디칼 저해율을 나타내는 RC50값으로 나타낸 결과 alcalase 단백가수분해물의 RC50값은 339.34 μg/mL, fla- vourzyme 379.35 μg/mL, neutrase 398.93 μg/mL로 나타 나 alcalase 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 높았다(Table 2).
ABTS 라디칼 소거 활성법은 표준물질인 Trolox의 값과 비교하여 나타낼 수 있으며, in vivo에서의 항산화능 측정뿐 만 아니라 in vitro에서도 항산화능을 측정하기 위한 방법으 로 널리 이용되고 있다(24). ABTS와 potassium persul- fate를 암소에 방치하면 생성되는 ABTS 라디칼은 시료 속 항산화 물질로 인해 라디칼이 소거되면 짙은 청록색의 ABTS 라디칼이 탈색되는데 이를 흡광도로 측정하는 방법 이다. ABTS 라디칼 소거 활성에 대한 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 영향을 RC50값으로 나타내었다(Table 3).
Table 3. ABTS+ free radical scavenging activities of the hydro- lysates from Tenebrio molitor larvae with different proteases
Enzymes RC50 (μg/mL)1) TEAC (mg TE/g)2) Alcalase
Flavourzyme Neutrase
36.90±0.83b3) 56.03±0.78a 29.84±0.33c
108.90±1.21b 85.28±0.98a 141.86±2.34c
Trolox 5.03±0.06 －
1)Concentration required for 50% reduction of ABTS+⦁ at 3 min after starting the reaction.
2)Trolox equivalent antioxidant capacity.
3)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Table 4. Hydrogen peroxide radical scavenging activities of the hydrolysates from Tenebrio molitor larvae with different pro- teases
Enzymes RC50 (μg/mL)1) TEAC (mg TE/g)2) Alcalase
Flavourzyme Neutrase
65.97±1.51b3) 121.67±3.30a 70.38±1.74b
78.43±1.90c 46.87±1.62a 68.26±1.08b
Trolox 17.32±0.07 －
1)Concentration required for 50% reduction of ABTS+⦁ at 5 min after starting the reaction.
2)Trolox equivalent antioxidant capacity.
3)Each value is mean±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Neutrase 처리를 통해 얻은 단백가수분해물의 RC50값은 29.84 μg/mL였고, alcalase, flavourzyme 단백가수분해물 의 ABTS 라디칼에 대한 RC50값은 각각 36.90 μg/mL, 56.03 μg/mL로 나타나 neutrase 단백가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 활성이 가장 높음을 확인할 수 있었다.
산소의 환원 대사물질인 hydrogen peroxide는 다양한 외부요소나 정상세포의 mitochondria와 peroxisome에서 형성되는데 DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 불포화지방 산과 같은 생체막의 구성성분을 공격하여 과산화지질을 생 성함으로써 생체 기능의 저하나 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다(26,27). 본 연구에서는 peroxidase의 기질인 ABTS를 이용하여 갈색거저리 유충 단백가수분해물 의 H2O2 소거 활성을 측정하였다. 갈색거저리 유충 단백가 수분해물의 H2O2 소거 활성을 RC50값으로 나타낸 결과를 Table 4에 나타내었다. 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분 해물에 따른 H2O2 소거능을 측정한 결과, alcalase 단백가 수분해물의 RC50값은 65.97 μg/mL였으며, flavourzyme 121.67 μg/mL 및 neutrase 70.38 μg/mL로 나타났다. 이상 의 결과에서 alcalase 가수분해물은 DPPH 라디칼 소거능 에서 RC50값이 339.34 μg/mL로 가장 효과가 좋았으며(P<
0.05), neutrase 가수분해물은 ABTS 라디칼 저해 활성에 서 RC50값이 29.84 μg/mL로 가장 효과가 좋았다(P<0.05).
이는 효소별 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 DPPH 라 디칼 소거능과 ABTS 라디칼 저해 활성은 저분자 펩타이드
의 농도와 상관관계가 없다는 것을 의미하며, Yu 등(28)의 보고처럼 단백질의 가수분해 펩타이드의 항산화 활성은 항 산화 활성 측정법에 따라 차이가 있고, 가수분해 효소의 기 질 특이성에 따라 생성되는 아미노산 배열 및 아미노산 조성 의 영향을 받는 것으로 판단된다.
Kim 등(29)의 보고에 따르면 굴 가수분해물의 1~3 kDa 의 분획물이 DPPH 라디칼 소거능에서 IC50값이 6.4 mg/
mL, ABTS 라디칼 저해 활성에서 IC50값이 4.2 mg/mL로 나타나, 이와 비교할 때 갈색거저리 유충 단백가수분해물이 우수한 것을 알 수 있다. Yoon 등(30)의 연구에 따르면 청동 풍뎅이 유충의 에탄올 추출물의 RC50값이 483.39 μg/mL로 나타나 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 상대적으로 우수한 것을 알 수 있었다. Yu 등 (28)이 누에번데기에 neutrase, alcalase, trypsin 및 pep- sin을 처리하여 제조한 단백가수분해물의 DPPH 라디칼 소 거 활성을 확인한 결과, alcalase 단백가수분해물의 RC50값 이 396.09 μg/mL였고, neutrase 단백가수분해물이 352.75 μg/mL, trypsin 677.44 μg/mL, pepsin 626.09 μg/mL로 나타났다. Alcalase 및 neutrase 처리 누에번데기 단백가수 분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 갈색거저리 유충 단백 가수분해물과 유사한 경향을 보였으나, trypsin, pepsin의 경우 소거 활성이 다소 낮은 경향을 보였다.
폴리페놀 성분이 함유되어 있는 식물성 시료에서 ABTS 라디칼 및 H2O2 소거능을 측정한 Lee 등(31)의 연구 결과에 따르면 80% 메탄올 아보카도의 과육 추출물은 200 μg/mL 에서 38.4%로 나타났고, 본 연구에서 사용한 갈색거저리 유충 alcalase 단백가수분해물은 50 μg/mL에서 69.80%, flavourzyme은 49.38% 및 neutrase는 71.41%로 ABTS 라디칼 소거 활성능이 우수한 것으로 나타났다(data not shown). Hwang과 Nhuan(32)은 아로니아 추출물의 H2O2 소거능을 RC50값으로 나타낸 결과 172.05 μg/mL로 확인되 어 천연물인 아로니아 추출물보다 갈색거저리 유충 단백가 수분해물의 H2O2 소거능이 우수한 것으로 나타났다.
Linoleic acid의 산화 억제 활성
지질산화 초기에 발생되는 과산화물은 ferrous chloride 와 반응하여 빨간색에 가까운 ferric chloride 색소를 생성 하게 되며, 지질산화가 계속 진행되면 malonaldehyde와 같 은 저분자의 화합물이 생성되는데 이것은 TBA와 결합하여 빨간색의 화합물을 형성한다(33). 따라서 본 실험에서는 불 포화지방산인 linoleic acid를 기질로 하여 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 산화방지 효과를 평가하였다.
상기 3가지 항산화 실험과 3 kDa 이하의 저분자 펩타이 드의 생산 수율 결과를 종합해 보았을 때 3종의 갈색거저리 유충 단백가수분해물 중 항산화 활성이 상대적으로 높았으 며, 3 kDa 이하 저분자 펩타이드의 생산이 42.05%로 가장 높았던 alcalase 단백가수분해물을 이용하여 100~800 μg/
mL의 농도로 지질과산화물의 산화 억제 활성을 시간별로
Fig. 3. Inhibitory effects of the alcalase hydrolysates from Tenebrio molitor larvae on linoleic acid peroxidation. Each value is mean
±SE (n≥3) and different superscripts (a-c) at the same day are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
측정하여 Fig. 3에 표시하였다. 시간이 지날수록 음성대조 구의 지질과산화물이 증가하였으며, 음성 대조구의 3일째 흡광도 값을 100%로 봤을 때 alcalase 단백가수분해물은 100, 200, 400, 800 μg/mL의 농도에서 농도가 높아짐에 따라 지질과산화물이 각각 27, 33, 40, 68%로 유의적으로 산화가 억제됨을 확인하였다. Kim 등(34)의 연구에 의하면 대구의 고니 단백질을 각 효소별로 처리하여 얻은 가수분해 물의 linoleic acid에 대한 항산화 활성을 살펴보면 alcalase 처리 가수분해물에서 지질과산화 억제 활성이 가장 높게 나 타났으며, 이는 시판 천연항산화제인 α-tocopherol보다 약 5% 정도 활성이 높게 나타난 것이라 보고하였다. 그러나 pronase E와 papain 처리 가수분해물에서는 천연항산화제 보다 아주 낮은 활성을 보였으며, 이러한 결과는 N말단 및 C말단에 위치하는 아미노산의 종류가 달라지므로 항산화 활성이 다르게 나타나는 것으로 보고하였다.
이상의 결과들을 토대로 alcalase, flavourzyme 및 neu- trase 효소를 처리한 갈색거저리 유충 단백가수분해물의 항 산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능에서는 alcalase 단백가 수분해물이 가장 높았으며 ABTS 라디칼 소거능은 neu- trase 단백가수분해물이 가장 높게 나타나 상대적으로 우수 한 항산화 활성을 가지는 것을 알 수 있다. 본 연구에서는 저분자 펩타이드 생산을 목적으로 3 kDa 이하의 저분자 펩 타이드의 수율이 42.05%로 가장 높았던 alcalase 가수분해 물을 이용하였으나 항산화 활성 평가 결과에 따라 flavour- zyme 및 neutrase 단백가수분해물도 새로운 기능성 식품 및 소재 개발 등에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 특히 성공적인 기능성 소재 개발을 위해서는 갈색거저리 유충 단 백가수분해물로부터 항산화 펩타이드의 구조 규명과 더불 어 구성 아미노산의 종류 및 길이와 항산화 활성과의 상관성 에 대한 규명이 추가되어야 할 것이다.
요 약
갈색거저리유충 분말을 4%(w/v)의 기질용액으로 제조한 후, 기질대비 단백질 가수분해 효소(alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, papain)를 각 1%(w/w) 첨가하여 갈 색거저리 유충 단백가수분해물을 제조하였다. 24시간 반응 시킨 각 효소별 가수분해물의 특성을 SDS-PAGE로 확인한 결과 alcalase 단백가수분해물의 가수분해가 우수함을 확인 하였으며, available amino group의 농도는 flavourzyme, alcalase, neutrase 단백가수분해물 각각 5,429.35 μg/mL, 4,781.39 μg/mL, 3,155.55 μg/mL의 값을 나타내 상대적으 로 높은 가수분해도를 보였고, bromelain(1,800 μg/mL)과 papain(1,782.61 μg/mL)의 경우 상당히 낮은 값을 보였다.
가수분해도가 높게 나타난 3종의 단백가수분해물을 한외여 과막을 통해 분자량이 3 kDa 이하로 분리한 후 동결 건조하 였으며, 이 동결건조물을 이용하여 항산화 실험을 수행하였 다. 갈색거저리 유충 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 은 alcalase 단백가수분해물의 RC50값이 339.34 μg/mL로 나타났고, flavourzyme 가수분해물 379.35 μg/mL, neu- trase 가수분해물 398.93 μg/mL로 나타났으며, ABTS 라 디칼 소거 활성은 neutrase 단백가수분해물의 RC50값이 29.84 μg/mL였고, alcalase 36.90 μg/mL 및 flavourzyme 56.03 μg/mL 순으로 나타났다. Hydrogen peroxide 소거 활성은 alcalase 단백가수분해물의 RC50값이 65.97 μg/mL 였고, flavourzyme 121.67 μg/mL 및 neutrase 70.38 μg/
mL의 값을 보였다. 상기 3가지 항산화 실험에서 우수한 항 산화 활성을 보이며, 저분자 펩타이드 생산 효율이 가장 높 았던(42.05%) alcalase 단백가수분해물을 이용해 linoleic acid에 대한 지질과산화 억제 활성을 측정한 결과, 6일 동안 100~800 μg/mL의 농도에서 처리 농도에 의존적으로 유의 적인 항산화능을 보였다.
감사의 글
본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호: PJ012284 012016)의 지원에 의해 이루어진 것임.
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